Artículo de investigación
CD44 facilita la patogénesis de la enfermedad al orquestar cascadas inflamatorias y diferenciación osteoclástica a través de la activación de la vía PI3K / Akt. La gliciteína ejerce efectos terapéuticos sobre las manifestaciones comórbidas de osteoporosis (OP) + periodontitis (EP) a través de la atenuación dirigida de la señalización mediada por CD44.
Esta investigación dilucida los determinantes moleculares críticos asociados con la comorbilidad de la osteoporosis (OP) y la periodontitis (DP) a través del perfil proteómico, al tiempo que delinea la función reguladora de CD44 en la periodontitis experimental en un modelo murino OP. La fase I consistió en la recolección de muestras de suero de pacientes con OP+PD (n = 3) y controles sanos (n = 6) sometidos a evaluaciones de salud de rutina en nuestra institución para análisis proteómico comparativo. La validación traslacional posterior de genes expresados diferencialmente (DEG) y cascadas de señalización asociadas se llevó a cabo en muestras clínicas y modelos murinos OP + PD. Para caracterizar mecánicamente el papel de CD44 en la progresión de la EP en condiciones osteoporóticas, se generó un modelo murino de OP mediante ovariectomía bilateral, seguido de inducción experimental de la EP mediante la colocación de ligaduras. Las evaluaciones integrales incluyeron alteraciones histomorfométricas mediante tinción de hematoxilina-eosina, análisis óseo microarquitectónico en la región del primer molar maxilar mediante micro-CT y evaluación de inmunotransferencia de los componentes de la vía fosfoinositida-3-quinasa (PI3K)/Akt. Se ejecutó un cribado farmacológico de red paralela junto con simulaciones de acoplamiento molecular para identificar los componentes bioactivos de Angelica sinensis con potencial terapéutico. El interrogatorio proteómico identificó CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP y VWF como mediadores patogénicos candidatos en la patogénesis de OP+PD. En nuestras manos, el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes reveló que la señalización de PI3K / Akt funciona como un mediador principal de la progresión de la enfermedad OP + PD. La validación cuantitativa basada en PCR de transcripción inversa confirmó una regulación positiva significativa de CD44 en cohortes de OP + PD clínicas y experimentales. La modulación in vivo a través de la supresión de CD44 restauró significativamente la integridad del tejido periodontal, redujo la infiltración de células inflamatorias y fortaleció la microarquitectura ósea alveolar en ratones OP, concomitante con la inhibición de la vía PI3K / Akt. La farmacología de la red reveló que la gliciteína es el principal fitoquímico bioactivo en Angelica sinensis, con CD44 identificado como su objetivo molecular central. La gliciteína mejoró la estructura ósea alveolar en ratones OP + PD, aumentando la fracción de volumen óseo (BV / TV), el grosor trabecular (Tb.Th), la densidad mineral ósea (DMO) y reduciendo el número trabecular (Tb.N), la relación superficie ósea a volumen óseo (BS / BV), lo que indica una calidad ósea más saludable, atribuida mecánicamente a la atenuación del eje de señalización CD44.
La periodontitis (EP) es una enfermedad microbiana mixta compleja causada por el depósito de biopelículas patológicas en el surco gingival1. Se caracteriza por un desequilibrio en el entorno microecológico que desencadena una cascada inflamatoria patológica dentro del huésped, lo que finalmente conduce a un daño progresivo irreversible en el cemento, el ligamento periodontal y el hueso alveolar, que son componentes del sistema de unión periodontal. Esto puede resultar en aflojamiento o incluso pérdidade dientes 2. La cantidad se estandarizó para su comparabilidad, y los datos epidemiológicos más recientes3 indican que más de 1.066 millones de personas en todo el mundo sufren de periodontitis grave, con una prevalencia estandarizada por edad de aproximadamente el 12,5%, lo que destaca una variación considerable entre las poblaciones internacionales.
La osteoporosis (OP), una enfermedad ósea sistémica, se caracteriza por una degradación sustancial de la microestructura ósea y una pérdida sistemática de masa ósea 4,5. El riesgo de fracturas aumenta considerablemente por esta debilidad estructural, especialmente en las personas mayores. En particular, las personas de 65 años o más en Japón tenían una mayor prevalencia de enfermedad periodontal que los adultos entre 30 y 64 años. Las mujeres posmenopáusicas tienen una mayor incidencia de enfermedad periodontal y, a menudo, experimentan otros problemas de salud 6,7. El estudio predice que de 2005 a 2025, la carga de la enfermedad aumentará en más del 50%, y se espera que el costo económico aumente de $ 17 mil millones a $ 25 mil millones. El estudio predice que de 2005 a 2025, la carga de la enfermedad aumentará en más del 50%, y se espera que el costo económico aumente de $ 17 mil millones a $ 25 mil millones. Esta tendencia pone de manifiesto el importante impacto socioeconómico de estas enfermedades periodontales. Además, en pacientes femeninas con enfermedad periodontal y gingivitis, existe una clara correlación positiva entre la duración de la enfermedad y su cronicidad y el aumento de los riesgos para la salud8.
Estudios previos indicaron que la OP podría promover el desarrollo de la EP y viceversa debido a factores de riesgo comunes para ambas enfermedades, como el envejecimiento, el tabaquismo y la ingesta inadecuada de calcio y vitamina D. En la población femenina posmenopáusica, la OP severa podría ir acompañada de un contenido mineral mandibular reducido, lo que podría estar asociado con niveles deficientes de inserción periodontal9. Se ha demostrado que la densidad ósea reducida asociada a OP podría acelerar la reabsorción ósea alveolar inducida por la EP, favoreciendo así la invasión de patógenos periodontales10. Entre una variedad de desafíos de salud relacionados con la edad y el cambio fisiológico, la EP y la OP son particularmente prominentes con la aceleración del envejecimiento de la población mundial y el aumento significativo en el número de mujeres menopáusicas. Por lo tanto, aclarar los indicadores relevantes y sus asociaciones es de crucial importancia para la prevención de enfermedades, el tratamiento y la evaluación del pronóstico. Motivado por estos aspectos, este estudio utilizó la proteómica para examinar proteínas clave, con énfasis en la señalización PI3K / Akt mediada por CD44, en el desarrollo de OP + PD, explorando las funciones reguladoras y los posibles mecanismos de proteínas clave utilizando un modelo experimental de PD en ratones OP. Detección adicional de agentes terapéuticos dirigidos presentes en Angelica sinensis, una hierba medicinal tradicional china ampliamente utilizada en la práctica clínica por sus propiedades antiinflamatorias y protectoras de los huesos, y que se informó anteriormente que alivia la pérdida ósea y modula las respuestas inflamatorias en la osteoporosis y la enfermedad periodontal. Guiada por la farmacología de red y el acoplamiento molecular, la glicitaína se identificó como el fitoquímico bioactivo primario y un candidato racional para la intervención de OP+PD.
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Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El protocolo del estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética Animal. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
Este estudio tiene como objetivo evaluar el papel de la regulación mediada por CD44 de la vía PI3K/Akt en la diferenciación osteoclástica y la progresión inflamatoria durante la osteoporosis comórbida y la periodontitis (OP+PD) y determinar si la gliciteína, un compuesto bioactivo de Angelica sinensis, puede modular terapéuticamente estos efectos. La justificación se deriva de la evidencia emergente que vincula la sobreexpresión de CD44 con la reabsorción ósea patológica y la desregulación inmune en OP + PD 11,12,13. Al integrar proteómica, modelado in vivo y farmacología en red, el protocolo investiga sistemáticamente los mecanismos moleculares y las intervenciones terapéuticas para mitigar la progresión de la enfermedad14.
El tamaño de la muestra para los experimentos in vivo se basó en estudios previos y análisis de potencia, lo que resultó en n = 6 por grupo, lo que garantiza una potencia estadística adecuada para detectar diferencias significativas (P < 0,05) en las condiciones de tratamiento. La gliciteína se administró en dosis de 50 mg / kg y 100 mg / kg, suspendida en DMSO al 5% en aceite de oliva y administrada por sonda oral diaria. Los ratones fueron monitoreados durante 8 semanas después de la inducción de la EP. La colocación de ligaduras para inducir la inflamación periodontal utilizó hilo de seda 5-0 y la ovariectomía bilateral se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico al 0,3% (0,5 ml / 100 g)15. Además, se realizaron ensayos moleculares, incluyendo RT-qPCR, western blot y ELISA, utilizando protocolos validados16, y las evaluaciones histológicas, como la hematoxilina-eosina (H&E) y la tinción con azul de metileno, siguieron los plazos y las duraciones de tinción establecidos.
Todos los procedimientos experimentales que involucran reactivos químicos, agentes de tinción y muestras biológicas se llevaron a cabo siguiendo protocolos estándar de bioseguridad para minimizar los riesgos para la salud. Los materiales peligrosos como formalina, EDTA, azul de metileno y fucsina ácida se manipularon con equipo de protección personal (EPP), incluidos guantes, máscaras y gafas de seguridad. Todos los materiales de desecho, incluidos los reactivos usados y los desechables contaminados, se recolectaron en contenedores designados para riesgos biológicos y se eliminaron a través de servicios certificados de eliminación de desechos peligrosos según las pautas de seguridad institucionales y ambientales. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo experimental general.
Recopilación de datos clínicos
En nuestro estudio, recopilamos sistemáticamente y analizamos exhaustivamente los datos clínicos basales y las historias clínicas detalladas de tres pacientes con OP+PD y seis sujetos de control, incluidos los factores demográficos y de estilo de vida, así como los perfiles anatómicos y metastásicos. Además, se realizó una confirmación rigurosa del resultado de la prueba de infección por VPH (positivo o negativo). Se registró en detalle el estadio de progresión o el patrón de recurrencia de las lesiones metastásicas. Durante los primeros 7 días de inmunoterapia, se recolectaron y estandarizaron sistemáticamente muestras de sangre de los pacientes, incluidos indicadores bioquímicos como pruebas de rutina de sangre. Los análisis de sangre de rutina se realizaron en estricta conformidad con los procedimientos estándar para evaluar con precisión parámetros clave como plaquetas, linfocitos y neutrófilos. La albúmina sérica se midió en paralelo y la función hepática se evaluó mediante un análisis cuantitativo del índice de concentración de globulina.
Pacientes
Evaluación de la densidad mineral ósea y estratificación de los participantes
Realizamos una comparación sistemática de las mediciones de densidad ósea en la región lumbar y el cuello femoral. Todos los exámenes fueron realizados por radiólogos experimentados en nuestro departamento, utilizando equipos de precisión para cuantificar con precisión los valores de densidad ósea. Para garantizar la recolección estandarizada de muestras, se requirió que los participantes ayunaran durante al menos 8 h antes del muestreo. Al integrar los datos de densidad ósea con los datos completos de evaluación periodontal, clasificamos estrictamente a los sujetos en el grupo de osteoporosis con periodontitis (OP + PD) o en el grupo de control sano (HC), asegurando que la proporción de sexos coincidiera perfectamente entre los dos grupos. El emparejamiento por sexo se refiere a la distribución equitativa de las hembras entre los grupos OP+PD y control sanos. Sin embargo, solo se incluyeron participantes femeninas en este estudio para centrarse en la osteoporosis posmenopáusica; no había sujetos masculinos en ninguno de los grupos. El estudio se adhirió a las pautas éticas de la Declaración de Helsinki, y todos los participantes firmaron formularios formales de consentimiento informado, protegiendo plenamente sus derechos.
Parámetros diagnósticos
La osteoporosis se definió según las Guías chinas para el diagnóstico y el tratamiento de la osteoporosis primaria (2022)17, con umbrales diagnósticos establecidos en la puntuación T ≤ -2,5 desviaciones estándar (DE) para la DMO lumbar (L1-L4) o de cadera. La estadificación de la periodontitis siguió la Clasificación Mundial de Enfermedades Periodontales del Taller 201818, con inclusión restringida a casos de grado A, estadio II-III. Criterios de inclusión: Mujeres posmenopáusicas de 50 a 65 años, diagnóstico dual de OP y EP que cumplan con los criterios anteriores, ausencia de trastornos autoinmunes, sin antecedentes de neoplasias malignas, función cardiopulmonar, hepática y renal normal. Criterios de exclusión: Disminución de la participación del paciente o de la familia, farmacoterapia reciente (≤6 meses) para OP o EP.
Perfil proteómico de muestras de suero
Se recolectaron muestras de suero de tres pacientes con OP + PD y seis sujetos de control para análisis proteómico. La cuantificación relativa de proteínas se logró mediante procedimientos estándar, y las proteínas expresadas diferencialmente se definieron como aquellas con P < 0,05 y cambio de pliegue > 1,519.
Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)
Se utilizó GSEA para identificar vías de señalización clave desreguladas entre las cohortes de control y OP + PD. Los datos transcriptómicos sin procesar se transformaron primero mediante la conversión log2 y se normalizaron mediante normalización de cuantiles para eliminar los efectos por lotes. Los conjuntos de genes con múltiples funciones biológicas se examinaron de la Base de Datos de Firmas Moleculares (MSigDB) y la significación estadística se evaluó mediante la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon. Los resultados del enriquecimiento se informaron utilizando puntajes de enriquecimiento normalizados y tasas de descubrimiento falso (FDR < 0,25).
Análisis ponderado de redes de coexpresión génica (WGCNA)
Se utilizó WGCNA para identificar módulos genéticos significativamente asociados con fenotipos OP+PD. Se seleccionó una potencia de umbral suave de 12 para lograr una topología de red sin escala (R2 > 0,85), y se utilizó el análisis de correlación de Pearson para evaluar las relaciones entre los genes propios del módulo y los rasgos clínicos. Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional para descubrir vías biológicas relevantes en módulos fuertemente correlacionados.
Establecimiento de modelos murinos osteoporóticos inducidos por ovariectomía
Este estudio involucró a 116 ratones hembra de grado SPF. Antes de los experimentos, los animales se alojaron en condiciones controladas de temperatura y humedad durante una fase de adaptación de 7 días, durante la cual se les administró comida estandarizada para roedores y agua destilada. Todos los procedimientos de manejo de animales siguieron estrictamente los protocolos éticos aprobados por el Comité de Ética del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Xi'an Jiaotong, bajo la identificación de aprobación 0609. El estudio se registró con el número de proyecto [2024-054].
Protocolo quirúrgico de ooforectomía bilateral (OVX):
Los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 0,3% (0,5 mL/100 g de peso corporal). El pelaje dorsal se depiló quirúrgicamente y los animales se colocaron en decúbito dorsal en una plataforma quirúrgica estéril y calentada. Después de la preparación aséptica con etanol al 75%, se realizaron incisiones paravertebrales bilaterales (1 cm lateral a la columna vertebral) a nivel de las almohadillas de grasa renal. La bolsa ovárica se exteriorizó y el oviducto se ligó proximal al ovario mediante suturas de seda 5-0, seguido de la escisión de ovarios bilaterales, tejido adiposo asociado y estructuras oviductales parciales. Las capas musculofasciales y cutáneas se cerraron secuencialmente con suturas absorbibles 4-0. La antisepsia postoperatoria se realizó con etanol al 75%.
La cirugía simulada controla:
Los ratones operados de forma simulada se sometieron a pasos de procedimiento idénticos, incluida la exposición ovárica y la resección del tejido adiposo periovárico, sin extirpación ovárica.
Manejo postoperatorio:
La recuperación postanestésica se facilitó utilizando almohadillas de calentamiento de agua circulante hasta la deambulación completa. La analgesia se mantuvo mediante la administración subcutánea de carprofeno (5 mg/kg diarios) durante 72 h postoperatorios, suplementada con penicilina G profiláctica (50.000 UI/kg) durante 48 h para prevenir infecciones del sitio quirúrgico. La masa corporal se controló semanalmente durante la fase de modelado osteoporótico de 6 semanas, con criterios de exclusión aplicados a animales que presentaban una pérdida de peso del >20% o sufrimiento clínico.
Construcción de un modelo animal experimental OP+PD
El modelo experimental de DP se desarrolló sobre la base del modelo animal de OP previamente establecido. Para evitar la rotura del hilo y asegurar una inserción suave entre los molares, se utilizó sutura de seda 5-0 para la ligadura. Durante el procedimiento, la comisura de la boca del ratón se retrajo suavemente, y el hilo se agarró con fórceps y se colocó cuidadosamente en la región cervical entre el primer y el segundo molar. El alambre y la punta de las pinzas se mantuvieron nivelados para minimizar el trauma en la mucosa bucal, reduciendo así el riesgo de sangrado o mortalidad. La otra mano tiró suavemente del extremo opuesto del alambre, guiándolo gradualmente hacia el espacio interproximal entre los molares. Una vez que el hilo estaba correctamente colocado, se sujetaba una sección cerca del lado bucal con fórceps y se pasaba cuidadosamente entre el segundo y tercer molar utilizando la misma técnica. La suave tracción hacia abajo aseguró un paso suave de la seda. Finalmente, el hilo se ató de forma segura alrededor del segundo molar en la región cervical media. Posteriormente, se permitió que los ratones se recuperaran.
Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-qPCR)
La Tabla de materiales enumera secuencias de cebadores directas e inversas específicas para RT-qPCR dirigidas a genes relacionados con la inflamación, la coagulación y la adhesión celular, incluidos CD44, CDH13, VWF y GAPDH. Las secuencias de cebadores utilizadas para el análisis de RT-qPCR se resumen en la Tabla 1.
Análisis de Western blot
Las características de expresión de las proteínas clave de la vía de señalización en los tejidos periodontales se estudiaron sistemáticamente mediante western blotting. Los tejidos periodontales se sometieron a homogeneización por congelación-descongelación utilizando tampón RIPA, que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa, para extraer eficientemente la proteína total. Después de la centrifugación a alta velocidad (12.000 × g, 4 °C, 10 min) para separar el lisado, el sobrenadante se utilizó para medir con precisión la concentración de proteínas con un kit de BCA, proporcionando datos fiables para experimentos posteriores.
Para cada grupo experimental, se cargaron y separaron 30 μg de proteína total a través de un sistema SDS-PAGE al 10%. Las proteínas resueltas se transfirieron a membranas de PVDF mediante un método de transferencia semiseco. Para minimizar la interferencia de fondo, las membranas se bloquearon con leche en polvo descremada al 5% durante h a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se mantuvieron a 4 °C en un entorno estable para su posterior procesamiento.
Luego, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios específicos (ver Tabla de materiales) durante 2 h a ° C. Al día siguiente, se utilizó tampón TBST para un lavado a fondo, y las membranas se trataron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP en una dilución de 1:10.000 durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Todos los pasos de inmunodetección se realizaron en estricta conformidad con protocolos estandarizados para garantizar la consistencia y validez del análisis de la vía de señalización20.
Mediante el uso de sustratos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para capturar señales y equipos de imágenes de alta resolución para localizar con precisión las bandas de proteínas, los valores de densidad óptica de las bandas se analizaron cuantitativamente utilizando el software ImageJ. En última instancia, al comparar sistemáticamente los niveles de expresión relativa de proteínas diana / β-actina en cada grupo con el grupo de control, se evaluaron con precisión el grado de activación y los cambios dinámicos de la vía PI3K / Akt bajo diferentes intervenciones.
Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
Utilizando kits ELISA (ver Tabla de materiales), este estudio logró una cuantificación precisa de varias citocinas inflamatorias, incluidas TNF-α, IL-6, IL-1β e IL-4, en muestras de suero. También evaluó las concentraciones de TRAP5b, ALP y TGF-β como marcadores de actividad osteoclástica. Se incubó una placa de 96 pocillos prerecubierta con anticuerpos de captura a 25 °C con muestras de suero diluidas 1:10 en PBS durante 2 h, lo que permitió que los antígenos se unieran específicamente a los anticuerpos de captura inmovilizados. Después de la incubación, las sustancias no unidas se eliminaron mediante tres lavados con PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con Tween-20). Posteriormente, se agregaron anticuerpos de detección marcados con biotina y se incubaron durante 1 hora a la misma temperatura. A continuación, se introdujo estreptavidina-HRP para unirse a los anticuerpos biotinilados y la mezcla se incubó durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente en condiciones protegidas de la luz. Luego, la reacción enzimática se terminó con la solución de parada y se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas para determinar las concentraciones de citoquinas.
Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
Se utilizaron métodos estándar para realizar la tinción de H&E en secciones de tejido periodontal incluidas en parafina para analizar los cambios microestructurales. El proceso de preparación de la muestra implicó la fijación inicial en una solución de paraformaldehído al 4% durante 24 h, seguida de la deshidratación graduada con etanol (70%, 80%, 95% y 100%) y la aclaración en xileno, y finalmente la inclusión en parafina para producir secciones de 4 μm de espesor21. Después del desparafinado en xileno, las muestras se rehidrataron a través de concentraciones descendentes de etanol (100% a 70%). El proceso de tinción comenzó con una inmersión de 5 min en hematoxilina (de Meisner), seguida de enjuague con agua corriente, diferenciación en alcohol ácido al 1% en etanol y otro enjuague. Luego, las secciones se tiñeron con eosina al 0,5% durante 10 s para completar el protocolo.
Después de la tinción, los portaobjetos se deshidrataron nuevamente en una serie de etanol graduado, se aclararon en xileno y se sellaron con medio de montaje. Las observaciones se realizaron bajo un microscopio equipado con objetivos de 10x y 40x para la adquisición de imágenes de alta resolución. El análisis histológico evaluó la integridad estructural del tejido conectivo periodontal, la infiltración de células inflamatorias y la morfología de la reabsorción ósea alveolar. El nivel de inflamación se puntuó utilizando un índice de Loe-Silness mejorado, con dos patólogos cegados a la identidad de la muestra evaluando independientemente las muestras a través de una escala semicuantitativa para garantizar la objetividad y la reproducibilidad22.
Tinción con azul de metileno
Este estudio empleó el método de tinción con azul de metileno en secciones de hueso alveolar maxilar estandarizadas y procesadas para cuantificar el grado de reabsorción ósea. El procedimiento experimental comenzó con la fijación tisular: los tejidos periodontales se fijaron en una solución de formalina neutra al 10% durante 24 h, seguido de un tratamiento de descalcificación de 21 días en solución de EDTA al 10% (pH 7,4). Después de la descalcificación, las muestras se incluyeron en parafina y se prepararon en secciones de tejido de 4 μm de espesor, que luego se montaron en portaobjetos silanizados. El proceso de pretratamiento de la sección incluyó desparafinado de xileno, hidratación con etanol en gradiente e incubación en un baño de agua a 60 °C. Luego, los portaobjetos se tiñeron con una solución de azul de metileno al 0,1% durante 15 min.
Después de la tinción, las secciones se lavaron durante 1 minuto con agua destilada que se había precalentado a 60 °C, lo que garantiza una eliminación eficaz del exceso de tinte sin dañar la estructura del tejido. Luego se contratiñeron con fucsina ácida al 0,1% durante 5 min para mejorar el contraste entre las estructuras tisulares. Este protocolo de tinción proporcionó una visualización consistente y confiable para el análisis cuantitativo de la reabsorción ósea alveolar23. Finalmente, los portaobjetos se deshidrataron con etanol graduado, se limpiaron en xileno y se montaron. El tejido óseo teñido se analizó bajo un microscopio de campo de luz y se adquirieron imágenes de alta resolución para evaluar con precisión la reabsorción del borde óseo alveolar para su posterior evaluación morfológica.
Análisis de microtomografía computarizada (Micro-CT)
Se realizó una exploración por micro-TC para evaluar los cambios microestructurales 3D en el hueso alveolar de ratones modelo OP + PD, dirigidos específicamente a la región maxilar del primer molar. Después de 8 semanas de monitoreo postoperatorio, los ratones fueron sacrificados humanamente mediante inhalación de CO2 , un método adecuado para preservar las estructuras maxilofaciales. Luego se recolectaron muestras maxilares y se fijaron en paraformaldehído al 4% a 4 °C durante 48 h24.
El análisis de micro-CT se realizó con las imágenes DICOM reconstruidas de la región maxilar importadas al software seleccionando el conjunto de datos correspondiente a las muestras escaneadas. Una región de interés estándar (ROI) se definió manualmente como la porción bucal mesial de un tercio de la raíz del primer molar maxilar delineando la estructura ósea alveolar en las vistas sagital y coronal, y generalmente se incluyeron aproximadamente 50 cortes consecutivos para cubrir completamente la región.
Para separar el hueso trabecular del tejido blando circundante y el fondo, se aplicó un umbral de densidad de 180-220 mgHA/cm3 . Luego se realizó la segmentación para generar una estructura binaria que representa solo el hueso trabecular. El análisis morfométrico se llevó a cabo utilizando el módulo de morfometría ósea dentro del software. Los parámetros se calcularon automáticamente, incluida la fracción de volumen óseo (BV / TV), el grosor trabecular (Tb.Th), el número trabecular (Tb.N), la relación superficie ósea a volumen óseo (BS / BV) y la densidad mineral ósea (DMO). Después del análisis, los resultados numéricos se exportaron como hojas de cálculo.
Estas mediciones se utilizaron para evaluar la extensión del daño microestructural en el hueso alveolar asociado con la condición patológica OP+PD y para evaluar la eficacia terapéutica de la glicitaína en la restauración de la calidad ósea. Este enfoque permitió una evaluación cuantitativa, reproducible y de alta resolución de la integridad estructural en el entorno óseo periodontal, ofreciendo información morfológica clave sobre los resultados del tratamiento.
Perfiles farmacológicos de red
Para investigar sistemáticamente los componentes bioactivos de la medicina tradicional china (MTC) que pueden modular vías biológicas clave relevantes para la osteoporosis comórbida y la periodontitis (OP + PD), este estudio empleó un enfoque de farmacología de red para analizar Angelica sinensis. Esta planta fue seleccionada en función de su uso histórico en la medicina tradicional china para controlar los trastornos y la inflamación relacionados con los huesos, incluidos los síntomas asociados con la osteoporosis y la enfermedad crónica de las encías. En la fase de selección de compuestos, los ingredientes activos de Angelica sinensis se recuperaron utilizando las bases de datos TCMSP y TCMID [los detalles de la base de datos se trasladaron a ToM] y se filtraron utilizando criterios de biodisponibilidad oral (OB) ≥ 30% y similitud con el fármaco (DL) ≥0,18. Las interacciones compuesto-objetivo se predijeron mediante STITCH, con validación del sitio objetivo a través de DisGeNET y OMIM. El análisis de enriquecimiento de vías se realizó utilizando la plataforma DAVID 2021 para identificar las vías de señalización de KEGG potencialmente moduladas por los compuestos seleccionados. Para visualizar las interacciones moleculares, se construyó una red de "compuesto-diana-vía" basada en índices topológicos (centralidad de grado, centralidad de intermediación). El análisis identificó la gliciteína, un flavonoide natural, como un compuesto con propiedades farmacocinéticas favorables y una fuerte conectividad con CD44, lo que sugiere una posible relevancia terapéutica en OP+PD. Sin embargo, la gliciteína no ha sido aprobada clínicamente para el tratamiento de la osteoporosis o la periodontitis; Estos hallazgos se basan en predicciones in silico y proporcionan un marco teórico para experimentos de validación in vivo posteriores 25.
Validación de acoplamiento molecular
Las estructuras proteicas de CD44 (ID de PDB: 1UUH) y PI3K (ID DE PDB: 4L23) se recuperaron del Banco de Datos de Proteínas de RCSB (https://www.rcsb.org). Las estructuras de los ligandos (gliciteína, ligustilida) se optimizaron mediante la minimización de la energía utilizando un campo de fuerza molecular. Las simulaciones de acoplamiento se realizaron con un algoritmo genético bajo los siguientes parámetros: 100 carreras, tamaño de la población 150 y 25×106 evaluaciones energéticas. Los bolsillos de unión se definieron en función de las coordenadas del ligando cristalográfico (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). Las poses de acoplamiento resultantes se clasificaron por energía de enlace (ΔG, kcal / mol) y la reproducibilidad se validó utilizando un umbral de desviación cuadrática media (RMSD) de <2.0 Å.
Evaluación terapéutica de la gyciteína en modelos murinos OP+PD
La gliciteína (pureza ≥ 98%) se obtuvo de un proveedor bioquímico certificado en grado analítico para experimentos in vivo es una isoflavona natural que se sabe que está presente en Angelica sinensis, con propiedades antiinflamatorias y osteoprotectoras reportadas26. La periodontitis osteoporótica se indujo en ratones hembra C57BL/6 de 11 semanas de edad mediante ovariectomía bilateral (OVX) e inflamación periodontal inducida por ligaduras. Los ratones fueron asignados al azar en cuatro cohortes (n = 6 por grupo):
Simulación: Cirugía simulada + vehículo (5% de dimetilsulfóxido [DMSO] en aceite de oliva, sonda oral diaria)
OP+PD: Modelo de enfermedad + vehículo
OP+PD + Dosis bajas de gliciteína (50 mg/kg): Modelo de enfermedad + suspensión de gliciteína en el vehículo
OP+PD + Dosis altas de gliciteína (100 mg/kg): Modelo de enfermedad + suspensión de gliciteína en el vehículo
Análisis estadístico
Se realizaron pruebas estadísticas inferenciales y se crearon representaciones visuales de datos para la generación y visualización de datos. Los datos numéricos se expresaron como media ± DE. Las comparaciones de grupos se evaluaron mediante pruebas t no apareadas de dos colas, considerando valores con &l 0,05 como estadísticamente significativos. Estos métodos garantizaron la solidez de los datos y mejoraron la confiabilidad de los resultados analíticos posteriores.
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Perfil proteómico de cohortes de OP+PD
El análisis proteómico cuantitativo del suero de pacientes con OP+PD (n = 3) y controles sanos (n = 6) identificó proteínas desreguladas implicadas en la patogénesis de la enfermedad. El análisis comparativo reveló nueve proteínas reguladas a la baja (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) y seis proteínas reguladas al alza (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) en sueros OP+PD frente a controles (Figura 2A
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Este estudio propone un marco de investigación traslacional que combina perfiles proteómicos, validación de la expresión génica, modelado animal in vivo y farmacología de redes para explorar los mecanismos moleculares subyacentes a la comorbilidad de la osteoporosis y la periodontitis (OP+PD). La hipótesis central es que CD44 modula el eje de señalización PI3K / Akt, exacerbando así la pérdida ósea inflamatoria en condiciones de OP + PD, y que la gliciteína, un flavonoide de Angelica sinensis, puede ate...
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencia y Tecnología para la Industria del Cuidado de la Salud de la Provincia de Gansu, China (Subvención No. GSWSKY2020-77), la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Gansu (subvenciones Nº 25JRRA314 y 21JR7RA620), el Programa de Talentos de la Provincia de Gansu y el Programa de Investigación de Incubación de Jóvenes del Hospital Provincial de Gansu (subvención Nº 23GSSYF-35).
Contribuciones de los autores:
Jing Qi realizó la mayor parte del trabajo experimental y el análisis de datos. Yunqing Pang contribuyó a la recopilación de muestras, la curación de datos y el análisis estadístico. Yu Wang ayudó en el diseño experimental y brindó soporte técnico. Dawei Hou y Jing Wang supervisaron conjuntamente el proyecto, revisaron críticamente el manuscrito en busca de contenido intelectual importante y aprobaron la versión final. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kits ELISA | Biotecnología Shanghai Enzyme Link | Cuantificación de citocinas inflamatorias (TNF-&alfa;, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44) | |
| Kit de extracción de ARN | Biotecnología Yesheng de Shanghái | Extracción de ARN sérico | |
| Kit de síntesis de ADNc | Biotecnología Yesheng de Shanghái | Transcripción inversa de alta actividad | |
| Kit de qPCR | Biotecnología Yesheng de Shanghái | Amplificación cuantitativa por PCR | |
| Anticuerpos (primarios/secundarios) | Tecnología de señalización celular / Abcam / Hangzhou Xianli Biotechnology / Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology | Anticuerpos primarios específicos; β-actina control interno; anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra | |
| Reactivos de histología | Beyotime Biotechnology / Shanghái Shangshang | Hematoxilina– tinción de eosina y azul de metileno | |
| Sustrato quimioluminiscente | Biotecnología de Yakken | Detección de Western blot | |
| Sistema Micro-CT | Scanco Medical AG (Viva CT40) | Análisis microestructural de alta resolución | |
| Sistema LC-MS/MS | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | Análisis proteómico de alta resolución | |
| Software: MaxQuant (v2.1.0), Andrómeda | Instituto Broad | Preprocesamiento de datos proteómicos | |
| Software: GSEA (v4.3.2) | Instituto Broad | Análisis de enriquecimiento de vías | |
| Software: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), pheatmap (v1.0.12) | Fundación R | Computación estadística, análisis de redes, agrupación, mapas de calor | |
| Software: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | El Instituto de Investigación Scripps | Acoplamiento molecular y definición de cuadrícula | |
| Software: Open Babel 3.1.1 | Proyecto Open Babel | Optimización de la estructura del ligando | |
| Software: PyMOL 2.5.2 | Schrö dinger, LLC | Visualización de acoplamiento molecular |
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