Producción eficiente de células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR) con transgenes superiores a 10 kb utilizando vectores lentivirales

Resumen

Aquí presentamos un flujo de trabajo optimizado para producir células T del Receptor de Antígenos Quiméricos (CAR) con transgenes grandes que superan los 10 kb utilizando vectores lentivales.

Resumen

La ingeniería de múltiples receptores en células T de receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha surgido como una estrategia poderosa para prevenir la recaída negativa en antígenos y reducir las toxicidades en el objetivo y fuera del tumor. Sin embargo, la fabricación de células T CAR multirreceptoras sigue siendo un reto, ya que aumentar el tamaño de los transgenes lentivirales reduce significativamente los títulos virales y las tasas de transducción de células T. Los flujos de trabajo de producción actuales a menudo dependen de la clasificación de celdas para enriquecer células T transducidas a partir de producciones de bajo rendimiento. Sin embargo, las técnicas de clasificación de celdas no aumentan el número absoluto de células T CAR ni añaden mayor complejidad al ya elaborado proceso de fabricación. En consecuencia, estas limitaciones dificultan la traducción clínica de las células CAR T multirreceptor y restringen el desarrollo de inmunoterapias de próxima generación.

Aquí presentamos un flujo de trabajo detallado y paso a paso optimizado para generar células CAR T con transgenes lentivirales grandes. Utilizando este flujo de trabajo, demostramos aumentos en la eficiencia de la transducción dependientes del tamaño en una variedad de tamaños de transgens, con la mejora más pronunciada de hasta 14,8 veces observada para un vector lentiviral de 10,1 kb. Es importante destacar que el flujo de trabajo soporta una expansión robusta de células T y elimina la necesidad de ordenar celdas. Al superar las limitaciones de tamaño actual en la transferencia génica lentiviral, este flujo de trabajo permite la generación eficiente de células CAR T multirreceptoras, facilitando así el desarrollo de inmunoterapias avanzadas.

Introducción

Las células T del receptor de antígenos quiméricos (CAR) han revolucionado el campo de la inmunoterapia. Sin embargo, a pesar de su notable éxito, persisten desafíos críticos, incluyendo la inmunosupresión mediada por el microambiente tumoral (TME), recaídas tumorales negativas a antígenos y toxicidades en el objetivo y fuera del tumor ^1,2. Diseñar células CAR T con múltiples receptores sintéticos, como CARs duales, constructos combinados de CAR y TCR, o receptores de conmutación de citocinas, tiene el potencial de superar estos^{obstáculos 3,4}. En los cánceres de sangre, equipar las células T efectoras con doble CARs permite la selección simultánea de dos antígenos distintos, como CD19 y CD20⁵, reduciendo así el riesgo de escape de antígenos tumorales. En tumores sólidos, las toxicidades on-target y off-tumor pueden mitigarse incorporando, por ejemplo, circuitos sintéticos de receptores Notch (synNotch) que permiten la expresión de CAR lógicamente controlada y mejoran la precisión de puntería 6,7,8,9,10,11,12,13 . Sin embargo, la producción de células CAR T que transportan múltiples receptores sigue siendo un reto debido al aumento subyacente del tamaño del transgénico. Los vectores lentivirales autoinactivantes de tercera generación derivados del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 son el estándar de oro actual para la producción de células CAR T a escala de investigación y^{clínica 14}. Para generar células T CAR, los vectores lentivirales se diseñan con casetes de expresión CAR personalizados flanqueados por secuencias de repetición terminal larga (LTR), que median la integración en el genoma de las células T. La capacidad máxima efectiva de empaquetado (EPC) de los vectores lentivirales actuales es aproximadamente de 9,2 kilobases (kb) de LTR a LTR, correspondiente al tamaño genómico nativo del VIH-1. A medida que los títulos lentivirales disminuyen semi-logarítmicamente con el aumento de la longitud del vector¹⁵, la ingeniería de transgenes grandes con múltiples receptores reduce drásticamente los rendimientos de producción lentiviral y, en última instancia, dificulta la fabricación de células CAR^{T 16}. Aunque las técnicas de clasificación de celdas, como la clasificación de células activadas por energía magnética o fluorescente (MACS o FACS, respectivamente), pueden utilizarse para enriquecer células T CAR a partir de producciones de bajo rendimiento, estos métodos no aumentan el número absoluto de células T CAR ni añaden mayor complejidad a un proceso de fabricación ya elaborado. Como resultado, los desafíos en la fabricación de células CAR T con transgenes lentivirales grandes siguen siendo una barrera importante tanto para la investigación preclínica como para la aplicación clínica.

Recientemente establecimos un flujo de trabajo de producción de células CAR T optimizado para células T efectoras que portan grandes transgenes lentivirales, como el sistema synNotch (svsNotch) de vector^{único 17}. Aquí, detallamos la metodología en un protocolo paso a paso para facilitar su adopción general. Como prueba de concepto, demostramos mejoras dependientes del tamaño en la eficiencia de la transducción a través de tamaños de transgenes lentivirales que van desde 5,7 kb hasta 9,2 kb y 10,1 kb. En conjunto, este flujo de trabajo optimizado mejora las tasas de transducción hasta 14,8 veces, eliminando así la necesidad de ordenar células y permitiendo la generación eficiente de células T efectoras con tamaños de transgenes superiores a 10 kb.

Protocolo

Las células T humanas se obtuvieron a través del Núcleo de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania, que opera bajo los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio con procedimientos operativos estándar establecidos y/o protocolos para la recepción, procesamiento, congelación y análisis de muestras que cumplen con las directrices éticas de MIATA y la Universidad de Pensilvania.

NOTA: En la Figura 1 se muestra una visión esquemática del flujo de trabajo optimizado para la producción de lentivirus y células CAR T. Una comparación de los pasos clave de optimización con el flujo de trabajo estándar actual se resume en la Tabla 1. Todos los cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 utilizando un Medio de Células T (MTC) compuesto por RPMI-1640 suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor (FBS), 10 mM de tampón HEPES, 2 mM de L-alanil-L-glutamina (véase Tabla de Materiales), 100 U/mL penicilina y 100 U/mL de estreptomicina.

Figura 1: Flujo de trabajo optimizado para la producción de lentivirus y células CAR T con transgenes grandes. Representación esquemática de la producción de lentivirus (arriba) y generación de células CAR T (abajo), destacando pasos clave y optimizaciones que mejoran los títulos virales y la eficiencia de la transducción. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

		Flujo de trabajo estándar	Flujo de trabajo optimizado
Virus	Envoltura viral	VSV-G	Cocal-G
	Transfección	L2000	L30001
	Cosecha de LV	24 h2 + 48h 2	30-36 h3
Lenza T	Buque	Matraz T25	Placa inferior plana de 96 pozos
	Relación superficie/volumen	Variable	5,12 cm2/mL4
	Adyuvante	Ninguno	SF1085
13 μL L3000 por cada 1 μg de ADN, sin cambio de medio
2centrifugación a 106.800 x g para 2,5 h, tubo de fondo redondo
3centrifugación a 12.300 x g durante la noche, tubo cónico de fondo
4Suplementación adicional de medios tras la transducción
555 μg/mL

Tabla 1: Comparación entre flujos de trabajo estándar y optimizados. Optimizaciones clave del flujo de trabajo mejorado en comparación con el flujo de trabajo estándar actual. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Rommel et ^al.17.

1. Producción de lentivirus

1. Mantenimiento de las HEK293T celdas
   1. Asegúrate de que HEK293T células estén distribuidas uniformemente, libres de grumos y con una confluencia del 50-70% (rendimiento típico: 1,0-1,5 × 10⁷ células por matraz T150).
   2. Aspira el sobrenadante, añade 20 mL de PBS a temperatura ambiente (RT) en la parte superior del matraz para evitar que las células se desplacen, gira suavemente PBS sobre las células y aspira el lavado.
   3. Añade 3 mL de tripsina-EDTA al 0,05% e incuba durante 15-30 segundos en RT mientras inclinas el matraz de lado a lado. Vigila el desprendimiento de celdas.
   4. Añade 7 mL de MTC fría, resuspende las células contra el fondo del matraz para generar una suspensión de celda única y transfiere a un tubo de 50 mL. Lava el frasco con 10-20 mL de MTC frío y añade el lavado al mismo tubo.
   5. Centrifugar las células (300 × g, 5 min, 4 °C), aspirar el sobrenadante, resuspender 10 mL de MTC y contar las células.
   6. Placar HEK293T células en matrazas T150 a 3 × 10⁶ celdas por matraz para pasar cada 2 días (por ejemplo, lunes y miércoles) o a 1 ×^{10 6} células por matraz para pasar cada 3 días (por ejemplo, emplatado el viernes para el paso durante el fin de semana) usando 30 mL de MTC precalentado a 37 °C.
2. Transfección de células HEK293T para la producción de lentivirus
   NOTA: Realiza un pequeño experimento piloto para determinar la densidad de siembra que produce consistentemente una confluencia del 70-80% tras 2 días. Asegúrese de que HEK293T confluencia celular no supere el 80% en el momento de la transfección (véase Discusión). La transfección se optimizó utilizando medio esencial mínimo de suero reducido y reactivos comerciales de lipofección (L3000 y P3000, véase Tabla de Materiales).
   1. Extraer HEK293T células mediante tripsinización como se ha descrito anteriormente y colocar 4 × 10⁶ células por matraz T150 con 30 mL de MTC precalentados a 37 °C.
   2. Después de 2 días, confirma que los cultivos están distribuidos de manera uniforme y confluyen entre un 70 y un 80%.
   3. Calienta 50 mL de medio esencial mínimo suero reducido a RT. Descongela plásmidos lentivales, mezcla suavemente y centrifuga rápido. Reactivos de lipofección por vórtice pulsados, giro rápido y déjalos en RT.
   4. Prepara mezclas maestras de ADN. Para cada matraz, combinar en este orden: 2 mL de medio esencial mínimo sérico reducido, 39 μg de plásmidos de empaquetado lentiviral (18 μg de pTRP Gag-Pol, 18 μg de pTRP RSV-Rev, 3 μg de pTRP Cocal-G), 15 μg de plásmido de transferencia y 108 μL de reactivo P3000 (2 μL de P3000/μg ADN). Aumenta la escala según sea necesario y incrementa las cantidades finales al menos un 10% para compensar la pérdida por pipeteo. Vórtice de pulso, giro rápido y almacenamiento en RT.
   5. Prepara mezclas master L3000. Para cada matraz, combinar en este orden: 1,84 mL de medio esencial mínimo sérico reducido y 162 μL de L3000 (3 μL de ADN L3000/μg). Aumenta la escala según sea necesario y incrementa las cantidades finales al menos un 10% para compensar la pérdida por pipeteo. Vórtice pulsado, giro rápido e incubar en RT durante 5 minutos.
   6. Tras 5 minutos, añade 2 mL de mezcla maestra L3000 por matraz a la mezcla maestra de ADN correspondiente para lograr una dilución aproximada de 1:2. Añade lentamente la mezcla L3000 empezando por el fondo del tubo sin tocar sus lados. Mezcla bien pipeteando y incuba 15 minutos en tiempo de descanso.
   7. Mientras tanto, retira cuidadosamente 6 mL de sobrenadante de cada HEK293T cultivo y etiqueta cada matraz.
   8. Tras 15 minutos, transfecta cada cultivo inclinando el matraz hacia arriba y liberando lentamente 4 mL de mezcla de transfección en el sobrenadante en la parte superior del matraz para evitar que las células se desprendan. Pipetea lentamente arriba/abajo dos veces, vuelve el matraz a su posición original, haz girar suavemente, colócala de nuevo en la incubadora y anota el tiempo.
      NOTA: Dejar los cultivos intactos hasta la recolección de lentivirus. En contraste con la recomendación del fabricante de sustituir el sobrenadante HEK293T que contiene la mezcla de transfección L3000 por medio de cultivo fresco tras la transfección¹⁸, omitir este paso preserva títulos lentivales^{más altos 17}.
3. Cosecha, concentración y congelación de supernadantes lentivirales
   NOTA: Mantenga los supernadantes lentivirales en hielo o a 4 °C durante todos los pasos de procesamiento para evitar su degradación.
   PRECAUCIÓN: Los vectores lentivirales se clasifican como materiales infecciosos. Sigue las precauciones de bioseguridad adecuadas, incluyendo el uso de equipo de protección individual (por ejemplo, guantes dobles, batas de laboratorio desechables). Descontamina todas las superficies de trabajo con lejía al 10% seguida de etanol al 70%. Desinfectar los consumibles contaminados y los residuos líquidos con lejía al 10% antes de su eliminación como residuos biopeligrosos, de acuerdo con las directrices de bioseguridad institucional.
   1. Limpia el equipo de ultracentrífuga (cubos, tubos cónicos y adaptadores cónicos) con lejía al 10%, luego enjuaga con agua. Seca brevemente al aire, seguida de rociar con etanol al 70% y secado al aire bajo una campana de cultivo de tejidos.
   2. Preenfría la ultracentrífuga con el rotor insertado a 4 °C.
   3. Cosechar los supernadantes lentivirales entre 30 y 36 horas después de la transfección transfiriéndolos a tubos de 50 mL. Clarifica los sobrenadantes mediante centrifugación (500 × g, 5 min, 4 °C), filtra a través de un filtro de poros de 0,45 μm y guarda en hielo.
   4. Inserta adaptadores cónicos en los cubos, transfiere los sobrenadantes filtrados a tubos de ultracentrífuga cónicos y cárgalos en los cubos. Equilibra cubos opuestos con TCM frío, asegurando que las diferencias de peso estén por debajo de 0,1 g.
   5. Concentra los supernadantes por ultracentrifugación a 12.300 × g durante la noche a 4 °C.
   6. A la mañana siguiente, retira cuidadosamente los cubos y guárdalos en hielo.
   7. Prepara una caja con hielo seco para congelar y crioviales etiquetados para aliquotar.
   8. Bajo una campana de cultivo de tejidos, abre cada cubo y retira el tubo de la ultracentrífuga con pinzas. Para cada tubo, proceda de la siguiente manera:
   9. Aspira cuidadosamente el sobrenadante hasta que quede a 0,5 pulgadas del fondo del tubo y decanta el líquido restante en una placa de 6 pozos. Golpea suavemente el tubo para eliminar parte del líquido residual.
   10. Añade 300 μL de MTC en frío, resuspende suavemente durante 30 segundos y transfiere la suspensión a un criovial.
   11. Lava el tubo con 200 μL de TCM frío y añade el lavado al mismo cryovial.
   12. Mezclar suavemente y aplicar alicuotas de 60 μL para el título de lentivirus (véase el paso 1.4), varias alicuotas de 100 μL para la producción de células CAR T, y un tubo adicional con el volumen restante como sobra. Congela inmediatamente las aliquotas en hielo seco. Transfiere las alicotas a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
4. Titulación de lentivirus concentrado utilizando células T primarias
   NOTA: Aproximadamente 1 × 10⁵ Se requieren células T por dilución por lentivirus. Por ejemplo, seis lentivirus con ocho diluciones cada uno requieren: 6 × 8 × 1 × 10⁵ = 4,8 × 10⁶ Lanticitos T. Se deben preparar células adicionales para compensar la pérdida de pipeteo. Las células T se estimulan mediante perlas magnéticas de activación recubiertas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (véase Tabla de Materiales).
   1. Activación de células T (día 0)
      1. Requisito previo: Mantener a punto las células T purificadas humanas CD4⁺ y CD8⁺ en MTC.
      2. Cuenta las células T CD4⁺ y CD8⁺ y combínalas en una proporción 1:1.
      3. Lava las perlas de activación de la siguiente manera: Añade 1 mL de MTC a un tubo, resuspende las perlas mediante vórtice y transfiere la cantidad necesaria para lograr una proporción de 3 a 1 de perlas a células T. Coloca el tubo en un soporte magnético y deja que las perlas formen una pelota a lo largo de la pared del tubo. Tras 30 s, aspira cuidadosamente el sobrenadante, retira el tubo del soporte magnético y vuelve a suspender las perlas en 1 mL de MTC. Repite el lavado dos veces más.
      4. Añade perlas de activación a las células T y ajusta la concentración final a 1 × 10⁶ células/mL con la MTC precalentada a 37 °C.
      5. Mezcla bien y transfiere la suspensión a un depósito de reactivos. Celdas de placas en placas de fondo plano de 96 pozos con 100 μL de MTC por pozo utilizando una pipeta multicanal. Mezcla bien cada 1-2 minutos para evitar que la perla se asiente.
   2. Transducción de células T (día 1)
      NOTA: Para lentivirus con transgenes grandes (por ejemplo, 9 kb de LTR a LTR), prepare 6 condiciones usando diluciones en serie 1:2 (sin diluir, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Para lentivirus con transgenes más pequeños (por ejemplo, 7 kb de LTR a LTR), se requieren 8 condiciones con diluciones en serie 1:4. Utiliza los pozos restantes como controles no transducidos (UTD).
      1. Descongelar 60 μL de cada lentivirus concentrado en RT y almacenarlos en hielo.
      2. Prepara una serie de dilución en una placa de fondo redondeado de 96 pozos: Añadir 60 μL de lentivirus en la fila superior, añadir 30 μL de MTC fría a cada fila inferior, transferir 30 μL de la fila superior a la segunda y mezclar (dilución 1:2), transferir 30 μL de la segunda a la tercera fila y mezclar (dilución 1:4). Continúa hasta que se preparen seis condiciones en total (sin diluir, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32). Úsalo inmediatamente para transducción.
      3. Entre 23 y 26 horas después de la estimulación de la perla, se transducen células T con 25 μL por pozo de lentivirus desde la placa de dilución usando una pipeta multicanal. Añadir 25 μL de MTC a los pozos de control UTD.
   3. Alimentación con células T (día 3)
      1. Añade suavemente 125 μL de MTC precalentado a 37 °C a cada pozo usando una pipeta multicanal.
   4. Análisis de debeading de células T y citometría de flujo (día 5)
      1. Prepara tres juegos de tubos de tapa de rosca de 1,5 mL para cada condición y quita las tapas. Coloca dos de los tres juegos en un soporte magnético.
      2. Resuspende cada pozo y transfiere las celdas al primer conjunto de tubos para permitir que las perlas formen un pellet a lo largo de la pared del tubo. Después de 30 s, transfiere cuidadosamente los sobrenacionantes al segundo juego de tubos. Espera 30 segundos (las cuentas ya no deberían ser visibles), luego transfiere los sobrenacionantes al tercer juego de tubos y guárdalos en hielo.
      3. Tinte las células T para obtener el marcador de transducción adecuado (por ejemplo, anti-CD19 CAR o anti-HER2 synNotch) con anticuerpos (véase Tabla de Materiales) y analiza la expresión de marcadores mediante citometría de flujo.
      4. Identificar condiciones con tasas de transducción inferiores al 30%, correspondientes aproximadamente al rango lineal entre el volumen del virus y la tasa de transducción.
      5. Calcula los títulos lentivirales usando la siguiente fórmula:
         Título (TU/mL) = (número inicial de células T x porcentaje de células transducidas x factor de dilución)/volumen viral (mL)
         por ejemplo, expresión de CAR al 20% con una dilución 1:32 del stock lentiviral:
         (100.000 celdas x 0,2 x 32) / (0,025 mL) = 2,56 × 10⁷ TU/mL

2. Producción de células T CAR

NOTA: Las cantidades iniciales típicas para la producción de células T CAR son de 1-5 × 10^{células T de 6} por grupo. Aumenta el número de células en el grupo de control UTD en un 50%, ya que este grupo también se utilizará para normalizar los niveles de transducción en experimentos posteriores. Espera 5-6 duplicaciones de población a lo largo de la expansión. La transducción de células T se optimizó utilizando un copolímero de bloque como potenciador (véase Tabla de Materiales) y con proporciones específicas de cultivo superficie-volumen en placas de fondo plano de 96^{pozos 17}.

1. Preparación de una solución de refuerzo de 100 mg/mL
   1. Añade 5 g de potenciador de copolímero a una botella de plástico y luego 45 mL de agua ultrapura. Remueve durante la noche en RT.
   2. Transfiere la solución a un cilindro graduado y ajusta el volumen a 50 mL con agua ultrapura.
   3. Filtra la solución a través de un filtro poroso de 0,22 μm y guárdala a 4 °C.
2. Activación de células T (día 0)
   1. Requisito previo: Mantener a punto las células T purificadas humanas CD4⁺ y CD8⁺ en MTC.
   2. Cuenta las células T CD4⁺ y CD8⁺ y combínalas en una proporción 1:1.
   3. Lava las cuentas de activación de la siguiente manera.
      1. Añadir 1 mL de MTC a un tubo, volver a suspender las perlas mediante vórtices y transferir la cantidad necesaria para lograr una proporción de 3 a 1 de perlas a células T. Coloca el tubo en un soporte magnético y deja que las perlas formen una pelota a lo largo de la pared del tubo.
      2. Tras 30 s, aspira cuidadosamente el sobrenadante, retira el tubo del soporte magnético y vuelve a suspender las perlas en 1 mL de MTC. Repite el lavado dos veces más.
   4. Añade perlas de activación a las células T y ajusta la concentración final a 1 × 10⁶ células/mL con la MTC precalentada a 37 °C.
   5. Mezcla bien y transfiere la suspensión a un depósito de reactivos. Celdas de placa en placas de fondo plano de 96 pozos con 50 μL de MTC por pozo usando una pipeta multicanal. Mezcla bien cada 1-2 minutos para evitar que la perla se asiente.
3. Transducción de células T (día 1)
   NOTA: Seleccione las cantidades de lentivirus basándose en los resultados de la titulación previa, asegurando que los niveles finales de transducción sean comparables entre grupos (normalmente entre el 20% y el 30%). Para evitar múltiples integraciones lentivirales, mantener los niveles máximos de transducción ≤ 30%. Los lentivirus con transgenes grandes generalmente requieren virus sin diluir o una dilución de 1:4-1:8. Ajusta el tamaño de los grupos para evitar restos de lentivirus, ya que cada ciclo de congelación-deshielo reduce los títulos lentivirales. Utiliza mezclas master lentivirales inmediatamente después de la preparación.
   1. Descongela las cantidades necesarias de lentivirus concentrado en RT y almacena en hielo.
   2. Prepara un material de trabajo potenciador de 2 mg/mL en MTC fría mezclando, por ejemplo, 100 μL de potenciador (100 mg/mL) con 4,9 mL de MTC.
   3. Prepara mezclas maestras de lentivirus basadas en los resultados de la titulación y añade potenciador hasta una concentración final de 275 μg/mL. Aumenta los volúmenes finales al menos un 10% para compensar la pérdida por pipeteo. Por ejemplo, para lograr una dilución 1:16 con 100 pozos:
      Volumen total: 100 pozos × 12,5 μL de lentivirus × 110% = 1.375 μL
      1:16 dilución: 1.375 μL/ 16 = 85,9 μL de lentivirus
      Potenciador: 189 μL (275 μg/mL final)
      Mezcla final maestra: 1.100 μL de MTC + 85,9 μL de lentivirus + 189 μL de potenciador = 1.375 μL
   4. Entre 23 y 26 horas después de la estimulación de las perlas, se transducen células T con 12,5 μL por pozo de mezcla maestra de lentivirus usando una pipeta multicanal, resultando en una concentración final de potenciador de 55 μg/mL. Añadir 12,5 μL de MTC a los pozos de control UTD.
4. Alimentación con células T (día 3)
   1. Añade suavemente 125 μL de MTC precalentado a 37 °C a cada pozo usando una pipeta multicanal.
5. Detección de células T (día 5)
   NOTA: Prepara un depósito estéril y tres juegos de tubos de 50 mL para cada cultivo. Limita el volumen total de lavado a ≤ 20% del volumen de cultivo de células T para evitar diluir las células por debajo de 8 × 10⁵ células/mL.
   1. Agrupa cada cultivo en un depósito estéril usando una pipeta multicanal, lava las placas originales con TCM y añade el lavado al depósito. Transfiere cada suspensión de celda al primer conjunto de tubos de 50 mL.
   2. Coloca los tubos en un soporte magnético para que las perlas formen una pelota a lo largo de la pared del tubo. Tras 30 s, transfiere cuidadosamente los sobrenacionantes al segundo conjunto de tubos y colócalos en el soporte magnético. Espera 30 segundos (las cuentas ya no deberían ser visibles), luego transfiere los sobrenacionantes al tercer conjunto de tubos y guárdalos en la incubadora.
   3. Cuenta cada cultivo y normaliza a 8 × 10⁵ células/mL con la MTC precalentada a 37 °C. Placar en el recipiente de cultivo correspondiente según el volumen final (Tabla 2).
   4. Deja que las células T descansen durante un día y luego comienza las tomas diarias a partir del día 7 (ver siguiente paso).
6. Alimentación con células T (día 7 y a diario después)
   NOTA: Las células T se duplican aproximadamente cada 24-36 horas y sufren 5-7 duplicaciones de población antes de descansar. Monitorizar los volúmenes de células T utilizando un contador de celdas basado en impedancia eléctrica (véase Tabla de Materiales) para identificar el momento óptimo para la criopreservación.
   1. Agrupa cada cultivo, mezcla bien y cuenta las células.
   2. Normalizar cada cultivo a 8 × 10⁵ células/mL con MTC precalentada a 37 °C y volver a platicar en el recipiente de cultivo correspondiente (Tabla 2).
   3. Continúa la expansión hasta que el volumen medio de la celda baje de 320^{μm 3}, y luego pasa al paso de criopreservación.
7. Validación de la transducción de células T mediante citometría de flujo
   NOTA: La transducción de células T puede evaluarse en cualquier momento entre el día 5 y el día de la criopreservación. Los niveles de expresión disminuirán a lo largo de la expansión, de modo que una medición temprana garantice la separación clara de fracciones negativas y positivas durante el análisis de citometría de flujo.
   1. Extrae 2 × 10 células^{T de 5} de cada cultivo.
   2. Tinte las células T para el marcador de transducción adecuado (por ejemplo, anti-CD19 CAR o anti-HER2 synNotch) con anticuerpos (véase Tabla de materiales) y analiza la expresión de marcadores mediante citometría de flujo
8. Criopreservación de células T (normalmente entre los días 10-12)
   NOTA: La criopreservación expandió las células T justo antes o después de su estado de reposo para mejorar la viabilidad durante el descongelamiento. Un volumen medio de 320^μm3 puede servir como punto de corte para la criopreservación. Una vez que el volumen celular baja de 300^{μm 3}, las células T dejan de dividirse y su número total comienza a disminuir. Asegúrate de que todos los grupos tengan volúmenes comparables en el momento de la criopreservación, lo que puede requerir un día adicional de cultura para algunos grupos. Congelar las celdas a una tasa constante de -1 °C por minuto utilizando recipientes de congelación apropiados (por ejemplo, recipientes de congelación de celdas libres de alcohol, véase la Tabla de Materiales).
   1. Agrupa cada cultivo en un tubo adecuado (por ejemplo, 500 mL), cuenta las células y alcárgalas en la incubadora.
   2. Calcula el número total de celdas y las cantidades alicotas deseadas.
   3. Las celdas centrífugas (300 × g, 10 min, 4 °C) aspiran los sobrenadantes y resuspenden cada cultivo en un medio congelante que contiene un 50% de medio libre de suero, un 40% de FBS inactivado por calor y un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a 2 × 10⁷ celdas/mL (véase Tabla de Materiales).
   4. Células alicuotas en crioviales (250 μL a 1 mL, correspondientes a 5-20 × 10⁶ celdas por vial). Coloca los cryoviales en un recipiente de congelación celda y guárdalos a -80 °C durante la noche.
   5. Transfiere los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
9. Descongelación de células T
   NOTA: Para cada grupo de células T, prepare un tubo con 50 mL de MTC precalentado a 37 °C para diluir el DMSO en el medio de congelación tras el descongelamiento. Calienta más MTC para el emplatado.
   1. Descongela rápidamente los cryovials a 37 °C en un baño maria o bajo agua tibia corriente.
   2. En cuanto el líquido sea visible, procede a una campana de cultivo de tejidos, añade 500 μL de MTC precalentada, mezcla suavemente y transfiere las células a los tubos preparados que contienen 50 mL de MTC.
   3. Lava el cryovial con 500 μL de MTC y añade el lavado al mismo tubo.
   4. Incuba las células durante 10 minutos en tiempo de descanso.
   5. Las celdas centrífugas (300 × g, 10 min, temperatura ambiente), aspiran los supernadantes y resuspenden las células a 4 × 10⁶ celdas/mL.
   6. Placar las células en el vaso de cultivo correspondiente (Tabla 2).
   7. Reposa las células durante la noche en la incubadora antes de continuar con experimentos aguas abajo.

Buque	Volumen mínimo	Volumen máximo
96-pozo	0,1 mL/pozo*	0,25 mL/pozo
48-pozo	0,2 mL/pozo	1 mL/pozo
24-pozo	0,5 mL/pozo	2 mL/pozo
12-pozo	1 mL/pozo	4 mL/pozo
6-pozo	2 mL/pozo	6 mL/pozo
T25 (horizontal)	3 mL	8 mL
T75 (horizontal)	8 mL	20 mL
T150 (horizontal)	20 mL	60 mL
* El volumen de cultivo se reduce temporalmente a 50 μL/pozo para mejorar la transducción de células T

Tabla 2: Volúmenes recomendados de medios de cultivo para las expansiones de células CAR T. Volúmenes mínimos y máximos de medios de cultivo en formatos de vasos comúnmente usados durante la expansión de células T.

Resultados

Para demostrar las mejoras logradas con el flujo de trabajo optimizado (Figura 1) en una amplia gama de tamaños de transgenes, seleccionamos tres tamaños de vectores lentivirales: 5,7 kb (CD19 CAR), 9,2 kb (HER2-MSLN svsNotch) y 10,1 kb (HER2-MSLN-CBG svsNotch) (Figura 2A). Los lentivirus se produjeron bajo condiciones estándar u optimizadas (Figura 2B: ETS vs. opt y Tabla 1).

Para el vector más pequeño con 5,7 kb, solo se observó una mejora moderada en la transducción de células T en un lote de producción (Figura 2B: arriba, 73% frente a 88% usando virus sin diluir). De forma constante, los títulos lentivirales aumentaron solo modestamente aproximadamente 1,5 veces (Figura 2C: arriba, 2,86 × 10⁸ TU/mL frente a 4,35 × 10⁸ TU/mL). En contraste, el vector de 9,2 kb mostró un rendimiento sustancialmente mejorado, con las tasas máximas de transducción de células T aumentando aproximadamente 5,4 o 3,8 veces dependiendo del lote (Figura 2B: centro, 8,3%/16,6% vs. 45,1%/63,1% usando virus sin diluir) y los títulos funcionales mejorando aproximadamente 3,3 veces (Figura 2C: centro; 3,1 × 10⁶ TU/mL vs. 10,1 × 10⁶ TU/mL). El efecto más fuerte se observó con el vector de 10,1 kb, donde las tasas de transducción aumentaron aproximadamente 12,4 o 9,8 veces (Figura 2B: fondo, 1,4%/1,5% vs. 17,3%/14,7% usando virus sin diluir) y los títulos funcionales mejoraron aproximadamente 10 veces (Figura 2C: fondo, 0,24 × 10⁶ TU/mL frente a 2,41 × 10⁶ TU/mL).

A continuación, las células T de donantes sanos fueron transducidas con vectores lentivirales producidos bajo condiciones estándar u optimizadas, utilizando los flujos de trabajo correspondientes (Figura 3 y Tabla 1). Para comparar las eficiencias de la transducción, se utilizaron cantidades iguales de lentivirus en cada flujo de trabajo, y la dosis viral se ajustó para mantener tasas de transducción en el 30% o por debajo del 30%, evitando así múltiples eventos de integración. En comparación con las células T transducidas usando condiciones estándar y la producción estándar de lentivirus, la transducción aumentó de media 5,1 veces para el vector de 5,7 kb, 13,3 veces para el vector de 9,2 kb y 14,8 veces para el vector de 10,1 kb (Figura 3A y Tabla suplementaria 1). Los cultivos seleccionados de células T generados con el flujo de trabajo optimizado se ampliaron aún más hasta alcanzar un estado de reposo (Figuras 3B, C). Las duplicaciones poblacionales oscilaron entre 5,3 y 6,7, dependiendo del donante de células T (Figura 3B). Las mediciones diarias de volumen de células T mostraron un mínimo de residuos celulares, lo que no indicaba signos de toxicidad durante las expansiones. Antes de la criopreservación, las tasas de transducción se evaluaban mediante tinción para la expresión del receptor CAR/synNotch o midiendo la fluorescencia de mTag-BFP2¹⁹ (Figura 3C y Figura suplementaria 1). Las tasas de transducción fueron del 31,2% para el vector de 5,7 kb (negro; dilución del lentivirus 1:512), del 29,8% para el vector de 9,2 kb (rojo; dilución del lentivirus 1:16) y del 20,2% para el vector de 10,1 kb (azul; dilución del lentivirus 1:4). Datos funcionales adicionales que validan el rendimiento de las células T svsNotch y CAR T generadas se presentan en nuestro estudio^{complementario 17}. Es importante destacar que las células T efectoras producidas con el protocolo optimizado no mostraron diferencias en duplicaciones de población ni en el fenotipo de células T en comparación con las generadas con el flujo de trabajo^{estándar 17}.

Figura 2: Producción de lentivirus siguiendo flujos de trabajo estándar y optimizados. (A) Visión esquemática de vectores lentivirales con tamaños de transgen^{correspondientes 17}. Arriba: Un CAR frente a CD19 (CD19 CAR) se expresa por el promotor alfa del factor de elongación humana 1 (EF1α), con un tamaño total del transgen de aproximadamente 5,7 kb. Medio e inferior: Un receptor synNotch de HER2 se coexpresa con una proteína reportera azul-fluorescente (BFP2) (central) o con una luciferasa verde de escarabajo clic (CBG) (abajo) a través de un péptido auto-cortante 2A (P2A) por el promotor EF1α. La expresión de un CAR (MSLN) dirigido a mesotelina (MSLN) está controlada por un promotor de citomegalovirus mínimo (CMV) específico para GAL4 (GAL4-CMV). El tamaño total del transgen es aproximadamente 9,2 kb para el svsNotch HER2-MSLN (centro) y 10,1 kb para el svsNotch HER2-MSLN-CBG (inferior). SIN = vector autoinactivante; LTR = secuencia de repetición terminal larga. (B) Transducción de células T con diluciones en serie de lentivirus generadas bajo condiciones estándar (ETS) y optimizadas (opt) utilizando los vectores descritos en (A). Dos producciones independientes (círculos y triángulos) por vector con dos lotes cada uno, y dos donantes de células T distintas por lote. Las tasas de transducción se promediaron entre los donantes de células T. (C) Títulos funcionales de las producciones de virus estándar (std, círculos abiertos) y optimizadas (opt, círculos cerrados) mostradas en (B). Los datos se generaron a partir de dos producciones independientes de lentivirus, cada una con dos lotes, y utilizando dos donantes distintos de células T por lote. Todas las barras de error indican la media ± DS. La significación estadística se calculó mediante una prueba t emparejada de dos colas. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Rommel et ^al.17. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Producción de células CAR T con flujos de trabajo estándar y optimizados. (A) Multiplicación de las tasas de transducción de células T con el flujo de trabajo optimizado (opt) en comparación con el flujo de trabajo estándar (e/s) (véase también Tabla S1). Se obtuvieron datos de dos o tres expansiones independientes de células T utilizando donantes distintos y dos producciones independientes de lentivirus. (B) Duplicaciones poblacionales de expansiones de células T generadas utilizando el flujo de trabajo optimizado. Para cada vector, se muestran dos expansiones independientes de células T de donantes normales (ND) distintos, cada una utilizando una producción de lentivirus separada. (C) Gráficos de citometría de flujo que muestran la expresión de CAR, BFP2 y receptores synNotch en células T efectoras expandidas en el día 7 (10,1 kb) o día 10 (5,7 kb y 9,2 kb) (véase también la Figura Suplementaria 1). Todas las barras de error indican la media ± DS. La significación estadística se calculó mediante una prueba t pareada de dos colas. *p < 0,03, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Esta figura ha sido adaptada con permiso de Rommel et ^al.17. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Estrategia de gating para evaluar la expresión de CAR, receptor synNotch y BFP2, relacionada con la Figura 3C. Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de gating utilizada para determinar la expresión de CAR, synNotch y BFP2 en cultivos de células T expandidas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Tasas de transducción en las expansiones individuales de células T, relacionadas con la Figura 3A. Tasas de transducción de las expansiones de células T generadas con flujos de trabajo estándar y optimizados. Esta tabla ha sido adaptada con permiso de Rommel et ^al.17. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aquí presentamos un protocolo paso a paso que detalla un flujo de trabajo optimizado de producción para células CAR T con grandes transgenes lentivirales, como las células T svsNotch. Este flujo de trabajo elimina la necesidad de la clasificación celular y permite la generación eficiente de células T efectoras que portan grandes transgenes lentivirales. Utilizando este flujo de trabajo, producimos rutinariamente células T efectoras con transgenes lentivirales de 9-10 kb y tasas máximas de transducción del 60-70% (9 kb) o 15-20% (10 kb).

Al solucionar problemas con bajos títulos virales o tasas de transducción, se deben considerar varios factores clave. Primero, la calidad de las células HEK293T. Es importante que las células HEK293T se pasen con un horario constante y nunca se les permita crecer más allá del 50-70% de confluencia. En nuestra experiencia, los vectores lentivirales producidos a partir de células HEK293T que antes estaban sobrecrecidas presentan títulos reducidos, incluso cuando las células parecen recuperadas morfológicamente. Rutinariamente generamos vectores virales de alto título utilizando células HEK293T más allá del paso 30, lo que indica que se toleran números de paso más altos si las células se mantienen adecuadamente. Además de la calidad celular, la confluencia de HEK293T células en el momento de la transfección es un factor crítico. Hemos observado una disminución de los títulos lentivirales al transfectar células HEK293T en alta confluencia (90-100%).

En segundo lugar, es esencial cumplir estrictamente con los tiempos, concentraciones y volúmenes especificados en este protocolo, ya que muchos pasos han sido optimizados a fondo en un estudio^{previo 17}. Por ejemplo, el potenciador de copolímeros (véase Tabla de Materiales) ha sido ajustado para maximizar las tasas de transducción sin detectar toxicidad. Aunque concentraciones más altas pueden aumentar aún más la transducción, también causan toxicidades y reducen la expansión de las células T. De manera similar, la extracción de supernadantes lentivirales fuera de la ventana recomendada de 30-36 horas (por ejemplo, a las 24 o 48 horas) produjo títulos más bajos en un experimento de curso^{temporal correspondiente 17}. En cambio, no es necesario adherirse estrictamente a una proporción 1:1 de células T CD4 a CD8, ya que no hemos observado diferencias significativas en la eficiencia de la transducción al utilizar células T a granel con distribuciones variables CD4/CD8. Sin embargo, las desviaciones respecto a esta razón pueden influir en la duración de la expansión y en el número de duplicaciones poblacionales. Por lo tanto, normalmente mantenemos la proporción 1:1 CD4-CD8 para mantener la consistencia entre experimentos.

Los futuros esfuerzos de optimización podrían centrarse en estrategias adicionales para mejorar la transducción de células T con transgenes lentivirales aún mayores, como formulaciones especializadas de medios o regímenes de citoquinas adaptados. Extender este flujo de trabajo a otros tipos de células inmunitarias, incluidas las células natural killer y los macrófagos, podría ampliar sus aplicaciones terapéuticas. Es importante destacar que la traducción clínica de este flujo de trabajo también puede ayudar a reducir los costes de fabricación de productos de terapia celular modificada con lentivirus.

El protocolo integral paso a paso presentado aquí proporciona una referencia práctica para producir células CAR T con transgenes lentivirales grandes y sienta las bases para desarrollar nuevas células CAR T contra cánceres sólidos y de sangre.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo - COCHE ANTI-CD19	Cytoart	200101	Anti-CD19 CAR (idiotipo), conjugado AF647, 1:100
Anticuerpo - anti-HER2 synNotch	R& Sistemas D	FAB95471G	Anti-Trastuzumab (idiotipo), conjugado AF488, 1:80
Lejía	Clorox	Lejía Germicida
Contenedor de congelación de celdas	Biocisión	FTS30	Sin alcohol
Centrífuga (grande)	Termo Científica	Legend XTR
Centrífuga (mini)	Fisher Scientific	Sprout Plus
Centrífuga (pequeña)	Eppendorf	5425
Contador Coulter	Beckman Coulter	Multidimensionador 4	Contador de celdas basado en impedancia eléctrica que determina el número y el volumen celular
Tubos criogénicos	Termo Científica	375418
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Tecnología de señalización celular	12611P
DPBS (sin calcio, sin magnesio)	Gibco	14190-136
Dynabeads (CD3/CD28)	Gibco	40203D	Cuentas de activación utilizadas para la estimulación de células T
Etanol	Laboratorios de Descontaminación	200 Proof
FBS (inactivado por calor)	Avantor (VWR)	97068-091
Citómetro de flujo	BD	LSRFortessa (647177)
Congelador (-80 ºC; C)	Panasonic	MDFU76VA-PA
Congelador (nitrógeno líquido)	MVE HEco	1500-190
Frigorífico (4 y grados; C)	Fisher Scientific	Isotemp
Guantes (nitrilo)	Driza	55082
Suplemento GlutaMAX	Gibco	35050-061	L-alanyl-L-glutamina
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Hielo (seco)	N.A.	N.A.
Hielo (mojado)	N.A.	N.A.
Cubo de hielo	Fisher Scientific	07-210-108
Bata de laboratorio (desechable)	Kappler	PVS112WH-MD
Plásmidos de empaquetado lentíviral	Propietario	N.A.	pTRP Gag-Pol, pTRP RSV-Rev, pTRP Cocal-G
Plásmidos de transferencia lentival	Propietario	N.A.	por ejemplo, pTRPE svsNotch
Reactivo de transfección Lipofectamina 3000	Invitrogen	L3000015	Reactivo comercial para lipofección; contiene Lipofectamina 3000 (L3000) y su reactivo potenciador (P3000)
Soporte magnético (grande)	Stemcell	FácilSep 18103	Para 5 mL/15 mL
Soporte magnético (pequeño)	Invitrogen	DynaMag-2 12321D	Para tubos de 1,5 mL
Barra de agitación magnética	Fisher Scientific	14-513-82	Kit de barra agitadora
Plataforma magnética de agitación	Termo Científica	S88857100
Cilindro de medición (100 mL)	VWR	76019-316
Agua MQ	Merck	Q-POD	Agua de ultrapue; utiliza el filtro final Millipak 40 Express, 0,22 micras (MPGP04001)
Pipeta multicanal	Fisher Scientific	ver comentarios	30-300 y micro; L:  FBE1200300; 5-50 y micro; L:  FBE1200050
Opti-MEM (con L-glutamina, Rojo de Fenol)	Gibco	31985-070	Medio esencial mínimo de suero reducido utilizado para la transfección de ADN
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL, 10.000 & micro; g/mL)	Gibco	15140-122
Pipetas	Fisherbrand	ver comentarios	50 mL: 13-678-11F; 25 mL: 13-678-11; 10 mL: 13-678-11E; 5 mL: 13-678-11D
Pipetas (aspirantes)	Halcón	357558	2 mL
Pipeta	Gilson	PIPETMAN P10/P20/P200/P1000
Controlador de pipeta	Hirschmann	Pipeto Z314951
Puntas de pipeta	Thomas Scientific	ver comentarios	1000 y micro; L: 1159M42; 200 y micro; L: 1159M40; 20 & micro; L: 1159M43; 10 & micro; L: 1159M41
Botella de plástico para almacenamiento (500 mL)	Corning	430282
Depósito de reactivos	Celltreat	3054-2007
RPMI-1640 (con L-glutamina, Rojo de Fenol)	Gibco	11875-085
Escala	Ohaus	Pionero	Se requiere una precisión mínima de 0,1 g
Filtro Steriflip (0,45 & micro; m)	Millipore	SE1M003M00
Sinperónica F 108 (SF108)	Sigma-Aldrich	07579-250G-F	Copolímero de bloque utilizado para mejorar la transducción de células T
Matraz de cultivo tisular - T150	Corning	430825
Matraz de cultivo de tejidos - T25	Corning	430639
Matraz de cultivo tisular - T75	Corning	430641U
Campana de cultivo de tejidos	Termo Científica	Serie 1300 A2
Incubadora de cultivo de tejidos	Termo Científica	Heracell 150i
Placa de cultivo de tejidos - 6 pozos	Corning	3516
Placa de cultivo de tejidos - fondo plano de 96 pozos	Halcón	353072
Placa de cultivo de tejidos - fondo redondeado de 96 pozos y nbsp;	Halcón	353077
Tripsina-EDTA (0,05%)	Gibco	25300-054
Tubos - tapas de rosca de 1,5 ml	Sarstedt	72692005
Tubos - 15 mL	Halcón	352099
Tubos - 5 mL	MSP	62-1028-2
Tubos - 500 mL	Corning	431123
Tubos - 50ml	Halcón	352098
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100
Rotor de ultracentrífuga con cubos	Beckman Coulter	SW 32 Ti
Adaptadores de tubos ultracentrífugos (para tubos cónicos)	Seton Scientific	4230
Tubos ultracentrífugas (cónicos)	Seton Scientific	5067
Vórtice	Fisher Scientific	02215414
Baños de agua (37 y grados; C)	Fisher Scientific	Isotemp 210	Usado con cuentas Lab Amor (Gibco) en lugar de agua
X-VIVO-15	Lonza	04-418Q	Medios sin suero utilizados para congelar células T