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Artículo de método

Aislamiento y purificación de cardiomiocitos adultos de ratón mediante perfusión de Langendorff y sedimentación por gravedad

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DOI:

10.3791/69102

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31 de marzo de 2026

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1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

En este artículo

Resumen

Este estudio tiene como objetivo optimizar y agilizar el procedimiento de extracción de cardiomiocitos de ratones adultos, con el objetivo final de mejorar las metodologías de investigación en enfermedades cardiovasculares. Este protocolo obtiene de forma eficiente cardiomiocitos con alta viabilidad y pureza en un tiempo de procesamiento reducido, permitiendo experimentaciones más fiables y acelerando avances terapéuticos.

Resumen

Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo un gran desafío para la salud global, lo que genera una necesidad crítica de modelos in vitro fiables. Este estudio presenta un protocolo optimizado para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos de ratón, con el fin de abordar las limitaciones de baja viabilidad y contaminación no cardiomiocitaria en los métodos existentes. El protocolo se basa en la perfusión de Langendorff retrógrada, utilizando heparina sódica para la anticoagulación y empleando solo colagénasa tipo II (1,2 mg/mL) para la digestión. Los cardiomiocitos se purificaban mediante sedimentación gravitatoria y se cultivaban en superficies recubiertas de laminina. Este método proporcionó consistentemente 8,75 ± 0,36 × 105 cardiomiocitos por corazón con una alta proporción de células en forma de bastones (91,2% ± 2,11%) y una alta pureza (el porcentaje de células cTNT⁺DAPI⁺ en relación con las células DAPI⁺ fue aproximadamente del 97,47% ± 1,365%), que mostró estructuras sarcómicas claras. Al proporcionar un método estandarizado y reproducible para obtener cardiomiocitos adultos de alta calidad, este protocolo cierra eficazmente la brecha entre los estudios in vitro y la relevancia fisiopatológica, apoyando así la investigación cardiovascular avanzada.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de mortalidad en todoel mundo 1. Los cardiomiocitos, como foco central en la investigación cardíaca, han servido durante mucho tiempo como herramientas esenciales para investigar la fisiología y patologíacardíacas 2. Aunque las líneas celulares de cardiomiocitos disponibles comercialmente y los recientemente popularizados cardiomiocitos pluripotentes derivados de células madre humanas (hPSC-CM) ofrecen mayores ventajas en cuanto a accesibilidad y facilidad demanipulación 3,4,5, los cardiomiocitos primarios aislados ex vivo demuestran una correlación estructural y funcional superior con los mecanismos fisiológicos y patológicos cardíacos. Por ello, dominar técnicas para el aislamiento in vitro de cardiomiocitos es de suma importancia.

Los cardiomiocitos presentan transformaciones morfológicas y funcionales distintivas a lo largo del desarrollo. Cabe destacar que estas células mantienen el potencial proliferativo durante el desarrollo embrionario y el periodo neonatal (dentro de los 7 días posteriores al nacimiento), pero esta capacidad regenerativa se pierde permanentementea partir de entonces. A través de la maduración posnatal, los cardiomiocitos sufren una remodelación morfológica sustancial, adquiriendo finalmente su fenotipo característico adulto a los 2 meses de edad, con morfología en forma de bastoneta y estructura sarcomerica altamenteorganizada 7,8. Estas características dependientes de la etapa del desarrollo subrayan la importancia crítica de utilizar los cardiomiocitos de ratón adulto para estudios mecanicistas de la fisiopatología cardíaca.

Fundamental para avanzar en este campo es la obtención fiable de cardiomiocitos de alta fidelidad, especialmente células de origen adulto que emulan con precisión la fisiología cardíaca humana. Los protocolos actuales de aislamiento para cardiomiocitos murinos adultos enfrentan varios desafíos persistentes: (i) viabilidad celular comprometida, (ii) características poblacionales heterogéneas y (iii) procedimientos técnicamente exigentes, todos los cuales, en conjunto, obstaculizan el progreso de lainvestigación 9,10. Esto subraya la urgente necesidad de optimizar las metodologías de aislamiento para lograr tanto un mayor rendimiento como una mayor pureza, proporcionando así plataformas celulares más relevantes fisiológicamente para la investigación de enfermedades cardiovasculares.

Mediante la optimización sistemática de parámetros de perfusión, protocolos de digestión enzimática y formulaciones de reactivos, este estudio ha establecido con éxito una metodología mejorada para aislar y cultivar cardiomiocitos murinos adultos. El protocolo optimizado produce cardiomiocitos con integridad morfológica bien conservada, caracterizados por altas proporciones en forma de varilla y estructuras sarcómicas claramente visibles. Estos avances proporcionan una sólida plataforma experimental para la investigación en profundidad de la fisiopatología de los cardiomiocitos, facilitando significativamente la investigación sobre enfermedades cardiovasculares centrada en los mecanismos celulares miocárdicos.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales en este estudio se realizaron estrictamente conforme a las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobadas por el Comité de Ética del Hospital Popular Deqing. El estudio utilizó ratones machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas adquiridos a GemPharmatech Co., Ltd. Todos los animales se alojaron en instalaciones barrera de grado SPF con parámetros ambientales que cumplían con los estándares nacionales (temperatura ambiente 22 ± 2 °C, humedad relativa 50 ± 10%, ciclo luz/oscuro de 12/12 horas). A lo largo de los experimentos, este estudio se adhirió rigurosamente a los principios "3R" (Reemplazo, Reducción, Refinamiento) e implementó procedimientos estándar, incluyendo anestesia y analgesia para minimizar el sufrimiento animal.

NOTA: En resumen, el corazón intacto se extirpa rápidamente de la cavidad torácica murina y se somete a perfusión retrógrada con solución de colagénasa tipo II a través del aparato de Langendorff para digerir enzimáticamente la matriz extracelular. Tras la digestión completa del tejido, el miocardio ablandado se disocia cuidadosamente en una suspensión unicelular. La suspensión celular resultante se filtra secuencialmente para eliminar fragmentos de tejido no digeridos, seguida de sedimentación por gravedad para enriquecer cardiomiocitos viables. Los cardiomiocitos purificados pueden utilizarse para aplicaciones experimentales posteriores.

1. Preparación del dispositivo de perfusión de Langendorff

NOTA: El sistema Langendorff tiene un volumen total de tubos de 15,5 mL. El caudal de perfusión es de 3,5 mL/min para la perfusión cardíaca y de 10-15 mL/min para el lavado del sistema.

  1. Enjuague el sistema de perfusión Langendorff con 50 mL de etanol al 75%.
    NOTA: Realiza una limpieza mensual de tubos de vidrio con 1 M HCl para asegurar la esterilidad.
  2. Enjuaga con 250 mL de ddH2Oestéril para eliminar los residuos de etanol y las burbujas de aire.
  3. Ajusta la temperatura del baño maria a 42 °C. Enciende la bomba para iniciar el calentamiento circulante y llena la cavidad externa del tubo serpentino con agua tibia.
    NOTA: Esto asegura que la perfusión llegue al corazón a 37 °C.

2. Preparación del tampón

  1. Preparar el tampón de solución de Krebs-Bicarbonato (KB), el tampón de perfusión (PB), el tampón de digestión (DB), el medio de placaje de miocitos (MPM) y el medio de cultivo de miocitos (MCM) según las formulaciones listadas en la Tabla 1.
    NOTA: Prepárate fresco el día de tu uso.
  2. Preenfria 10 mL de KB buffer sobre hielo.
  3. Llena la luz con cacahuete de cacahuete. Ajusta el caudal a 3,5 mL/min y mide la temperatura del efluente (37 °C es lo óptimo).
  4. Enjuaga 7 mL de DB en la tubería y luego cierra la línea de perfusión.
  5. Prepara una solución de heparina sódica (0,5%, 62,5 KU) y carga 300 μL en una jeringuilla de insulina.
  6. Aliquota 10 mL de mantequilla de cacahuete y 10 mL de KB en dos placas de Petri separadas y preenfríalas en hielo.
  7. Coloca un colador de celda de 100 μm sobre la tapa de un tubo de centrífuga de 50 mL, prehumédelo con 1 mL de KB y fíjalo en un tubo de centrífuga de 50 mL.

3. Extracción cardíaca y canulación

NOTA: En este protocolo, se utilizaron guantes estériles, instrumentos, gasas y hisopos de algodón durante todo el procedimiento para minimizar la contaminación externa. Aunque la técnica aséptica completa es esencial para el cultivo celular primario, aquí sirvió para apoyar el bienestar animal y la integridad tisular para análisis histológicos y moleculares posteriores, más que para mantener la esterilidad para el aislamiento celular.

  1. Anestesiar al ratón mediante una inyección intraperitoneal de 80 mg/kg de pentobarbital sódico (grado farmacéutico) combinado con heparina sodio de 5 UI/g de peso corporal. Vigila de cerca hasta lograr la anestesia profunda. Pellizca los dedos de los pies del ratón y observa la desaparición del reflejo de pellizco para confirmar el éxito de la anestesia.
  2. Elimina el vello torácico usando crema depilatoria.
  3. Fija el ratón sobre una placa de espuma y desinfecta la piel del pecho con alcohol al 75%.
  4. Levanta la piel torácica con pinzas y haz una incisión en el proceso xifoides.
  5. Eleva el xifoides y corta las costillas bilateralmente hacia las regiones axilares, luego transecta completamente el diafragma.
    NOTA: Evita dañar el corazón.
  6. Inmoviliza el esternón y las costillas usando pinzas hemostáticas para exponer completamente el corazón.
  7. Absorbe la sangre y desplaza suavemente el hígado hacia las extremidades traseras con tejido. Utiliza bastoncillos de algodón con cuidado para manipular el corazón y exponer la vena cava inferior.
  8. Inyecta 300 μL de solución de heparina sódica (del paso 2.5) en la vena cava inferior usando la jeringuilla de insulina preparada.
    NOTA: Ten cuidado de evitar la introducción de burbujas de aire.
  9. Extirpa el tejido tímico y luego secciona las venas y arterias circundantes. Transfiere el corazón al buffer de PB pre-refrigerado (desde el paso 2.6) inmediatamente.
    NOTA: La extirpación del timo mejora la visibilidad aórtica. Preserva un segmento aórtico durante la excisión. La contracción miocárdica se ralentizó con una solución de PB preenfriada. La escisión cardíaca bajo anestesia logra una eutanasia humana.
  10. Usando micropinzas, agarra la aorta y móntala sobre la cánula del sistema de perfusión de Langendorff. Asegura con sutura de seda 5-0.
    NOTA: Realiza este paso rápidamente. Asegúrate de que el sistema de perfusión esté apagado durante el montaje del corazón.

4. Perfusión cardíaca

  1. Activa el sistema de perfusión e inicia el cronometraje durante 2 minutos y 30 segundos. Durante este periodo, el efluente consiste en un tampón de PB y no requiere recolección.
  2. Al completar el intervalo de 2 minutos y 30 s, comienza a recoger y recircular el buffer de base de datos mientras cronometra durante 15 minutos.
    NOTA: Monitorizar el estado miocárdico: la digestión óptima se indica con una menor elasticidad tisular y un aumento de la translucidez. Si la digestión parece incompleta, la duración puede extenderse moderadamente, pero no debe superar los 20 minutos en total para evitar daños en los cardiomiocitos.
  3. Tras el periodo cronometrado, cambia de DB a PB buffer y continúa la perfusión durante 4 minutos y 30 segundos adicionales. El efluente durante esta fase contiene amortiguador DB; Recógelo.
  4. Termina la perfusión apagando el sistema tras el último intervalo de tiempo.

5. Disociación y purificación celular

  1. Retira el corazón de la cánula y transfiere al buffer KB preenfriado (preparado en el paso 2.6).
    NOTA: La digestión enzimática se interrumpió por la transferencia inmediata del corazón al buffer KB. Esto diluye rápidamente la enzima residual, evitando una digestión excesiva y asegurando una alta viabilidad celular.
  2. Con tijeras finas, extirpa cuidadosamente los tejidos auriculares y aórticos, reteniendo solo el miocardio.
  3. Disociar mecánicamente el tejido miocárdico en pequeños fragmentos (<1 mm3) usando microfórceps.
  4. Sopla suavemente los fragmentos de tejido usando un cuentagotas de 2 mL para lograr una suspensión unicelular.
    NOTA: Ejerce un cuidado extremo durante el soplado para preservar la morfología de los cardiomiocitos en forma de bastón. Evita usar puntas estándar de pipeta, ya que su diámetro estrecho puede alterar mecánicamente la integridad celular.
  5. Filtrar la suspensión resultante de la celda a través del colador de celda de 100 μm prehumedecido (montado en el paso 2.7) hasta un tubo de 50 mL.
  6. Transfiere la suspensión filtrada a un tubo de 15 mL y permite que los cardiomiocitos se asienten por sedimentación gravitatoria (15 min, 4 °C).
    NOTA: La reducción de la superficie basal de los tubos de 15 mL mejora significativamente la eficiencia de recuperación celular en comparación con los tubos de 50 mL.
  7. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, resuspender los cardiomiocitos en pellets en 10 mL de tampón KB helado usando una pipeta de transferencia de 2 mL y repetir la sedimentación (15 min, 4 °C).
  8. Repite los pasos 5.4-5.7 para obtener una preparación purificada de cardiomiocitos intactos en forma de varilla adecuados para aplicaciones.

6. Cultivo celular

  1. Cubrir los platos de cultivo con laminina de 10 μg/mL e incubar a 37 °C durante 2 horas.
    NOTA: Para minimizar el daño mecánico a los cardiomiocitos en forma de varilla y reducir el tiempo de procesamiento prolongado asociado al placado diferencial, este estudio empleó recubrimiento de laminina en lugar de placado diferencial, una estrategia que no solo mejora la eficiencia de la unión celular, sino que también preserva las características fisiológicas nativas de los cardiomiocitos.
  2. Resuspende los cardiomiocitos en 4 mL de MPM precalentado (37 °C). Tras retirar la solución de laminina, siembra los cardiomiocitos en los recipientes recubiertos. Incubar a 37 °C con 2% deCO2 durante 1 hora. Observa la morfología, tamaño y densidad celular bajo un microscopio.
  3. Tras la incubación, decanta cuidadosamente el MPM y retitúyelo por MCM precalentado (37 °C). Mantener la incubación a 37 °C con un 2% deCO2 durante 24 horas.
  4. Tras 24 horas, examinar los cardiomiocitos para asegurar la integridad estructural y la morfología.
    NOTA: Mantenga una técnica aséptica estricta durante todo el procedimiento.
    PRECAUCIÓN: La colagnasa tipo II puede causar alergias respiratorias, irritación de la piel y de los ojos. Asegúrate de operar en un lugar bien ventilado y evita inhalar polvo ni entrar en contacto con la piel y las mucosas. Todos los tejidos cardíacos de ratón desechados, muestras de sangre y cualquier material desechable que haya estado en contacto con ellos deben recogerse como residuos biopeligrosos en recipientes dedicados y a prueba de fugas marcados con el símbolo de riesgo biológico. Estos materiales son posteriormente sometidos a procedimientos centralizados de descontaminación y eliminación.

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Resultados

El procedimiento de aislamiento y cultivo de cardiomiocitos adultos de ratón se muestra en el protocolo, con la instrumentación requerida y la configuración de tubos ilustradas en la Figura 1. La evaluación morfológica reveló que los cardiomiocitos recién aislados, así como los cultivados durante 1 hora y 24 horas, presentaban todos una morfología característica en forma de bastón o fusiforme con estrías claramente visibles (Figuras 2A-C

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Discusión

Este estudio supone un avance metodológico significativo en la investigación cardiovascular al establecer un protocolo optimizado para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos en ratones adultos. Mediante el refinamiento sistemático de la composición del tampón y los parámetros enzimáticos de la digestión, este enfoque mejora notablemente la fiabilidad del sistema de cultivo, al tiempo que mejora tanto la pureza como la viabilidad de los cardiomiocitos. Estos avances técnicos proporcio...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos con entusiasmo el apoyo financiero proporcionado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 82400312).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BDMAladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaD111028
BSAAladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaB265994
C57BL/6 ratones GemPharmatech Co., Ltd8– macho de 12 semanas 
CaCl2Aladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaC431202
Colagenasa tipo IIWorthington Biochemical Corporation (EE. UU.)LS004176LOT#:43D23502    Unidades de actividad enzimática: 270u/mg dw
FBSBeyotime Biotechnology, ChinaC0226
GlucosaAladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaD639737
HEPESSigma-AldrichH7006
KClAladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaP112134
KH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaP104075
L-glutaminaThermo Fisher Scientific25030081
MEMThermo Fisher Scientific11095080
MgSO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaM116444
Na2HPO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaS274390
NaClAladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaC111547
NaH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaS108339
NaHCO3Aladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaS112338
Penicilina-estreptomicina (100x)Beyotime Biotechnology, ChinaC0222
Microscopio Primovert de Cultivo Celular Invertido  Carl Zeiss
TaurinaAladdin Scientific Corporation, Shanghái, ChinaT103829

Referencias

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