Modelo de amputación de la extremidad posterior de rata por debajo de la rodilla y reinervación muscular dirigida inmediata

Resumen

Este protocolo demuestra cómo realizar una amputación por debajo de la rodilla en ratas y realizar inmediatamente la inervación muscular dirigida (iTMR) para investigar estrategias que traten y previenen el dolor relacionado con la amputación y para comprender mejor los mecanismos del dolor asociados a la amputación.

Resumen

El dolor relacionado con la amputación reduce la calidad de vida del paciente, contribuye al consumo de opioides y puede disminuir la rehabilitación funcional y el uso de prótesis. Los modelos preclínicos que producen de forma fiable dolor tras la amputación mientras mantienen la movilidad son esenciales para estudiar los mecanismos biológicos subyacentes a estos resultados. Aquí presentamos un protocolo quirúrgico detallado y reproducible para roedores utilizando ratas Sprague-Dawley para modelar amputaciones de la extremidad posterior por debajo de la rodilla. El procedimiento consiste en aislar y transectar las ramas del nervio ciático, incluyendo los nervios tibial, peroneo común y sural, produciendo patologías nerviosas post-amputación sostenidas y comportamientos relacionados con el dolor. Las ratas se recuperan bien de este procedimiento y pueden caminar inmediatamente después de la operación sin dificultad para comer o beber. Posteriormente, los animales pueden ser evaluados mediante medidas de dolor reflexivas y espontáneas. Los comportamientos de dolor resultantes de este procedimiento son robustos con el tiempo, y los comportamientos reflexivos estándar del dolor pueden obtenerse en el muñón. Es importante destacar que la movilidad preservada permite realizar pruebas conductuales longitudinales sin causar problemas motores. Aunque este protocolo se centra en la amputación, puede adaptarse fácilmente para incorporar la reinnervación muscular dirigida (TMR) como intervención post-amputación, coaptando nervios transectados con ramas motoras cercanas de los nervios al bíceps femoral y semimembranoso, permitiendo investigar intervenciones de reinnervación y sus efectos sobre el dolor post-amputación. Hemos utilizado con éxito este modelo anteriormente para evaluar diferencias específicas de sexo en comportamientos de dolor tras la amputación y para estudiar los efectos de la TMR. Este protocolo proporciona una plataforma robusta y flexible para investigar el dolor relacionado con la amputación, la formación de neuromas y los resultados funcionales, con aplicabilidad a estudios traslacionales destinados a mejorar el dolor tras la amputación.

Introducción

El dolor crónico es una de las complicaciones más incapacitantes tras una amputación mayor de extremidades, afectando hasta al 70% de los^{pacientes 1,2,3}. Las estrategias convencionales de manejo del dolor, como intervenciones farmacológicas, fisioterapia, bloqueos nerviosos y terapias psicológicas, suelen proporcionar un alivio limitado o^{transitorio 4}. Por tanto, sigue existiendo una necesidad clínica significativa de estrategias eficaces de manejo del dolor a largo plazo.

La reinervación muscular dirigida (TMR), desarrollada inicialmente para mejorar el control de las prótesis mioeléctricas, ha surgido como un enfoque prometedor para aliviar el dolor tras la amputación de la^{extremidad 5}. La técnica quirúrgica consiste en redirigir nervios mixtos motor-sensoriales transectados hacia ramas motoras cercanas. Clínicamente, la TMR ha mostrado reducciones sustanciales en el dolor de extremidad fantasma, dolor residual de la extremidad y síntomas relacionados con^{el neuroma 6,7,8}. Las interfaces regenerativas de nervios periféricos (RPNI) son otra intervención quirúrgica utilizada para lesiones nerviosas y dolor relacionado con amputaciones. Los extremos nerviosos amputados se cosen y luego se envuelven en un injerto muscular libre (desnervado, avascular^{) 9}. Los axones amputados neurotizan las uniones neuromusculares denervadas para crear contracción muscular en el injerto que puede usarse para crear una señal de control de la mioprótesis. A diferencia de la TMR, el RPNI ha sido estudiado extensamente en un modelo de roedor. Al igual que la TMR, se ha demostrado que el RPNI previene la formación de neuromas y reduce el dolor asociado a la lesión por transección^{nerviosa 10,11}. Clínicamente, se ha demostrado que el RPNI reduce tanto el dolor fantasma como el residual en las extremidades^{amputadas 12}.

A pesar de la adopción clínica, los mecanismos biológicos subyacentes a los efectos analgésicos de la TMR y el RPNI siguen siendo poco comprendidos. Los modelos preclínicos son cruciales para esclarecer estos mecanismos. Trabajos previos han utilizado modelos de transección nerviosa con modificaciones para superficializar el nervio y así evaluar directamente el dolor^{neuroma 10,11}. Estos modelos pueden cuantificar el dolor neuromato con estimulación directa y el dolor neuropático evaluando los comportamientos del reflejo espinal en la distribución nerviosa intacta que permanece en el pie. La lesión nerviosa preservada, por ejemplo, mantiene el nervio sural, y los nervios tibial y peroneo común son transectados. La prueba de comportamiento del dolor se realiza en el pie^{lateral 13}. El modelo de amputación de la extremidad posterior representa la lesión más grave posible en la extremidad. Por ello, existe una pérdida neuronal generalizada y las importantes exigencias inflamatorias y de curación asociadas a una lesión de ese tipo. Cuando hay una lesión nerviosa, las neuronas sanas del DRG ayudan a mantener las neuronas lesionadas. Con la amputación, la población de neuronas sanas disponibles se reduce considerablemente, y por cada nervio lesionado hay una mayor pérdida neuronal que si solo un nervio hubiera sido^lesionado 14,15,16. Los informes previos de cirugía de supervivencia por amputación de extremidades posteriores en roedores son^{raros 17,18}. Sin embargo, existen ventajas frente a una amputación de extremidad superior, como la abundancia de datos históricos que examinan el dolor y la regeneración relacionados con el nervio ciático, así como múltiples pruebas conductuales^{ambulatorias 19,20}.

Para abordar esta brecha, desarrollamos recientemente un modelo de amputación de la extremidad posterior de rata que incorpora TMR inmediata (Figura 1). La técnica para la creación de RPNI ha sido publicada previamente y puede adaptarse al modelo²¹ de amputación de la extremidad posterior. Este modelo refleja de cerca los procedimientos clínicos, permitiéndonos evaluar diversos comportamientos de dolor, formación de neuromas y preservación neuronal (Figura 2)^22. Nuestro trabajo ha demostrado beneficios analgésicos significativos para la TMR frente a la amputación estándar, prevención de neuromas y respuestas sexualmente dimórficas en sensibilidad al^{frío 22,23}.

El protocolo presentado aquí ofrece una demostración visual detallada y estandarizada de la técnica quirúrgica, asegurando la reproducibilidad y la consistencia en los enfoques experimentales. Al ilustrar claramente los pasos clave, incluyendo el aislamiento nervioso, la transección precisa y la coaptación nerviosa libre de tensión, este protocolo ofrece a los investigadores un marco sólido para investigar los mecanismos subyacentes a la analgesia mediada por TMR y la prevención de neuromas.

Protocolo

Todos los procedimientos animales deben ser aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) y cumplir con la Guía de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

1. Preparación preoperatoria

NOTA: Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho y hembra (Charles River Laboratories), de entre 8 y 10 semanas y con un peso de 250 a 300 g.

1. Enciende la almohadilla eléctrica y prepara un campo quirúrgico estéril. Coloca una almohadilla estéril perpendicular al cuerpo de la rata para una exposición óptima.
2. Organizar todas las herramientas y materiales quirúrgicos: solución salina estéril (0,9% cloruro de sodio), solución antiséptica povidona-yodo, meloxicam, cauterización, microsutura 10-0, suturas trenzadas absorbibles 4-0, regla y adhesivo cutáneo.
   NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados mediante autoclave o esterilización con perlas calientes.
3. Induce anestesia colocando a la rata en una cámara de inducción con un 4% de isoflurano, osígeno a 10 L/min y aire al 60%. Después de 4 minutos o una vez que no responda, cambia a un cono nasal y ajusta el isoflurano al 1,5%–2,0% dependiendo del tamaño de la rata.
4. Afeita el lugar quirúrgico desde la parte baja de la espalda hasta toda la extremidad trasera. Realiza una preparación triple con solución antiséptica alternada de povidona-yodo y muestras de alcohol, terminando con alcohol.
5. Administrar 1 mg/kg de meloxicam por vía subcutánea usando una jeringuilla de tuberculina (normalmente 0,2 mL para una rata de 200 g).

2. Amputación por debajo de la rodilla (Figura 1)

1. Utiliza una regla para marcar la línea de la articulación de la rodilla y haz dos marcas adicionales a 2 cm y 3 cm distales a la rodilla.
2. Haz una incisión cutánea circunferencial de 3 cm distal a la rodilla usando un bisturí.
3. Utiliza una disección contundente y aguda para separar la piel circunferencialmente de la musculatura subyacente hasta que se retrae libremente.
4. Repite este proceso de socavación con los músculos subyacentes, diseccionando cuidadosamente hasta el hueso mientras se preservan los planos del tejido. Marca la tibia/peroné 1 cm proximal a la incisión circunferencial utilizando una cauterización o marcador estéril.
5. Utiliza unas tijeras óseas pequeñas para seccionar la tibia y el peroné en la ubicación marcada. Utiliza cauterización para lograr la hemostasia. Examina el extremo óseo en busca de bordes afilados y embota o recorta según sea necesario.
6. Utilizando una sutura trenzada absorbible 4-0, cierra los compartimentos musculares anterior y posterior sobre el hueso para crear una almohadilla muscular. Comienza suturando el borde delantero sobre la tibia, el punto de presión principal. Normalmente, se utilizan entre 4 y 6 suturas interrumpidas.
7. Cierra la piel lateralmente con suturas trenzadas absorbibles 4-0 interrumpidas, evitando colocarlas directamente sobre el muñón que soporta el peso. Aplica adhesivo cutáneo a lo largo de la línea de la incisión.

3. Cirugía de intervención TMR (Figura 1)

1. Realizar una incisión longitudinal de 1,5–2 cm de división glútea aproximadamente 5 mm a posterioría al fémur.
2. Utiliza una disección contundente para separar los músculos glúteo e isquiotibial, exponiendo el nervio ciático justo proximal a su trifurcación en los nervios tibial, peroneo común (PC) y sural.
3. Identificar ramas motoras proximales: una rama grande pasa por debajo de la caudofemoral (CFM), dando lugar a la rama CFM, semimembranosa (SM) y bíceps femoral (BF).
4. Eleva el CFM con un hisopo de algodón y divídelo. Neurolisa cuidadosamente las ramas SM y BF con disección roma bajo un microscopio quirúrgico utilizando pinzas finas de Dumont microquirúrgicas.
   1. Utiliza pinzas para coger el epineurio y, con unas finas tijeras curvas de resorte, abre el epineurio y divídelo longitudinalmente, separando las diferentes ramas entre sí.
   2. Preserva la rama CFM y divide las demás cerca del tronco ciático. El motor curvo se ramifica hacia abajo para facilitar la coaptación.
5. Neurolisa la trifurcación ciática abriendo el epineurio y dividiéndolo con finas tijeras curvas de resorte. Separar suavemente las ramas nerviosas con pinzas finas. Agarra cada una de las tres ramas (CP, tibial, sural) a 5–10 mm distales de la trifurcación usando pinzas.
6. Coloca tensión y transecta cada nervio lo más distalmente posible. Sujetando el extremo distal cortado, realiza un corte limpio hasta el extremo proximal extirpando al menos 5–10 mm.
7. Realiza las coaptaciones con sutura 10-0 de nailon: la CP a SM usando una sutura, tibial a la rama BF grande usando una o dos suturas, y sural a la rama BF pequeña usando una sutura. Utiliza al menos 3 nudos por sutura, asegura una colocación sin tensión, evita apretar lo suficiente como para arrugar el nervio y traza las coaptaciones sin angulaciones bruscas.

4. Grupo solo de amputación

1. Liga los nervios PC, tibial y sural usando una sutura de seda 5-0. Manipula la seda con pinzas de sutura Dumont para atar la fibra. Asegúrate de que la ligadura pliegue el nervio y quede asegurada con 4 nudos cuadrados.
2. Tira suavemente de cada nervio proximalmente usando el nudo y transecta 1–2 mm distal a la ligadura. Retira 10 mm del segmento del nervio distal.
3. Proceda con la amputación según se detalla en la sección 2.

5. Cuidados postoperatorios

1. Devuelve a la rata a una jaula calentada hasta que esté en marcha. Administrar una segunda dosis de meloxicam (0,2 mL) por vía subcutánea 24 horas después.
2. Vigila diariamente durante 7 días la integridad de la herida, signos de infección, dolor o malestar, e interviene según sea necesario según las directrices de la IACUC.

Resultados

Este modelo de amputación de la extremidad posterior indujo de forma fiable comportamientos neuropáticos relacionados con el dolor mientras preservaba la capacidad de deambulación y exploración en ratas. Como se muestra en la Figura 2, la transección del nervio periférico durante la amputación sin un objetivo distal resulta en un crecimiento axonal desorganizado y la formación de neuromas en el sitio de ligación, visualizado mediante inmunotinción de B-tubul...

Discusión

Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos esenciales para garantizar la reproducibilidad del modelo de amputación de la extremidad posterior y demuestra la preservación de la deambulación y el compromiso conductual en las pruebas posteriores a la amputación. Se enfatizan principios quirúrgicos clave, incluyendo la identificación anatómica cuidadosa, la manipulación mínima de los nervios y el manejo sin tensión de los nervios seccionados, para garantizar la consistencia y reproducibili...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)	AROSurgical	T04A10N07-13	Sutura de coaptación nerviosa fina. Micro sutura 10-0.
4-0 polyglycolic acid suture	Ethicon	AQ1268	Sutura de cierre para músculo y piel. Sutura absorbible 4-0.
5-0 silk surgical suture	Generic	Generic	Sutura para ligadura de nervios
Adult Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories	Generic	Animal experimental
Alcohol prep pads	Dukal Corporation	Generic	Antiséptico para la piel
Betadine 10%	Avrio Health LP	Generic	Antiséptico
Bone scissors	FST	16030	Instrumento de corte de hueso
Cautery device	FST	18010-00	Dispositivo de hemostasia
Cotton tip applicator (ProAdvantage)	ProAdvantage	Ref 76100	Manipulación de tejido
Curved microdissector scissors	FST	15019-10	Tijeras finas para neurolisis
Forceps (fine Dumont)	FST	11254-20	Instrumento para manejo de nervios
Forceps (suture tying Dumont)	FST	11063-07	Instrumento para manejo de suturas
Gauze USP type VII (Cardinal Health)	Cardinal Health	Ref 2146	Mantiene el campo estéril
Heating pad warmer (TC1000 temperature controller)	Generic	TC1000	Dispositivo de control de temperatura
Induction chamber (Braintree Scientific)	Braintree Scientific Inc.	Generic	Para la inducción de la anestesia
Isoflurane (Isospire)	Phoenix	Generic	Agente anestésico
Meloxicam (Ostilox)	VetONE	5 mg/mL	Agente analgésico
Ruler	Generic	Generic	Instrumento de medición para puntos anatómicos
Sterile saline	Baxter	0.9 Sodium Lot Y425131	Solución de irrigación
Surgical blade 15	FST	10015-00	Herramienta para incisión de piel
Tuberculin syringe	Generic	Generic	Administración de medicación
Vaporizer (Surgivet model 100)	Surgivet	Model 100 S/N W2211123	Para el mantenimiento de la anestesia
Vetbond tissue adhesive	World Precision Instruments	Generic	Adhesivo para la piel