Artículo de método

Modelo organoide tumoral tridimensional derivado del paciente para el cribado in vitro de células T del receptor quimérico de antígenos

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DOI:

10.3791/69113

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30 de diciembre de 2025

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1Department of Oncology, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 2Department of Pharmacology, Joint Laboratory of Guangdong-Hong Kong Universities for Vascular Homeostasis and Diseases, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 3Department of Digestive Disease, Shenzhen Qianhai Shekou Free Trade Zone Hospital, 4Department of Human Cell Biology and Genetics, School of Medicine, Southern University of Science and Technology, 5Department of Surgical Endoscopy, Shenzhen People's Hospital (The First Affiliated Hospital, Southern University of Science and Technology; The Second Clinical Medical College, Jinan University), 6Department of Medicine and Therapeutics, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 7Institute of Digestive Disease, State Key Laboratory of Digestive Disease, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

En este artículo

Resumen

Este protocolo establece un modelo de cocultivo in vitro utilizando organoides tumorales derivados del paciente y células T del receptor de antígenos quiméricos (CAR-T) para evaluar la actividad citotóxica específica de las células CAR-T frente a las células tumorales sólidas.

Resumen

La terapia con células T con receptor de antígenos quiméricos (CAR-T) ha logrado una eficacia clínica emocionante en malignidades hematológicas, pero la terapia con células CAR-T para tumores sólidos aún requiere un desarrollo adicional. Los organoides tumorales derivados del paciente son modelos de enfermedad in vitro que mantienen la heterogeneidad del paciente y se han utilizado para probar la eficacia y seguridad de la quimioterapia y los fármacos dirigidos. Este método describe un modelo de pruebas de eficacia in vitro que consiste en co-cultivar organoides tumorales con células CAR-T. Las muestras de cáncer colorrectal de pacientes se construyen en organoides tumorales con una estructura tridimensional (3D) en una matriz de membrana basal. Los organoides tumorales pueden crecer de forma estable y pasar de forma continua. Los organoides tumorales maduros se separan de la matriz mediante lavado y centrifugación, y las células CAR-T se añaden en diferentes proporciones efector-objetivo (E:T) para formar un sistema de cocultivo inmunitario-organoide. Tras 6-24 horas, la morfología y las estructuras intercelulares de los organoides se observan mediante imágenes de campo claro. Este experimento realiza además la tinción de células muertas en el sistema de cocultivo, que puede reflejar la viabilidad de los organoides y evaluar el efecto citotóxico de las células CAR-T sobre los organoides tumorales. Este experimento puede observar eficazmente la interacción entre las células CAR-T y los organoides tumorales 3D, y los resultados pueden utilizarse para evaluar la actividad destructora de tumores de las células CAR-T.

Introducción

La terapia con células del receptor de antígenos quiméricos T (CAR-T) ha demostrado un éxito clínico notable en el tratamiento de malignidadeshematológicas 1. Sin embargo, su aplicación en tumores sólidos sigue siendo limitada debido a varios obstáculos importantes, incluyendo la heterogeneidad tumoral y la pérdida de antígenos, barreras físicas y químicas dentro de la masa tumoral, y el microambiente tumoralinmunosupresor 2,3. Estos desafíos contribuyen a la limitada eficacia de la terapia con células CAR-T en entornos tumorales sólidos.

La evaluación in vitro de la eficacia de las células CAR-T es un paso crítico durante el desarrollo preclínico. Los modelos más utilizados son las líneas celulares tumorales, que pueden expresar antígenos específicos asociados al tumor o estar diseñados para transportar genes reporteros como laluciferasa 4,5. En consecuencia, los resultados de los ensayos convencionales basados en líneas celulares a menudo no predicen los resultados clínicos. Los modelos tumorales derivados del paciente ofrecen una alternativa prometedora para evaluar con mayor precisión la función de CAR-T en el contexto de tumores sólidos.

Aunque varios estudios han comenzado a utilizar PDTOs para la evaluación de células CAR-T, persisten desafíos para establecer protocolos de cocultivo estandarizados, robustos y accesibles que equilibren eficazmente la preservación de la arquitectura tumoral 3D con la interacción eficiente célula inmunitaria-célula tumoral. Los organoides tumorales derivados del paciente (PDTOs) son modelos tridimensionales (3D) de enfermedad ex vivo generados a partir de tejidos tumorales o células del paciente. Las PDTO se han establecido con éxito para una amplia variedad de tipos de tumores, incluyendo cánceres colorrectales, de mama, de páncreas y de pulmón. Estas estructuras conservan la arquitectura histológica, los perfiles moleculares y la heterogeneidad funcional del tumororiginal 6. Junto con las células tumorales primarias y los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), los PDTO representan una plataforma valiosa para modelar características específicas de cada paciente7. En comparación con las líneas celulares tumorales convencionales o cultivos primarios, los PDTOs recapitulan más fielmente el entorno tumoral in vivo, mostrando composiciones celulares complejas y organizaciónestructural 8. También mantienen la estabilidad genómica y preservan los patrones de expresión génica en pasajes extendidos, permitiendo una evaluación más precisa de las respuestas terapéuticas 9,10. Las PDTO se han empleado con éxito en estudios de biología tumoral, cribado de fármacos y medicina de precisión, y son cada vez más reconocidas por su utilidad en pruebas de inmunoterapia, incluyendo la identificación de nuevos objetivos CAR, la optimización del diseño de CAR y la evaluación decitotoxicidad 6,11,12,13 . Una limitación común del cultivo de organoides es su dependencia de componentes de la matriz extracelular (ECM) como Matrigel (en adelante denominado matriz de membrana basal [BMM]) para el mantenimiento de la estructura 3D, lo que puede dificultar la infiltración de células inmunitarias en ensayos de cocultivo. Para asegurar la consistencia y la interacción óptima de las células en cocultivo, normalmente se seleccionan organoides dentro de un rango de tamaño definido (por ejemplo, 100-200 μm de diámetro).

Este protocolo describe una plataforma de cocultivo para evaluar la citotoxicidad de células CAR-T utilizando PDTO derivados del cáncer colorrectal. Las muestras tumorales de los pacientes se disocian enzimáticamente y se cultivan en el BMM para generar organoides 3D. Una vez maduras y expandidas, los organoides de tamaño uniforme se aíslan y se marcan con fluorescencia. Se siembran en placas de varios pozos y se cocultivan con células CAR-T en diferentes proporciones efector-objetivo (E:T). Una característica clave de este enfoque es la eliminación deliberada de PDTOs del BMM antes del cocultivo, permitiendo el acceso directo y sin obstáculos de las células CAR-T a los organoides tumorales manteniendo su integridad 3D en suspensión. Tras 24 horas, la microscopía de campo claro revela una desintegración progresiva de PDTO, caracterizada por una morfología 3D alterada, contracción de células tumorales y pérdida de viabilidad. La imagen de células vivas y la microscopía de fluorescencia visualizan aún más las interacciones entre las células CAR-T marcadas con fluorescencia y los blancos tumorales. Se utilizan ensayos cuantitativos sobre muerte celular para evaluar la citotoxicidad. Este cocultivo inmunológico basado en organoides proporciona una plataforma robusta y específica para cada paciente para evaluar la eficacia antitumoral de las células CAR-T ex vivo, permitiendo la optimización terapéutica y apoyando la traducción clínica.

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Protocolo

Se utilizaron organoides derivados de pacientes con cáncer colorrectal. Se obtuvieron fragmentos de tejido tumoral de pacientes sin tratamiento con adenocarcinoma colorrectal primario (CCR) confirmado histológicamente. Todos los tejidos se extrajeron de muestras de biopsia endoscópica recogidas durante los procedimientos diagnósticos estándar en el Hospital de la Zona Franca Qianhai Shekou de Shenzhen. Todos los tejidos donantes fueron confirmados como CCR mediante examen histopatológico por parte de patólogos institucionales. El protocolo sigue las directrices institucionales. Se obtuvieron consentimientos informados por escrito de todos los pacientes. El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital de la Zona Franca Qianhai Shekou de Shenzhen (2024KY-009-01K).

1. Cultura PDTO

  1. Preparación de tejidos
    1. Colocar fragmentos de tejido tumoral obtenidos mediante biopsia por colonoscopia de pacientes con adenocarcinoma colorrectal primario (CCR) confirmado histológicamente en un tubo estéril de 50 mL.
    2. Añade 30 mL de solución de lavado de tejido frío compuesta por la Solución Salaria Equilibrada de Hanks (HBSS), albúmina sérica bovina al 1% (BSA), 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, 50 μg/mL de gentamicina, 5 μg/mL de anfotericina B y 10 μM inhibidor de quinasa asociada a la Rho.
    3. Coloca el tubo sobre hielo y mueve suavemente durante 5 minutos para lavar el pañuelo.
    4. Repite el paso 1.1.3. Dos veces más con una solución nueva de lavado de pañuelo.
  2. Digestión de tejidos
    1. Recorta el tejido necrótico o adiposo y corta el tumor en fragmentos de tejido.
    2. Calienta 8 mL de medio digestivo (medio DMEM, colagenasa IV de 500 U/mL, colagenasa II de 1,5 mg/mL, hialuronidasa de 20 μg/mL, dispasa tipo II de 0,1 mg/mL, 10 μM Y-27632 y suero bovino fetal al 1%) hasta 37 °C.
    3. Transfiere los fragmentos al tampón de digestión e incuba a 37 °C en un baño maria. Haz girar el tubo suavemente a mano durante ~10 segundos cada 5 minutos para facilitar la penetración de la enzima.
      NOTA: Ajusta el volumen del buffer de digestión según el tamaño del bloque de tejido. Generalmente, 8-10 mL son suficientes para los tamaños de biopsia endoscópica.
    4. Observa bajo un microscopio después de 15 minutos para comprobar el estado de disociación. Si quedan fragmentos de tejido, continúa la digestión hasta un máximo de 30 minutos.
    5. Cuando los racimos sean visibles, pipetea suavemente (5-10 veces) usando una pipeta de 10 mL para disociar mecánicamente. Centrifuga a 350 × g durante 5 minutos.
    6. Desechar el sobrenadante; resuspende el pellet en 10 mL de solución de lavado y centrifuga a 350 × g durante 5 minutos. Repite el lavado dos veces.
      NOTA: Los PDTO suelen comenzar a formar estructuras esféricas compactas entre 3 y 5 días tras el cultivo. Los organoides mostraron una proliferación robusta y alcanzaron un tamaño adecuado para la experimentación (aproximadamente 100-200 μm de diámetro) entre el día 10 y 14. El paseo se realizaba cada 7-10 días para mantener un crecimiento saludable y prevenir la sobreconfluencia o necrosis central. Generalmente, se utiliza un buffer de digestión de 8-10 mL por biopsia (fragmentos de 2 mm³), asegurando el TrypLE Express a una concentración final de trabajo de 1×.

2. Construcción de PDTO

  1. Incrustación matricial
    1. Coloca 200 μL de BMM (preenfriado a 4 °C) en un tubo limpio y pipetea la pila de la célula al menos 10-15 veces usando una punta de pipeta preenfriada hasta que la suspensión parezca homogénea, sin grumos visibles.
    2. Dispensar aproximadamente 30 μL de gotas en cada pozo de una placa de 24 pozos. Incuba a 37 °C durante 10 minutos para solidificar.
    3. Añade 500 μL de medio de cultivo organoide (medio avanzado DMEM/F12, que contiene 50 μg/mL de R-spondin 1, 10 μg/mL de Noggin, 500 μg/mL de EGF, 100x HEPES, 100x Glutamax, 500x Normocin, 500x Gentamicina/anfotericina B, 50x N2, 100x B27, 500 mM n-acetilcisteína, 1 M de niacinamida, 5 mM inhibidor de Alk 4/5/7, inhibidor de 30 M p38, 100 μM de gastrina, y 100 μM de prostaglandina E2) por pozo.
      NOTA: Utilice aproximadamente 30 μL de BMM por gota; Ajusta según la densidad celular.
  2. Mantenimiento de la cultura
    1. Cultivar organoides a 37 °C con 5% deCO2; Cambia el medio cada 3 días.
    2. Monitoriza la formación de organoides a diario. Espera esferoides pequeños para el día 3.
    3. Evaluar el establecimiento exitoso de organoides durante los días 6-10. El tiempo de formación (entre 3 y 14 días) depende de la viabilidad y la tallaje del tejido.

3. PDTOs de paso

  1. Desagregación
    1. Preenfría la centrífuga a 4°C. Retira el medio y añade 1 mL de HBSS bien frío y pipeta suavemente 3-5 veces para alterar el BMM.
      NOTA: Los organoides bien desarrollados pueden observarse como pequeños puntos blancos a simple vista.
    2. Transfiere la suspensión a un tubo estéril de 15 mL y centrifuga a 350 × g durante 5 minutos.
  2. Disociación enzimática
    1. Descarta el sobrenadante y añade 1 mL de Triple. Coloca en un baño María a 37 °C durante 2 minutos.
    2. Añadir 2 mL de HBSS para neutralizar el triple; Centrifuga a 350 × g durante 5 minutos.
    3. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender 2 mL de HBSS. Centrifuga de nuevo a 350 × g durante 5 minutos.
  3. Reincrustación
    1. Añadir BMM fresco al pellet en una proporción de 1:3-1:6 (pellet organoide: BMM, v/v); Vuelve a suspender suavemente. Cada gota contiene aproximadamente 30 μL de volumen final. Colocar las gotas en una nueva placa de 24 pozos; incubar a 37 °C durante 10 minutos.
    2. Añadir 500 μL de medio de cultivo por pozo e incubar a 37 °C con un 5% de CO2.
    3. Examinar pozos a diario; observa el reensamblaje 3D en aproximadamente 48 horas.
    4. Tras 3-5 pasajes, selecciona organoides sanos para ensayos posteriores o criopreservación.

4. Co-cultivo de células CAR-T y PDTOs

  1. Preparación de medio de cocultivo
    1. Suplementar el medio de cultivo de organoides en base con 10 ng/L de IL-2 y 0,05 mM β-mercaptoetanol para apoyar la viabilidad de CAR-T.
      NOTA: El medio base soporta la estructura 3D y la viabilidad de PDTO.
  2. Preparación de PDTO
    1. Retira las gotas de BMM que contienen PDTO maduros (por ejemplo, días 4-6) de la placa de cultivo usando un raspador de células estériles o una punta de pipeta.
    2. Transfiere la mezcla BMM/PDTO a un tubo cónico de 15 mL.
    3. Añade 5-10 mL de HBBS helado o solución de lavado de pañuelo (como se describe en el paso 1.1.2) al tubo. Invierte suavemente 5-10 veces para desalojar los organoides del BMM.
    4. Deja reposar la mezcla sobre hielo durante 5 minutos. El BMO se volverá líquido, mientras que los PDTO disociados permanecerán en suspensión.
    5. Aspira cuidadosamente el BMM que contiene el sobrenadante, dejando atrás el pellet PDTO. Evita mover el pellet.
    6. Repite los pasos 4.2.3 a 4.2.5 dos veces más para asegurar la eliminación completa del BMM.
    7. Tras el lavado final, recoge el sobrenadante que contiene PDTO y centrifuga a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    8. Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet PDTO en 1-2 mL de medio de cultivo organoide o medio de cocultivo.
    9. (Opcional para contar) Prepara una suspensión de celda única.
      1. Si se requiere un conteo preciso, transfiere los organoides resuspendidos a un nuevo tubo e incuba con TrypLE Express precalentado a 37 °C durante 3-5 minutos, seguido de un pipeteo suave para lograr una suspensión unicelular. Procede al recuento celular (por ejemplo, usando un hemotómetro o un contador celular automático).
        NOTA: Este paso disocia los organoides y solo es para contar antes de volver a colocar el placado.
    10. Selección de tamaño y estandarización: Para asegurar un tamaño organoide consistente para el cocultivo, pasar los PDTOs resuspendidos (del paso 4.2.8) a través de un colador celular de 70 μm colocado sobre un tubo cónico de 50 mL. Este paso elimina grandes agregados organoides y escombros, representando una fracción de tamaño estandarizada adecuada para un cocultivo uniforme.
    11. Centrifugar la suspensión organoide estandarizada a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    12. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender los PDTO estandarizados en un volumen adecuado de medio de co-cultivo precalentado.
    13. Cuenta los PDTO estandarizados (por ejemplo, usando un hemocitómetro bajo un microscopio, contando el número de organoides por campo).
      NOTA: El recuento se basa en el número de organoides, no en el número de células.
    14. Sembra las PDTO estandarizadas en la placa de varios pozos deseada (por ejemplo, placa de fondo en U de 96 pozos) al número objetivo por pozo.
    15. Añadir células CAR-T a los pozos a las proporciones efector-objetivo (E:T) deseadas.
  3. Etiquetado de PDTOs
    1. Preenfría la centrífuga a 4 °C. Aspira el medio; Añade 1 mL de HBSS para desalojar las gotas.
    2. Transfiere a un tubo centrífugo de 15 mL, añade 4 mL de HBSS y pipetea suavemente. Centrifuga a 350 × g durante 5 minutos.
    3. Descarta el sobrenadante, añade 5 mL de HBSS y pipa suavemente. Centrifugar de nuevo a 350 × g durante 5 minutos.
    4. Prepara la solución de trabajo Hoechst 33342.
    5. Resuspende el pellet en 1 mL de solución Hoechst 33342 (concentración final 5 μg/mL). Mezcla suavemente por inversión 3-5 veces para asegurar una penetración uniforme del tinte. Protege de la luz envolviendo el tubo en papel de aluminio. Incuba a 37 °C durante 10 minutos. Después de teñir, lávate dos veces con HBSS para eliminar el exceso de tinte.
  4. PDTOs de enchapado
    1. Estimar la densidad organoide en una proporción de gotas de gel a pozo de 1:5; resuspenden en medio de cocultivo aproximadamente a 1 × 103 organoides/mL.
    2. Añadir 100 μL por pozo en una placa de 96 pozos; incluye al menos triplicados por condición.
      NOTA: No realicéis recuento celular en esta etapa; los organoides permanecen intactos.
  5. Co-cultura CAR-T
    NOTA: Este protocolo se centra en la co-cultura y evaluación de la eficacia de células CAR-T con PDTO. La generación y caracterización de las células CAR-T utilizadas en este estudio se describen en la Sección 8.
    1. Cosechar células CAR-T en fase logarítmica. Tinte con azul de tripán para confirmar viabilidad >95%.
    2. Centrífuga las celdas a 350 × g durante 5 minutos; Suspender en medio de co-cultivo.
    3. Ajusta las concentraciones a 4 × 106/mL, 2 × 106/mL y 1 × 106/mL.
    4. Añadir 100 μL de suspensión CAR-T por pozo según el diseño experimental. Añadir 100 μL de medio de cocultivo para controlar pozos.
    5. Incubar la placa a 37 °C, 5% deCO2 durante 6-24 horas.

5. Tinción de células muertas

  1. Tinción verde SYTOX
    1. Para cada 1 × 105 celdas, prepara 100 μL de solución de tinción Nuclear Green diluyendo 1 μL de SYTOX Green (1000x) en 1 mL de tampón de ensayo.
    2. En los tiempos de co-cultivo de 6 y 24 horas, añadir 100 μL de solución de tinción SYTOX Green por pozo. Incubar a 37 °C durante 20 minutos en la oscuridad.

6. Adquisición de imágenes

  1. Aspira el sobrenadante y añade 100 μL de DMEM/F12.
  2. Capturar imágenes de campo brillante y fluorescencia usando un microscopio (por ejemplo, confocal):
    Hoechst 33342 (PDTOs): excitación (Ex)/emisión (Em) = 350 nm/461 nm
    mCherry (CAR-T): Ex/Em = 587 nm/610 nm
    SYTOX Green (celdas muertas): Ex/Em = 504 nm/528 nm
  3. Captura al menos imágenes triplicadas por pozo, enfocando el campo central.

7. Análisis de datos

  1. Launch ImageJ (versión 1.54, NIH, https://imagej.nih.gov/ij/); importar imágenes del canal SYTOX Green. Establece manualmente el umbral para distinguir señales de fluorescencia del fondo (Imagen > Ajustar > umbral).
  2. Utiliza la función Analizar > Medir para calcular la densidad integrada. Exportar datos como .csv para análisis estadísticos posteriores en un software de análisis estadístico adecuado (por ejemplo, GraphPad Prism).
  3. Establece umbral para separar las señales de fluorescencia del fondo.
  4. Selecciona todo el campo; ejecuta Analyze > Measure para calcular la intensidad sumada de la señal de fluorescencia.
  5. Exportar datos y realizar análisis estadísticos para comparar tratados y controles a las 24 horas.

8. Generación y caracterización de células CAR-T

  1. Diseño de la construcción de CAR
    NOTA: Las células CAR-T utilizadas en este estudio se dirigen a B7-H3 (codificada por el gen CD276), un antígeno frecuentemente sobreexpresado en el cáncercolorrectal 14. La construcción CAR consta de:
    Dominio extracelular: Un fragmento variable de cadena única (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal contra el clon B7-H3 376.96.
    Dominio bisagra y transmembrana: dominio bisagra CD8α y dominio transmembrana.
    Dominio coestimulador: CD28 humano.
    Dominio de señalización: CD3ζ humano.
  2. Generación de células CAR-T
    1. Aislamiento: Aislar células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de capas buffy sanas de donante usando centrifugación14 con gradiente de densidad Ficoll-Paque.
    2. Activación: Activar PBMCs humanos con anticuerpos anti-CD3/CD28 de unión de placa durante 48 horas en medios de células T suplementados con 10 ng/mL de IL-7 y 5 ng/mL de IL-15. Prepara el medio de células T mezclando volúmenes iguales (250 mL cada uno) de RPMI 1640 y medios Click, y suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS), 1x GlutaMAX y 1% de penicilina-estreptococo (Pen/Streptococo).
    3. Transducción: Transducir las células T activadas con sobrenadante retroviral usando una placa recubierta de retronectina como se describióanteriormente 15.
    4. Expansión: Cosechar y cultivar células T 3 días después de la transducción en un medio completo de células T humanas que contenga IL-7 e IL-15 durante otros 7-9 días antes de la caracterización y los ensayos funcionales.
  3. Caracterización de células CAR-T
    1. Expresión CAR: Evalúa la expresión de CAR 5-7 días después de la transducción mediante citometría de flujo utilizando una proteína recombinante B7-H3-Fc, seguida de un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente contra Fc14 humano. La eficiencia típica de transducción (celdas CAR+) varía entre el 80% y el 90%.
    2. Fenotipo: Caracterizar los subconjuntos de células T (por ejemplo, CD4+, CD8+, etc.) mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos contra CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, etc.14.
    3. Validación funcional (pre-cocultivo opcional): Antes de los experimentos de co-cultivo, validar funcionalmente las células CAR-T co-cultivando con líneas celulares blanco B7-H3-positivas y B7-H3-negativas y midiendo la liberación de citocinas (por ejemplo, IFN-γ por ELISA) o citotoxicidad (por ejemplo, usando citometríade flujo 15).
  4. Preparación para la co-cultura (ensayo PDTO)
    1. Utiliza células CAR-T para el cocultivo durante su expansión en fase logarítmica (normalmente entre los días 10-14 después de la activación). Antes de su uso, lava las células dos veces con HBSS para eliminar IL-7/IL-15 y vuelve a suspenderlas en el medio de cocultivo descrito en el paso 4.1.
    2. Confirma que la viabilidad es >95% usando tinción con Trypan Blue.
    3. Puntos de control visuales: Comprobar si hay pequeños racimos esféricos (50-100 μm) en los días 3-5 y esferoides maduros (100-200 μm) en los días 10-14.

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Resultados

Los organoides del cáncer colorrectal se derivaron con éxito de muestras de biopsia endoscópica (Figura 1), con la identidad tumoral confirmada por diagnóstico patológico (Figura 2). Los fragmentos tumorales cultivados en el BMM comenzaron a formar estructuras tridimensionales en menos de 24 horas. Los organoides de primera generación (P0) se pasaron entre los días 7 y 14. Los organoides exhibían morfologías diversas, incluyendo...

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Discusión

Este artículo presenta un método para evaluar el efecto citotóxico de las células CAR-T sobre las PDTO, combinando imágenes de campo claro y tinción fluorescente para evaluar la viabilidad de los organoides. Este enfoque de doble modalidad permite una visualización robusta de la muerte celular tumoral en un sistema modelo 3D y proporciona una evaluación semicuantitativa de la citotoxicidad CAR-T.

Un componente crítico de este protocolo es el medio de cultivo. ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2022YFC2304400, 2022YFC2304401), el Proyecto de Ciencia y Tecnología del Sistema Médico y de Salud de Nanshan (NSZD2024046, NS2024105) y el Fondo de Investigación Médica de Shenzhen (D2401023).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de 15 mLSAINING3030100
Placa de 24 pozosCORNING3524
Tubo de 50 mLSAINING3030000
Placa de 96 pozosCORNING3599
DMEM/F12 avanzadoGibcoC11330500BT
Inhibidor de Alk 4/5/7MCEHY-10432 
B27Gibco17504044
Armario de Bioseguridad (Clase II)Thermo FisherN/A
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA9056
Plato de cultivo celularBIOFILTCD010060
CentrifugadoraEppendorf5810R
El Medio de ClicksFUJI FILM9195
Incubadora de CO2YamataIP610
Colagenasa IISolarbioC8150
Colagenasa IVSigma AldrichC9407
Microscopio láser confocalZeissLSM900
Medio criopreservanteZENOAQCELLBANKERTM2
Amortiguador de digestiónReactivos preparados internamenteN/AComposición proporcionada en el manuscrito
Agitador digitalMIULABHS-25
Dispasa tipo IISigma-aldrichD4693
DMEMGibcoC11995500BT
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28Thermo Fisher11131D
EGFPeproTechAF-100-15-500UG
Suero fetal bovinoGibco1631389
GastrinGlpBioGA20228
Gantemicina/amphoteritina BGibcoR0151
GlutamaxGibco35050061
La solución salina equilibrada de HanksGibcoC14175500BT
HEPESGibco15630080
Hoechst 33342 BeyotimeC1027
HialuronidasaSolarbioH8030
IL-15Peprotech200-15-10UG
IL-2NovoproteínaCK24-10
IL-7Peprotech200-07-10UG
ImageJNIH (código abierto)https://imagej.nih.gov/ij/
Invertido  Microscopio fluorescenteMshotMF52-N
MatrigelCorning356231
N2Gibco17502048
n-AcetilcisteínaSigma AldrichA7250-5G
NiacinamidaSigma AldrichN0636-100G
NogginPeproTech120-10C-20
NormocinInvivoGenANT-NR-1
Medio de cultivo organoideReactivos preparados internamenteN/AComposición proporcionada en el manuscrito
Inhibidor de P38MCEHY-10295 
Penicilina-EstreptomiaGibco15140122
Prostaglandina E2MCEHY-101952 
Inhibidor de quinasa asociada a la rho/nbsp;Células madre72304
RPMI 1640HyCloneSH30809.01B
R-spondin 1PeproTech120-38-20UG
Rellenos de pipeta S1Termo Científica9501
Pipeta serológicaBIOFILGSP-010-050
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000063
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000055
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000098
Pipeta de canal únicoEppendorf3123000022
Bisturís desechables estérilesTech-SSSD10
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Depósito de agua del termostatoBluepardBWS-10
Trippan BluePhygenePH0519
TrypLE ExpressGibco12605028
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Referencias

  1. Lu, J., Jiang, G. The journey of CAR-T therapy in hematological malignancies. Mol Cancer. 21 (1), 194(2022).
  2. Maalej, K. M., et al. CAR-cell therapy in the era of solid tumor treatment: Current challenges and emerging therapeutic advances. Mol Cancer. 22 (1), 20(2023).
  3. Albelda, S. M. CAR T cell therapy for patients with solid tumours: Key lessons to learn and unlearn. Nat Rev Clin Oncol. 21 (1), 47-66 (2024).
  4. Shi, H., et al. IL-15 armoring enhances the antitumor efficacy of claudin 18.2-targeting CAR-T cells in syngeneic mouse tumor models. Front Immunol. 14, 1165404(2023).
  5. Zhang, D. K. Y., et al. Enhancing CAR-T cell functionality in a patient-specific manner. Nat Commun. 14 (1), 506(2023).
  6. Qu, S., et al. Patient-derived organoids in human cancer: A platform for fundamental research and precision medicine. Mol Biomed. 5 (1), 6(2024).
  7. Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
  8. Qu, J., Kalyani, F. S., Liu, L., Cheng, T., Chen, L. Tumor organoids: Synergistic applications, current challenges, and future prospects in cancer therapy. Cancer Commun. 41 (12), 1331-1353 (2021).
  9. Mo, S., et al. Patient-derived organoids from colorectal cancer with paired liver metastasis reveal tumor heterogeneity and predict response to chemotherapy. Adv Sci. 9 (31), 2204097(2022).
  10. Nam, C., Ziman, B., Sheth, M., Zhao, H., Lin, D. -C. Genomic and epigenomic characterization of tumor organoid models. Cancers. 14 (17), 4090(2022).
  11. Taurin, S., et al. Patient-derived tumor organoids: A preclinical platform for personalized cancer therapy. Transl Oncol. 51, 102226(2025).
  12. Tao, B., et al. Organoid-guided precision medicine: From bench to bedside. MedComm. 6 (5), e70195(2025).
  13. Ning, R. -X., et al. Application status and optimization suggestions of tumor organoids and CAR-T cell co-culture models. Cancer Cell Int. 24 (1), 98(2024).
  14. Du, H., et al. Antitumor responses in the absence of toxicity in solid tumors by targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cells. Cancer Cell. 35 (2), 221-237.e8 (2019).
  15. Sun, S., et al. Preclinical evaluation of antitumor activity and toxicity of TROP2-specific CAR-T cells for treatment of triple-negative breast cancer. J Immunother Cancer. 13 (9), e012442(2025).
  16. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 38 (12), e100928(2019).
  17. Zou, F., et al. The CD39+ HBV surface protein-targeted CAR-T and personalized tumor-reactive CD8+ T cells exhibit potent anti-HCC activity. Mol Ther. 29 (5), 1794-1807 (2021).
  18. Yu, L., et al. Patient-derived organoids of bladder cancer recapitulate antigen expression profiles and serve as a personal evaluation model for CAR-T cells in vitro. Clin Transl Immunol. 10 (2), e1248(2021).
  19. Wang, X., et al. Dynamic profiling of antitumor activity of CAR T cells using micropatterned tumor arrays. Adv Sci. 6 (23), 1901829(2019).
  20. Dekkers, J. F., et al. Uncovering the mode of action of engineered T cells in patient cancer organoids. Nat Biotechnol. 41 (1), 60-69 (2023).

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