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Un marco genómico estratificado para la predicción de serotipos de Salmonella : Evaluación de MLST, SeqSero, SeqSero2, SeqSero2S y SISTR en el suroeste de China

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DOI:

10.3791/69117

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9 de enero de 2026

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1West China School of Public Health and West China Fourth Hospital, Sichuan University, 2College of Pharmacy, Youjiang Medical University for Nationalities, 3Chengdu Center for Disease Control and Prevention (Chengdu Institute of Health Supervision), 4Sichuan Provincial Centre for Disease Control and Prevention, 5Department of Laboratory Medicine and Port Epidemic Disease Monitoring Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan International Travel and Healthcare Center (Chengdu Customs District Port Clinic), 6Health Promotion and Food Nutrition & Safety Key Laboratory of Sichuan Province, 7Innovation Center of Nursing Research and Nursing Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo establece un flujo de trabajo genómico estratificado para la predicción del serotipo de Salmonella , utilizando MLST o SeqSero2S para la vigilancia rutinaria, SISTR con MLST del genoma central para la detección de brotes, y SeqSero2S para cribado rápido. El protocolo ha sido validado mediante un análisis multicéntrico para mejorar la vigilancia en China.

Resumen

La serotipización precisa de Salmonella es esencial para una vigilancia eficaz y la investigación de brotes, ya que la diversidad serotipa afecta directamente a la patogenicidad y a la evaluación de riesgos para la salud pública. Sin embargo, los métodos convencionales de aglutinación por portaobjetos están limitados por una baja reproducibilidad, intensidad laboral y altos costes, lo que dificulta su aplicación en programas de monitorización de alto rendimiento. Para abordar estas limitaciones, desarrollamos y validamos un flujo de trabajo genómico que integra Multilocus Sequence Typing (MLST), el Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR), SeqSero, SeqSero2 y SeqSero2S para la predicción de serotipos utilizando datos de secuenciación del genoma completo. Este protocolo fue evaluado mediante un análisis multicéntrico de 315 aislados de Salmonella recogidos de fuentes alimentarias y humanas en el suroeste de China. Los hallazgos de este estudio demostraron una concordancia significativamente mayor entre los enfoques genómicos (hasta un 100%/99,1%/90,1% en el conjunto de entrenamiento y 100%/97,1%/93,1% en el conjunto de validación para SISTR/MLST/SeqSero2S, respectivamente) en comparación con la serotipación tradicional. El flujo de trabajo incluye recomendaciones para seleccionar métodos de predicción adecuados basados en el contexto de vigilancia, haciendo hincapié en MLST y SeqSero2S para monitorización rutinaria, SeqSero2S para cribado rápido y SISTR con MLST del genoma central para investigaciones de brotes. Este enfoque facilita la integración de la serotipado genómica en la práctica de la salud pública, reduciendo la dependencia de la serología tradicional y mejorando la reproducibilidad y escalabilidad en los programas de monitorización de Salmonella .

Introducción

La salmonela es uno de los patógenos transmitidos por alimentos más significativos a nivel mundial, causando una morbilidad y mortalidadconsiderables 1,2. En China, sigue siendo una de las principales causas de enfermedades transmitidas por alimentos, con un número limitado de serotipos que representan la mayoría de lasinfecciones. La identificación precisa de los serotipos es crucial para la vigilancia y las investigaciones de brotes, ya que la diversidad serotípica está estrechamente correlacionada con la patogenicidad y el riesgo para la salud pública. Esto es bien reconocido en serotipos comunes como Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium, pero algunos serotipos menos estudiados, como Salmonella Panama, también son una causa significativa de propagación global y enfermedadinvasiva 4, lo que pone de manifiesto la necesidad general de capacidades robustas de serotipado. Los métodos tradicionales de serotipado, reconocidos desde hace tiempo como el estándar de oro, son procesos que consumen mucho tiempo y alto coste y requieren más de 150antisueros 5. Además, están limitadas por una pobre reproducibilidad6, flujos de trabajointensivos en mano de obra 7 y variabilidad inherente debido a la interpretación subjetiva de las reaccionesde aglutinación 8, lo que las hace inadecuadas para programas de monitorización de alto rendimiento9.

La aparición de la secuenciación del genoma completo (WGS) ha transformado la caracterización de patógenos al permitir una predicción rápida y de alta resoluciónde serotipos 10,11,12. Se han desarrollado varias herramientas in silico, incluyendo Multilocus Sequence Typing (MLST), SeqSero13, SeqSero214, SeqSero2S15 y el Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR)7,15. Mientras que MLST ofrece un seguimiento epidemiológico estandarizado y a largoplazo 16, SeqSero2 y SeqSero2S permiten el análisis directo a partir de lecturas en bruto y facilitan el cribado de alto rendimiento de los serotipos comunes14,15. Por el contrario, SISTR requiere genomas ensamblados pero integra la detección de genes de antígenos con la tipificación de secuencias multilocus genómica central (cgMLST), proporcionando una resolución integral para las investigaciones debrotes 17. Aunque la caracterización basada en Salmonella basada en WGS se adopta cada vez más como evidencia principal en la investigación 16,18,19, su aplicación en la vigilancia a gran escala sigue siendo limitada, una carencia atribuida en parte a consideraciones prácticas no abordadas que influyen en la idoneidad del método. Una encuesta global reveló que solo el 8% de los laboratorios participantes utilizan WGS para la vigilancia rutinaria, siendo la complejidad analítica una barreraprincipal 20. Por ejemplo, la predicción fiable de los serotipos depende de una profundidad de secuenciación adecuada (típicamente >75× para coste-efectividad, idealmente ~200× para análisis de alta calidad) y ensamblajes genómicos de alta calidad (N50 de contigs > 30 kbp como mínimo rentable, preferiblemente >100 kbp), especialmente para herramientas dependientes del ensamblaje comoSISTR 21,22,23 . Además, la selección de herramientas debe estar alineada con los recursos computacionales y la experiencia del laboratorio: herramientas de código abierto como SeqSero2S ofrecen alternativas más rápidas para un cribado rápido al analizar lecturas en bruto y evitar el ensamblaje15, que es computacionalmente intensivo, mientras que los laboratorios con capacidad limitada en bioinformática pueden tener dificultades con el análisis y almacenamiento de datos. En consecuencia, existen datos insuficientes para determinar si las pruebas serológicas pueden reducirse en la vigilancia a granescala 20,24, lo que pone de manifiesto la necesidad de enfoques adaptativos a los recursos. Cabe destacar que, tras la pandemia de COVID-19, existe una cantidad considerable de instrumentación de secuenciación inactiva y qPCR en varios niveles de instituciones sanitarias, lo que representa una oportunidad para reutilizar esta capacidad para la vigilancia genómica.

Para cubrir esta brecha, realizamos una evaluación multicéntrica de las herramientas de serotipado genómico mencionadas utilizando 315 aislados de Salmonella recogidos de fuentes alimentarias y humanas enel suroeste de China 25,26. A partir de estos hallazgos, desarrollamos un flujo de trabajo estratificado que tiene en cuenta los distintos recursos de laboratorio y necesidades de vigilancia, proporcionando criterios claros para la selección de herramientas en diferentes contextos. Este marco prioriza SeqSero2S para cribado rápido y SISTR combinado con cgMLST para investigaciones de brotes, facilitando así la adopción de enfoques genómicos y reduciendo la dependencia de métodos tradicionales de serotipado. Aquí describimos cada paso del flujo de trabajo en detalle, incluyendo la identificación de aislamientos, la secuenciación, el análisis de datos y los criterios para seleccionar herramientas de predicción en diferentes contextos de vigilancia.

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Protocolo

La recogida y manejo de muestras heces humanas se llevó a cabo bajo la aprobación del Comité de Ética del Cuarto Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (Número de protocolo: HXSY-EC-2022093), de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las Buenas Prácticas Clínicas. Se renunció al consentimiento informado conforme a las normativas nacionales de salud pública.

NOTA: Todos los procedimientos que involucren cultivos vivos de Salmonella y muestras de heces humanas deben realizarse en un laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) por personal formado en prácticas microbiológicas estándar y procedimientos de bioseguridad. Lleva siempre el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad. Desinfecta y cambia los guantes contaminados regularmente. Descontamina todas las superficies de trabajo antes y después de los experimentos con un desinfectante adecuado (por ejemplo, 70% etanol, 1% hipoclorito de sodio). Descontamina todos los residuos líquidos y sólidos que contengan materiales biológicos mediante autoclave (por ejemplo, a 121 °C durante al menos 30 minutos) antes de su eliminación. Evita la generación de aerosoles y salpicaduras. Realiza todos los procedimientos que puedan crear aerosoles (por ejemplo, centrifugación, agitación vigorosa) dentro de un armario certificado de seguridad biológica.

1. Recogida de muestras de alimentos e identificación de cepas

  1. Recoge muestras de alimentos en mercados minoristas o instalaciones de procesamiento. Aislar la Salmonella de muestras de alimentos según la norma nacional de seguridad alimentaria GB 4789.4 y los protocolos de confidencialidad del Programa de Vigilancia de Enfermedades transmitidas por Alimentos.
  2. Preenriquecimiento:
    1. Pesa exactamente 25 g de cada muestra de alimento. Añade 225 mL de agua peptona tamponada (BPW) a la muestra (relación de dilución 1:10) y vórtice durante 30 s para asegurar la homogeneización y sumersión completas.
    2. Incubar la muestra en BPW a 36°C ± 1°C durante 8-18 horas en una incubadora agitada ajustada a 150 rpm.
      NOTA: El preenriquecimiento en caldo no selectivo aumenta significativamente la carga de patógenos. Manipula todos los materiales posteriores (recipientes, pipetas, etc.) como altamente infecciosos.
  3. Enriquecimiento selectivo: Tras el preenriquecimiento, transfiera 1 mL de la muestra a Caldo Tetrationato (TTB). Incuba el TTB a 42 °C durante 18-24 horas sin agitar.
  4. Aislamiento: Tras la incubación, estirar el cultivo enriquecido sobre las siguientes placas selectivas de agar: agar Hektoen Entérico (HE), agar de Lisina Desoxicolato (XLD) de xilosa y Salmonella CHROMagar. Incuba las placas a 36 °C durante 18-24 horas.
    NOTA: Al dejar placas en estrías, ten cuidado para evitar la creación de aerosoles y la contaminación cruzada. En el agar HE, las colonias presuntas de Salmonella suelen aparecer de color azul-verdoso a azul, con o sin centros negros. El agar circundante puede adquirir un tono verdoso similar. En el agar XLD, las colonias presuntas de Salmonella suelen ser rojas con centros negros. En CHROMagar, las colonias presuntas de Salmonella se caracterizan por su color magenta a malva, según lo especificado por el fabricante. En cada placa selectiva, se esperan colonias bien aisladas tras 18-24 horas de incubación. Las placas sobredimensionadas (>300 colonias) pueden requerir dilución y re-estría.
  5. Identificación: Examina las placas en busca de sospechas de colonias de Salmonella . Identificar cepas sospechosas utilizando un sistema de identificación automatizado con tarjeta de identificación Gram-negativo (GN), siguiendo las instrucciones del fabricante para el análisis.
    NOTA: Asegúrese de que los números de lote de las tarjetas GN sean válidos y dentro de la fecha de caducidad.
    1. Prepara una suspensión bacteriana a partir de una colonia pura a la turbidez especificada (0,50-0,63 según el estándar McFarland) usando solución salina al 0,45%.
    2. Carga la suspensión en la tarjeta GN y haz la prueba. Asegúrese de que el sistema esté configurado para incubar automáticamente la tarjeta a 35,0 °C ± 2,0 °C y monitorizar las reacciones bioquímicas durante hasta 8 horas.
    3. Acepta un resultado de Salmonella enterica ssp. enterica con una probabilidad ≥ del 95% y una calificación de confianza excelente .
  6. Serotipado: Elegir colonias individuales de la placa de agar de enjambre tras una incubación nocturna a 37 °C. Realizar pruebas de aglutinación con láminas para detectar antígenos O y antígenos H. Utiliza kits de antisuero para Salmonella disponibles comercialmente (véase la Tabla de Materiales) para las pruebas.

2. Recogida de muestras humanas e identificación de cepas

NOTA: Para el aislamiento de Salmonella de muestras heces humanas, siga los protocolos de confidencialidad del Programa de Vigilancia de Enfermedades transmitidas por Alimentos.

  1. Recolección: Recoger aproximadamente 2 g de muestras de heces humanas recién evacuadas. Coloca las muestras de heces en recipientes limpios, secos y de boca ancha. Transporta las muestras fecales al laboratorio en un plazo de 1 hora utilizando cajas aislantes para mantener la integridad de la muestra.
    PRECAUCIÓN: Las muestras heces humanas pueden contener múltiples patógenos además de Salmonella. Manipular todas las muestras como potencialmente infecciosas y respetar las precauciones estándar para el manejo de materiales de riesgo biológicos.
  2. Inoculación: Inocular las muestras fecales recogidas directamente sobre las siguientes placas selectivas de agar: CHROMagar Salmonella, agar Salmonella-XLD y agar Shigella (SS).
    NOTA: Consulte el paso 1.4 para la morfología característica de la colonia en CHROMagar Salmonella y el agar XLD. En el agar SS, las colonias presuntas de Salmonella suelen aparecer incoloras, opacas o color beige con centros negros. El agar en sí permanece relativamente sin cambios.
  3. Identificación: Identificar colonias sospechosas de Salmonella tal como se describe en el paso 1.5.
  4. Serotipado: Realizar serotipado mediante aglutinación por láminas como se describe en el paso 1.6.

3. Preparación de bibliotecas y secuenciación del genoma completo

  1. Cultivo bacteriano: Raya Salmonella en LB agar, incubar a 37 °C durante 12 horas. Elige una colonia, inocúla en caldo de 200 mL y agita a 150 rpm (37 °C, 12 horas). Centrifugar a 12.000 × g durante 10 minutos para extraer las células.
    NOTA: Realizar todos los pasos de centrifugación con rotores sellados o copas de seguridad para evitar la generación de aerosoles.
  2. Extracción de ADN: Extraer ADN genómico utilizando un kit comercial de extracción de ADN (véase la Tabla de Materiales), siguiendo el protocolo del fabricante.
    PRECAUCIÓN: Los reactivos en los kits comerciales de extracción de ADN (por ejemplo, tampones de lisis, proteinasa K) pueden ser perjudiciales si se inhalan o al entrar en contacto con la piel y los ojos. Realizar la extracción en una campana extractora o en un armario de seguridad biológica si se utilizan reactivos volátiles, y utilice el EPI adecuado.
  3. Evaluación de la calidad del ADN: Purificar el ADN genómico y cuantificar usando un fluorómetro con el kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA. Verificar la integridad del ADN mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 100 V durante 45 minutos; ADN de alta calidad aparece como una sola banda compacta >20 kbp con un mínimode difuminación de 27.
    NOTA: (Paso crítico) El ADN genómico de alta calidad y alto peso molecular (con una relación A260/A280 de ~1,8-2,0) es crucial para la preparación y secuenciación exitosa de la biblioteca.
    PRECAUCIÓN: Los tintes de tinción de ácidos nucleicos usados en la electroforesis en gel de agarosa (por ejemplo, GelRed, bromuro de etidio) son mutagenicos. Siempre lleva guantes al manipular geles y soluciones de mancha, y deséchalos conforme a la normativa institucional sobre residuos peligrosos.
  4. Fragmentación del ADN: Fragmentar aproximadamente 150 ng de ADN genómico cualificado a un tamaño medio de ~350 bp usando un sistema de ultrasonicación enfocada según el protocolo del fabricante.
  5. Construir la biblioteca de secuenciación a partir de los fragmentos de ADN cortados utilizando un kit comercial de preparación de biblioteca (véase la Tabla de Materiales). Realizar la reparación final y la fosforilación 5' de los fragmentos de ADN cortados. Luego, añade una base en 'A' a los extremos de 3' y liga los adaptadores de secuenciación indexados.
  6. Amplifica y enriquece los fragmentos de ADN ligados con adaptador mediante un programa de PCR de ciclo limitado según lo especificado en el kit.
  7. Califique y cuantifique la biblioteca final utilizando métodos como la fluorometría y la electroforesis capilar.
  8. Realizar secuenciación de extremos emparejados (2 × 150 pb) en una plataforma de secuenciación siguiendo los procedimientos operativos estándar.

4. Análisis de datos

  1. Control de calidad de los datos de secuenciación en bruto: Realizar el control inicial de calidad en los archivos FASTQ en bruto usando fastp (versión 0.23.0) con parámetros por defecto. El objetivo es eliminar secuencias de adaptadores y lecturas de baja calidad, generando así datos limpios de FASTQ para análisis posteriores.
  2. Ensamblar las lecturas filtradas de alta calidad en genomas borradores usando SPAdes (versión 3.15.0) con la opción cuidadosa de reducir desajustes y reducir indel26 cortos.
  3. Utiliza las secuencias genómicas (archivos FASTQ / FASTA) como entrada para la predicción de los distintos serotipos.
    1. Para MLST, importa el archivo FASTQ al software BioNumerics (versión 7.6).
      1. En la ventana de Importar plantilla , haz clic en Editar análisis analizable en opciones avanzadas. Configura la cadena de análisis de datos y la decoración de datos en [DATA]. Aplica las expresiones regulares DATA]_* y [DATA] para el análisis de nombres de archivo. Guarda la plantilla, seleccionala y haz clic en Siguiente y luego en Terminar. Confirma la presentación en la ventana de Enviar tarea para subir los datos. La herramienta CEStoreUploader se abrirá automáticamente para transferir los datos en bruto de WGS al motor de cálculo.
      2. Selecciona la entrada del genoma después de subirla. Navega a WGS Tools y selecciona "TraNetGenotype" para una predicción automática de ST. En el cuadro de diálogo TraNetGenotype , selecciona Salmonella como tipo de cepa, selecciona Análisis de serotipos, Análisis de virulencia y Análisis de susceptibilidad antimicrobiana, y haz clic en Sí.
    2. Para SISTR (versión 1.1.3; https://github.com/phac-nml/sistr_cmd; Parámetros: todos los parámetros son por defecto), abre un terminal y navega al directorio que contiene el archivo genómico ensamblado assembly.fasta.
      1. Ejecuta el siguiente comando para realizar la predicción de serovar y generar un informe completo en formato CSV: sistr --qc --alleles-output allele-results.json --cgmlst-profiles cgmlst-profiles.csv -f tab -o sistr-output.tab -i assembly.fasta. Este comando genera un informe que contiene el serovar predicho.
        NOTA: -qc: Realiza controles de calidad en el ensamblaje. -i assembly.fasta: Especifica el archivo FASTA de entrada. -f csv: Define el formato de salida como CSV. -o sistr_results: Establece el nombre base para el archivo de salida (por ejemplo, sistr_results.csv). -p 4: Utiliza 4 hilos de CPU para el análisis y así acelerar el cálculo. --alleles-output: guarda secuencias de alelos e información en un archivo JSON. --cgmlst-profiles: exporta perfiles de alelos cgMLST a un archivo CSV.
    3. Para SeqSero (versión 1.0; https://github.com/denglab/SeqSero; Parámetros: todos los parámetros son por defecto), navega al directorio que contiene el archivo de datos de entrada. Ejecuta el siguiente comando con parámetros predeterminados para el análisis: python SeqSero.py -m 4 -i assembly.fasta. La herramienta crea un directorio de salida que contiene el archivo Seqsero_result.txt con el serotipo predicho.
      NOTA: -m 4 especifica el tipo de entrada como ensamblaje del genoma. -i define el archivo FASTA de entrada.
    4. Para SeqSero2 (versión 1.3.1; https://github.com/denglab/SeqSero2; Parámetros: todos los parámetros son por defecto). Ejecuta el siguiente comando: python3 SeqSero2_package.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. La herramienta envía el serotipo previsto directamente a la pantalla del terminal al finalizar. La salida proporciona el serotipo predicho.
      NOTA: -m k: especifica un flujo de trabajo basado en k-mer para la predicción rápida de serotipos utilizando k-mers únicos de determinantes serotípicos. -t 4: indica el tipo de entrada como secuencias ensambladas.
    5. Para SeqSero2S (versión 1.1.1; https://github.com/denglab/SeqSero2S; Parámetros: todos los parámetros son por defecto): Ejecutarlo usando el script proporcionado: python SeqSero2S.py -m k -t 4 -i assembly.fasta. La salida proporciona el serotipo predicho.
      NOTA: -m k permite el análisis basado en k-mer de lecturas en bruto o ensamblajes genómicos. -t 4 especifica la entrada de secuencia ensamblada.

5. Parámetros críticos y consideraciones prácticas

NOTA: Las siguientes consideraciones son cruciales para la implementación exitosa de este flujo de trabajo genómico, especialmente en entornos con recursos limitados.

  1. Verifica que los datos de secuenciación en bruto alcancen una profundidad de cobertura suficiente. Una profundidad de secuenciación de aproximadamente 100x suele ser suficiente para un análisis de alta calidad.
    NOTA: Para los laboratorios que priorizan la rentabilidad, se recomienda una profundidad mínima de secuenciación de 75x como un umbral práctico inferior para una predicción fiable del serotipo utilizando MLST o SeqSero221.
  2. Confirma que la calidad de las lecturas en bruto es alta, con una puntuación Q30 (precisión base de llamada del 99,9%) típicamente superior al 90%.
  3. Evalúa la calidad del ensamblaje de nuevo del genoma antes de proceder con las herramientas de predicción de serotipos que requieren contigs ensamblados. Usa la estadística N50 como métrica clave.
    NOTA: Se recomienda un N50 de al menos 100 kbp22, mientras que un N50 superior a 30 kbp debe considerarse el requisito mínimo para un análisisfiable 23.
  4. Comprueba la completitud del ensamblaje asegurando una tasa de mapeo de lectura de al menos ≥98% cuando las lecturas filtradas se mapean de nuevo al genoma ensamblado.

6. Protocolo recomendado de predicción de serotipos para vigilancia de salmonela de alto rendimiento

NOTA: Seleccione métodos de predicción de serotipos basados en el contexto de vigilancia, la precisión requerida y los recursos de laboratorio disponibles. Para una vigilancia de alto rendimiento de Salmonella , sigue el protocolo a continuación:

  1. Identificación preliminar: Realizar el cribado inicial conforme a la GB 4789.4 para confirmar que los aislados son especies de Salmonella .
    NOTA: En esta etapa, no es necesario identificar el serotipo específico de los aislados.
  2. Vigilancia rutinaria (modo de alto rendimiento): Para la vigilancia rutinaria, dado que BioNumerics ya no se actualiza, se utiliza MLST28, SeqSero2S u otras plataformas de análisis genómico validadas y fáciles de usar que reciban soporte técnico y actualizaciones continuas.
    NOTA: Para MLST: El esquema de 7 genes ofrece un perfil estandarizado, portátil y filogenéticamente informativo (Tipo de Secuencia, ST) ideal para epidemiología a largo plazo y comparación global de cepas. Su simplicidad garantiza un análisis rápido y una carga computacional mínima. Para SeqSero2S: ofrece la doble ventaja de la predicción rápida de serotipos y resultados MLST integrados en una sola ejecución. Puede analizar directamente las lecturas de secuenciación en bruto, evitando el ensamblaje genómico para ahorrar tiempo y recursos. Incluso con datos FASTA ensamblados, es más rápido que herramientas como SISTR, ya que realiza predicciones de serotipos de forma independiente sin depender del análisis computacional.
  3. Cribado rápido (entornos sensibles al tiempo): Para resultados rápidos o en laboratorios con capacidad computacional limitada, utilice SeqSero2S para la predicción preliminar del serotipo.
    NOTA: Al realizar predicciones de SeqSero2S, básicamente se recomienda interpretar "I_4,[5],12:i:-" como Salmonella Typhimurium.
  4. Investigación de brotes (modo de alta precisión): Para el rastreo de brotes que requiere alta resolución, utilice SISTR, que utiliza cgMLST para complementar la predicción de serotipos y para proporcionar análisis de clústeres de alta resolución para el rastreo de fuentes.
  5. Control de calidad y confirmación de resultados inconsistentes:
    1. Para cepas comunes de secuenciación, realiza una verificación aleatoria. Para los no comunes, utiliza una tasa de verificación del 20%. En casos de resultados de serotipado inconsistentes, se derivan los aislados a un laboratorio de nivel superior o de referencia para obtener un resultado definitivo.
    2. Para el análisis confirmatorio, emplear múltiples métodos validados, incluyendo: análisis genómico repetido con al menos dos herramientas diferentes de predicción in silico ; repetido en sílice con al menos dos herramientas diferentes; contextualización filogenética utilizando métodos basados en WGS de alta resolución (por ejemplo, cgMLST o análisis SNP del genoma completo)29.
    3. Asigna el serotipo final basándose en el consenso de esta evidencia exhaustiva.
      NOTA: La razón de verificación recomendada del 20% para los serotipos no comunes se basa en la observación de que las herramientas genómicas mantienen una alta concordancia (93,3% para SISTR vs. MLST, 95,0% para SISTR vs. SeqSero2S) incluso entre serotipos no comunes (Tabla 1). Este umbral es rentable y proporciona un margen de seguridad suficiente para detectar la baja frecuencia de discrepancias entre herramientas genómicas en la vigilancia rutinaria.

7. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis de datos usando el software R (versión 4.1.2).
  2. Presenta variables categóricas como frecuencias con porcentajes.
  3. Comparando grupos que utilizan pruebas χ2 para datos categóricos30, considera un valor P <0,05 como estadísticamente significativo.

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Resultados

El protocolo fue validado utilizando 315 aislados de Salmonella del suroeste de China, con 213 aislados (2/3) que sirvieron como conjunto de entrenamiento para comparar cinco métodos de predicción de serotipos basados en WGS (MLST, SISTR, SeqSero, SeqSero2 y SeqSero2S) con resultados convencionales de serotipado, mientras que los 102 aislados restantes (1/3) se utilizaron como conjunto de validación para evaluar el desempeño de MLST, SISTR y SeqSero2S.

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Discusión

Esta evaluación a gran escala, que abarca 315 aislados de Salmonella del suroeste de China, demuestra la superior reproducibilidad de los métodos de serotipado basados en WGS en comparación con los enfoques convencionales (84,1% frente a 62,9% de cobertura, P<0,001). Nuestros hallazgos validan un flujo de trabajo genómico integral donde los pasos iniciales críticos de preparación de muestras y control de calidad del ADN (secciones 1-3) afectan directamente a la fiabilidad poster...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Oficina de Ciencia y Tecnología del Tíbet y Sichuan (XZ202301ZY0049G, 2024NSFSC0563 a H.Z. y 2024NSFSC0033 a X.P.), el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2024JDRC0032 a Y.X.), el Proyecto del Instituto de Salud Nueva Productividad (HN240302C a H.Z.), el Proyecto de Revitalización Disciplinar de Ciencias Laboratorio de Salud Pública (2023SY-04 a H.Z.), Escuela de Salud Pública de China Occidental/Cuarto Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BioNumerics (versión 7.6)Matemáticas Aplicadashttps://bionumerics.software.informer.com/7.6/MLST/predicción de serotipos/análisis filogénico
CHROMagar SalmonellaBecton, Dickinson y Compañía214983Medio cromogénico selectivo de Salmonella
Fastp (versión 0.23.0)Código abiertohttps://github.com/OpenGene/fastpLee control de calidad
Sistema de secuenciación Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Plataforma de secuenciación de genoma completo
Ultrasonicador enfocado M220Covaris500295Cizallamiento de ADN
Kit de ADN rápido para magbeads para sueloMP BiomedicinaMP116560200Kit de extracción de ADN genómico
Microsoft Excel 2016MicrosoftKB5002794Gestión de datos
Kit rápido de DNA-Seq NEXTFLEXRevvity50-255-1124Preparación de bibliotecas de secuenciación
Fluorómetro Qubit 2.0Thermo Fisher ScientificP32866Cuantificación del ADN
Kit de ensayo de alta sensibilidad dsDNA de QubitThermo Fisher ScientificP32851Cuantificación del ADN
R (versión 4.1.2)Fundación Rhttps://www.r-project.org/Computación estadística
Kit de antisuero contra la salmonelaInstituto del Suero Statens60898Detección de antígenos O/H
SeqSeroCódigo abiertohttps://github.com/denglab/SeqSeroPredicción del serotipo
SeqSero2Código abiertohttps://github.com/denglab/SeqSero2Predicción del serotipo
SeqSero2SCódigo abiertohttps://github.com/denglab/SeqSero2sPredicción del serotipo
SISTRCódigo abiertohttps://github.com/phac-nml/sistr_cmdPredicción del serotipo
SPAdes (versión 3.15.0)Código abiertohttps://github.com/ablab/spadesEnsamblaje genómico
Agar de enjambreBD Biociencias211519Utilizado para la incubación por serotipado
TBS-380 FluorómetroTurner BioSystemsP/N 3800-003Cuantificación del ADN
Sistema compacto VITEK 2BioMé rieux95061-768Sistema automatizado de identificación microbiana

Referencias

  1. GBD 2017 Non-Typhoidal Salmonella Invasive Disease Collaborators. The global burden of non-typhoidal Salmonella invasive disease: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet Infect Dis. 19 (12), 1312-1324 (2019).
  2. Selim, S. A. A comprehensive review of antibiotic susceptibility patterns in strains isolated from food. J Pure Appl Microbio. 19 (2), 818-833 (2025).
  3. Shen, Y., et al. Genomic investigation of Salmonella enterica serovar Welikade from a pediatric diarrhea case first time in Shanghai, China. BMC Genomics. 25 (1), 604(2024).
  4. Pulford, C. V., et al. Global diversity and evolution of Salmonella enterica serovar Panama: a genomic epidemiology study. Lancet Microbe. 6 (9), 101150(2025).
  5. Hong, H., et al. Genetic characterization and in silico serotyping of 62 Salmonella enterica isolated from Korean poultry operations. BMC Genomics. 26 (1), 166(2025).
  6. Kitchens, S. R., Wang, C., Price, S. B. Bridging classical methodologies in Salmonella investigation with modern technologies: a comprehensive review. Microorganisms. 12 (11), 2249(2024).
  7. Uelze, L., et al. Performance and accuracy of four open-source tools for in silico serotyping of Salmonella spp. based on whole-genome short-read sequencing data. Appl Environ Microbiol. 86 (5), e02265-e02319 (2020).
  8. Wang, B. X., et al. High-throughput fitness experiments reveal specific vulnerabilities of human-adapted Salmonella during stress and infection. Nat Genet. 56 (6), 1288-1299 (2024).
  9. Kumar, S., Kumar, Y., Kumar, G., Kumar, G., Kasana, D. A highly drug-resistant Salmonella enterica serovar Weltevreden of human origin from India and detection of its virulence factors. Indian J Microbiol. 65 (3), 1384-1394 (2025).
  10. Lu, Y., et al. Advances in whole genome sequencing: methods, tools, and applications in population genomics. Int J Mol Sci. 26 (1), 372(2025).
  11. Mukherjee, S., et al. Increasing frequencies of antibiotic resistant non-typhoidal Salmonella infections in Michigan and risk factors for disease. Front Med (Lausanne). 6, 250(2019).
  12. Yachison, C. A., et al. The validation and implications of using whole genome sequencing as a replacement for traditional serotyping for a national Salmonella reference laboratory. Front Microbiol. 8, 1044(2017).
  13. Zhang, S., et al. Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data. J Clin Microbiol. 53 (5), 1685-1692 (2015).
  14. Zhang, S., et al. SeqSero2: rapid and improved Salmonella serotype determination using whole-genome sequencing data. Appl Environ Microbiol. 85 (23), e01746-e01819 (2019).
  15. Deng, X., et al. Salmonella serotypes in the genomic era: simplified Salmonella serotype interpretation from DNA sequence data. Appl Environ Microbiol. 91 (3), e0260024(2025).
  16. Cui, Q., et al. Characterization and implications of the regionally prevalent ST8333 strains of Salmonella enterica serotype 4,[5],12:i: - China, 2017-2023. China CDC Wkly. 6 (47), 1232-1235 (2024).
  17. Yoshida, C. E., et al. The Salmonella In Silico Typing Resource (SISTR): an open web-accessible tool for rapidly typing and subtyping draft Salmonella genome assemblies. PLoS One. 11 (1), e0147101(2016).
  18. Ikeuchi, S., et al. Molecular epidemiological analysis of Salmonella Schwarzengrund isolated in Japan by newly developed multi-locus variable-number tandem repeat analysis method. Lwt. 207, 116593(2024).
  19. Kong, X., et al. Emergence of extensively drug-resistant Salmonella Kentucky ST198 in Southwest China. J Glob Antimicrob Resist. 43, 264-270 (2025).
  20. Davedow, T., et al. PulseNet international survey on the implementation of whole genome sequencing in low and middle-income countries for foodborne disease surveillance. Foodborne Pathog Dis. 19 (5), 332-340 (2022).
  21. Xian, Z., et al. Subtyping evaluation of Salmonella Enteritidis using single nucleotide polymorphism and core genome multilocus sequence typing with nanopore reads. Appl Environ Microbiol. 88 (15), e0078522(2022).
  22. Liu, C. C., Hsiao, W. W. L. Machine learning reveals the dynamic importance of accessory sequences for Salmonella outbreak clustering. mBio. 16 (3), e0265024(2025).
  23. Fourteenth external quality assessment for Salmonella typing. , European Centre for Disease Prevention and Control. ECDC, Stockholm. (2025).
  24. Gomes, E., et al. Advances in whole genome sequencing for foodborne pathogens: implications for clinical infectious disease surveillance and public health. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1593219(2025).
  25. Zhou, L., et al. Antimicrobial resistance and genomic investigation of Salmonella isolated from retail foods in Guizhou, China. Front Microbiol. 15, 1345045(2024).
  26. Zuo, H., et al. Comparative genomic and antimicrobial resistance profiles of Salmonella strains isolated from pork and human sources in Sichuan, China. Front Microbiol. 16, 1515576(2025).
  27. Feehan, J. M., et al. Purification of high molecular weight genomic DNA from powdery mildew for long-read sequencing. J Vis Exp. (121), e55463(2017).
  28. Jolley, K. A., Bray, J. E., Maiden, M. C. J. Open-access bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications. Wellcome Open Res. 3, 124(2018).
  29. Yang, L., et al. Phylogeny and divergence of the 100 most common Salmonella serovars available in the NCBI Pathogen Detection database. Front Microbiol. 16, 1547190(2025).
  30. Zuo, H., et al. High-altitude exposure decreases bone mineral density and its relationship with gut microbiota: results from the China multi-ethnic cohort (CMEC) study. Environ Res. 215 (Pt 2), 114206(2022).
  31. Arrieta-Gisasola, A., et al. Genotyping study of Salmonella 4,[5],12:i:- monophasic variant of serovar Typhimurium and characterization of the second-phase flagellar deletion by whole genome sequencing. Microorganisms. 8 (12), 2049(2020).
  32. De Sousa Violante, M., et al. Genomic diversity of Salmonella Typhimurium and its monophasic variant in pig and pork production in France. Microbiol Spectr. 12 (12), e0052624(2024).
  33. Kong, X., et al. Phenotypic and genotypic characterization of Salmonella Enteritidis isolated from two consecutive food-poisoning outbreaks in Sichuan, China. J Food Safety. 43 (1), e13015(2022).
  34. Hong, W., et al. Integrating serotyping, MLST, and phenotypic data: decoding the evolutionary drivers of Salmonella pathogenicity and drug resistance. Appl Environ Microbiol. 91 (10), e0151125(2025).
  35. Lin, A., et al. Targeted next-generation sequencing assay for direct detection and serotyping of Salmonella from enrichment. J Food Prot. 87 (4), 100256(2024).
  36. van den Berg, O. E., et al. Ongoing increase in autochthonous Salmonella Enteritidis infections, the Netherlands, June 2023 to June 2025. Euro Surveill. 30 (30), 2500536(2025).
  37. Li, X., Oladeinde, A., Rothrock, M. Jr, Chung, T. J., Ghazi Al Hakeem, W. Using core genome and machine learning for serovar prediction in Salmonella enterica subspecies I strains. FEMS Microbiol Lett. 372, fnaf040(2025).
  38. Krüger, G. I., et al. Adaptive signatures of emerging Salmonella serotypes in response to stressful conditions in the poultry industry. Lwt. 215, 117188(2025).
  39. Gou, J., et al. Microbial biomarkers and sex-associated gut microbiota characteristics of thyroid cancer. BMC Cancer. 25, 1688(2025).
  40. Meng, J., et al. Medical laboratory data-based models: opportunities, obstacles, and solutions. J Transl Med. 23 (1), 823(2025).
  41. Wu, X., et al. Evaluation of multiplex nanopore sequencing for Salmonella serotype prediction and antimicrobial resistance gene and virulence gene detection. Front Microbiol. 13, 1073057(2022).

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