El eje Mettl3 / Nrf2 suprime la progresión de la enfermedad de Parkinson mediante la inhibición de la piroptosis inducida por NLRP3 en las neuronas de serotonina

La enfermedad de Parkinson (EP) se ubica como el segundo trastorno neurodegenerativo más prevalente entre los ancianos, afectando alrededor del 2-3% de las personas de 65 años o más, lo que representa una carga significativa tanto para las familias como para la sociedad¹. Aunque los mecanismos precisos detrás de la EP aún se comprenden parcialmente, la evidencia acumulada indica una conexión entre el desarrollo de la EP y los desafíos en la transmisión neuronal, junto con la neuroinflamación impulsada por las células microgliales, que es un rasgo común que se observa en los cerebros envejecidos y varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la EP 2,3,4,5 . La microglía sirve como células inmunitarias innatas dentro del sistema nervioso central (SNC) y es vital para mantener la homeostasis cerebral⁶. Sin embargo, la sobreactivación persistente de estas microglías puede desencadenar respuestas neuroinflamatorias crónicas, lo que en última instancia contribuye a la progresión de la enfermedad neurodegenerativa.

Tanto los procesos inflamatorios centrales como los periféricos influyen significativamente en la patología de la EP ^7,8. La activación de las células microgliales provoca respuestas inflamatorias que impactan la supervivencia neuronal⁹, con evidencia emergente que destaca su cebado por ubiquitina ligasas¹⁰. Entre varias vías inflamatorias, la activación del inflamasoma que contiene NOD, LRR y la proteína 3 que contiene el dominio pirina (NLRP3) sirve como contribuyente principal a la regulación inflamatoria microglial¹¹. La activación conduce a la expresión de NLRP3 y al posterior ensamblaje del complejo inflamasoma compuesto por la proteína adaptadora del dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD) y pro-caspasa-1, que culmina en la escisión de proteínas y la liberación de citoquinas¹². Se ha observado una activación elevada de NLRP3 en pacientes con EP y en varios modelos animales de la enfermedad, lo que resulta en la muerte neuronal. En particular, la inhibición de NLRP3 ha demostrado efectos protectores contra la patología de la EP en modelos de ratón, lo que subraya el papel crucial del inflamasoma NLRP3 en el inicio de la EP^13,14.

La señalización de serotonina (5-HT) es un mecanismo significativo de regulación neuronal, que influye en numerosos comportamientos y funciones fisiológicas a través de interacciones con al menos 14 subtipos de receptores postsinápticos^15,16, incluidos los roles en la patología del SNC como se detalla en resúmenes completos¹⁷. La extensa influencia neuromoduladora del sistema 5-HT está gobernada por aproximadamente 26.000 neuronas en el cerebro de roedores¹⁸. Si bien la literatura sustancial asocia la EP predominantemente con la pérdida de neuronas dopaminérgicas, la relación entre las neuronas 5-HT y la EP se examina menos a fondo.

La modificación de N6-metiladenosina (m6A), la modificación de ARNm más prevalente en las células eucariotas, es clave para regular el empalme, la estabilidad y la exportación de ARNm, influyendo así en diversas actividades celulares¹⁹. Los niveles de m6A están modulados por metiltransferasas y desmetilasas. Las modificaciones elevadas de m6A en el cerebro se han relacionado con el neurodesarrollo, y su desregulación está estrechamente relacionada con las condiciones neurodegenerativas^20,21, incluida la expresión alterada de METTL3 en modelos de Alzheimer²². Por ejemplo, la acumulación de metiltransferasa similar a 3 (METTL3) en la fracción insoluble de tejidos cerebrales post-mortem de pacientes con Alzheimer se ha correlacionado positivamente con los niveles de proteína Tau insoluble²³. Además, una disminución significativa de los niveles de m6A en el cuerpo estriado puede conducir a una disminución sustancial de los niveles de neurotransmisores dopaminérgicos²⁴. En particular, doce polimorfismos de un solo nucleótido relacionados con m6A han mostrado asociaciones significativas con la susceptibilidad a la EP²⁵. Este protocolo establece metodologías integrales para investigar cómo las modificaciones de m6A mediadas por METTL3 regulan la piroptosis microglial a través del eje Nrf2 / NLRP3, lo que finalmente afecta la supervivencia de las neuronas serotoninérgicas en modelos de EP. El modelo agudo MPTP in vivo y el modelo LPS in vitro se seleccionaron por su robusta inducción de respuestas neuroinflamatorias, aunque los paradigmas crónicos podrían complementar estudios futuros como se discute a continuación.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Popular de Feicheng (número de aprobación IACUC-2024-118) y se realizaron en estricta conformidad con las pautas institucionales y los principios éticos establecidos para la investigación con animales de laboratorio. Los protocolos del estudio garantizaron el cuidado y el trato humanos de todos los animales, con especial énfasis en minimizar el sufrimiento y la angustia, al tiempo que se adhirieron tanto a los estándares institucionales como a las pautas ARRIVE para prácticas responsables de investigación con animales.

1. Modelo de cultivo celular y activación microglial

1. Preparación y mantenimiento de la celda BV2
   1. Descongele rápidamente las células microgliales BV2 congeladas en un baño de agua a 37 °C durante 2 min, asegurando un remolino suave para evitar el choque térmico.
   2. Centrifugar la suspensión celular descongelada a 300 × g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) para eliminar el crioprotector.
   3. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en 10 ml de medio DMEM completo con alto contenido de glucosa suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y 2 mM de L-glutamina.
   4. Realice la evaluación de la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de tripano (mezcle 10 μL de suspensión celular con 10 μL de azul de tripano al 0,4%, cuente con hemocitómetro), asegurando una viabilidad del >95% antes de continuar.
   5. Placas de células en matraces de cultivo T75 a una densidad de 1 × 10⁶ células por matraz y mantener en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 ° C con 5% de CO₂.
   6. Células de paso cada 48 h cuando se alcanza un 80-85% de confluencia utilizando procedimientos estándar de tripsinización.
      NOTA: Mantenga números de pases constantes (pasajes 3-8) para garantizar respuestas inflamatorias reproducibles. Todos los experimentos de cultivo celular se repitieron de forma independiente al menos tres veces, con tres réplicas técnicas por condición para minimizar la variabilidad.
2. Activación microglial inducida por LPS
   1. Siembre las células BV2 en placas de 6 pocillos a 2 × 10⁵ células por pocillo en 2 ml de medio completo 24 h antes del tratamiento.
   2. Preparar la solución madre de LPS a 1 mg/ml en PBS estéril, filtrar y esterilizar a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar en alícuotas de un solo uso a -20 °C.
   3. Valide la actividad de LPS utilizando el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para confirmar la concentración de endotoxinas antes de cada experimento²⁶.
   4. Diluya el stock de LPS a una concentración de trabajo de 1 μg/ml en DMEM sin suero inmediatamente antes de su uso.
   5. Retire el medio de cultivo de los pocillos y lave las células dos veces con PBS estéril.
   6. Agregue 2 ml de medio que contenga LPS (concentración final de 1 μg/ml) a los pocillos de tratamiento y DMEM sin suero a los pocillos de control.
   7. Incubar las células durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO₂ para la activación inflamatoria.
   8. Incluya pocillos de control positivo tratados con factor de necrosis tumoral (FNT) de 100 ng/ml de α y pocillos de control negativo con vehículo solo (PBS) para validar la respuesta inflamatoria.
      NOTA: Prepare una solución de LPS fresca para cada experimento para mantener una bioactividad constante. Si la respuesta inflamatoria es débil (p. ej., aumento de citoquinas <2 veces), verifique la estabilidad del reactivo o extienda la incubación a 48 h.
3. Sobreexpresión y derribo de Mettl3
   1. Diseñe y sintetice pequeñas secuencias de ARN interferente (ARNip) dirigidas a Mettl3 y secuencias de control codificadas utilizando protocolos estándar de síntesis de oligonucleótidos. Seleccione secuencias diana de la región codificante del ARNm de Mettl3 (acceso GenBank: NM_019721) con una longitud de nucleótido de 19-21, lo que garantiza un contenido de GC del 40-60%²⁷.
   2. Valide las secuencias de ARNip mediante el análisis BLAST para confirmar la especificidad y evitar efectos fuera del objetivo (garantice una homología del <70% con genes no diana).
   3. Prepare vectores de sobreexpresión que contengan ADNc Mettl3 de longitud completa clonados en el vector pcDNA3.1 utilizando los sitios de restricción EcoRI y XhoI.
   4. Transfecte células al 70-80% de confluencia utilizando un reactivo de transfección lipídica catiónica:
      1. Mezcle 2 μL de reactivo de transfección lipídica catiónica con 50 pmol siRNA o 2 μg de ADN plasmídico en 100 μL de medio Opti-MEM.
      2. Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente.
      3. Agregue el complejo de transfección gota a gota a las células e incube durante 4-6 h antes de cambiar a un medio fresco completo.
   5. Incubar las células transfectadas durante 48 h antes del tratamiento con LPS para permitir cambios adecuados en la expresión de proteínas.
   6. Confirme la eficiencia de la transfección mediante la cotransfección de indicadores fluorescentes (100 ng de pEGFP-C1 por pocillo), con un objetivo de eficiencia del >70% mediante microscopía de fluorescencia antes de continuar.

2. Desarrollo de modelos animales y diseño experimental

1. Preparación y aleatorización de animales
   1. Obtener ratones C57BL/6J del Laboratorio Vital River, asegurando proporciones iguales de machos a hembras, con una edad de 8 semanas, con un peso de 19-26 g.
   2. Animales domésticos en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) con un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h, temperatura controlada (22 ± 2 °C) y humedad (50-60%).
   3. Permita un período de aclimatación de 7 días con acceso ad libitum a comida y agua estándar.
   4. Realizar evaluaciones conductuales de referencia durante la aclimatación: Realizar evaluaciones conductuales integrales, incluida la prueba de colocación de las extremidades anteriores (10 ensayos por lado), la evaluación de la aceleración de la varilla rotativa (4-40 rpm durante 5 minutos) y el análisis de la actividad locomotora de campo abierto (sesiones de 10 minutos en un aparato de 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
   5. Asigne aleatoriamente animales a grupos experimentales (n = 6 por grupo) utilizando aleatorización computarizada para minimizar el sesgo: simulado, Modelo, Modelo + Nrf2-KD, Modelo + oe-Nrf2.
   6. Implementar un diseño experimental ciego en el que los investigadores que realizan evaluaciones de comportamiento no estén al tanto de las asignaciones grupales.
2. Modelo de enfermedad de Parkinson inducido por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)
   1. Preparar la solución MPTP a 30 mg/kg en solución salina estéril inmediatamente antes de la inyección disolviendo 15 mg de clorhidrato MPTP en 5 ml de solución salina estéril y ajustando el volumen en función del peso del animal.
      PRECAUCIÓN: MPTP es altamente neurotóxico. Manipule una campana extractora de productos químicos con el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes dobles y una bata de laboratorio.
   2. Administrar MPTP mediante inyección intraperitoneal a 30 mg/kg de peso corporal (volumen de inyección 10 ml/kg) durante tres días consecutivos a la misma hora todos los días (09:00 ± 30 min).
   3. Inyecte a los animales del grupo simulado volúmenes equivalentes de solución salina estéril siguiendo un programa de inyección idéntico.
   4. Monitoree a los animales para detectar signos de angustia, pérdida de peso (>15% considerado punto final) o reacciones adversas diariamente durante el período de administración de MPTP utilizando hojas de puntuación estandarizadas.
   5. Mantenga a los animales durante 8 días después de la inyección final para permitir el desarrollo de la neurodegeneración.
      NOTA: Los animales pueden alojarse normalmente durante este período con un monitoreo continuo.
3. Inyección viral estereotáctica
   1. Preparar vectores virales AAV9 mediante triple transfección de células HEK293T utilizando polietilenimina (PEI; relación 1:3 ADN:PEI), cosechar a las 72 h después de la transfección, purificar mediante ultracentrifugación en gradiente de yodixanol (177.000 × g durante 2 h) y concentrar utilizando dispositivos de filtro centrífugo para lograr 1 × 10¹² copias del genoma/ml.
   2. Valide el título viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa utilizando cebadores dirigidos a las regiones ITR, asegurando que los títulos alcancen 1 × 10¹² copias del genoma/ml con análisis de curva estándar.
   3. Valide el título viral utilizando PCR cuantitativa basada en SYBR Green con cebadores específicos de ITR, realizando diluciones en serie de estándares conocidos y calculando copias del genoma utilizando análisis de curvas estándar. Confirme la ausencia de contaminación por virus competente para la replicación mediante p24 ELISA.
   4. Anestesiar ratones con isoflurano (3% de inducción, 1,5-2% de mantenimiento) administrado a un caudal de oxígeno de 0,8-1,0 L/min a través de un cono nasal, monitorizando la frecuencia respiratoria (60-100 respiraciones/min) y el reflejo de pellizco del dedo del pie durante todo el procedimiento. Asegure el ratón en el marco estereotáctico y aplique ungüento oftálmico para evitar que se seque la córnea.
   5. Asegure el ratón en el marco estereotáctico y aplique ungüento oftálmico para evitar que se seque la córnea.
   6. Haga una incisión en la línea media del cuero cabelludo de 1,5 cm con una hoja de bisturí estéril e identifique el punto de referencia del bregma utilizando coordenadas estereotácticas con una precisión de 0,1 mm.
   7. Calcular las coordenadas de inyección para el cuerpo estriado: antero-posterior -0,5 mm, medial-lateral ±2,0 mm, dorsal-ventral -3,0 mm del bregma.
   8. Realice inyecciones piloto con trazador fluorescente (p. ej., proteína fluorescente verde [GFP]) para validar la precisión de la orientación, confirmando la colocalización del >80% con marcadores microgliales (Iba1) mediante inmunohistoquímica antes de las inyecciones experimentales.
   9. Baje la aguja de inyección (33-G) a la profundidad objetivo a una velocidad de 1 mm/min e inyecte 2 μL de suspensión viral a 0,2 μL/min utilizando una bomba de microjeringa con un controlador automático. Baje la aguja de inyección a la profundidad deseada e inyecte 2 μL de suspensión viral a una velocidad de 0,2 μL/min con una bomba de microjeringa.
   10. Mantenga la posición de la aguja durante 5 minutos después de la inyección para evitar el reflujo.
   11. Retire lentamente la aguja a una velocidad de 0,5 mm / min, cierre la incisión con 4-0 suturas de seda usando un patrón interrumpido y permita la recuperación de la anestesia en una almohadilla de recuperación caliente.
   12. Administrar analgesia postoperatoria (carprofeno 5 mg/kg por vía subcutánea una vez al día durante 3 días) y monitorizar la recuperación durante 24 h con hojas de observación detalladas.

3. Técnicas y validación de biología molecular

1. Extracción de ARN y control de calidad
   1. Recolectar células o muestras de tejido cerebral estriatal inmediatamente después de los criterios de valoración experimentales mediante la eutanasia humana de los animales mediante inhalación de_CO2 seguida de luxación cervical; diseccionar el tejido en hielo, picar finamente y disociar enzimáticamente con tripsina al 0,25% durante 10 min a 37 °C si se recolectan células.
   2. Extraiga el ARN total utilizando el reactivo TRIzol (1 ml por 1, 10,⁶ células o 100 mg de tejido) con homogeneización mecánica (20-25 golpes en un homogeneizador de dounce) y separación de fases de cloroformo (0,2 ml de cloroformo por 1 ml de TRIzol).
   3. Evalúe la calidad del ARN mediante espectrofotometría (relación A260 / A280 1.8-2.0) y electroforesis en gel (agarosa al 1%) para confirmar las bandas ribosómicas 28S y 18S.
   4. Cuantifique la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro.
   5. Almacene las muestras de ARN a -80 °C en agua libre de nucleasas a -80 °C con la adición de inhibidor de ARNasa (40 unidades/μL) hasta el análisis.
2. Fraccionamiento citoplasmático nuclear
   1. Coseche las células (2 × 10⁶ mínimo) y lávelas dos veces con PBS helado (5 ml por lavado, 5 min de centrifugación a 300 × g).
   2. Utilice un kit de fraccionamiento celular comercial con el siguiente protocolo.
      1. Vuelva a suspender el sedimento celular en 200 μL de tampón de extracción citoplasmática con inhibidores de la proteasa.
      2. Incubar en hielo durante 10 min con vórtice cada 3 min.
      3. Centrifugar a 16.000 × g durante 5 min a 4 °C y recoger sobrenadante (fracción citoplasmática).
      4. Lave el gránulo dos veces con tampón de extracción citoplasmática.
      5. Vuelva a suspender el sedimento en 100 μL de tampón de extracción nuclear.
      6. Incubar en hielo durante 40 min con vórtice cada 10 min.
      7. Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante (fracción nuclear)
   3. Valide la eficiencia del fraccionamiento analizando la distribución de marcadores nucleares (U6) y marcadores citoplasmáticos (GAPDH) utilizando Western blot.
   4. Extraiga ARN de fracciones nucleares y citoplasmáticas por separado.
   5. Analice los niveles de ARNm de Nrf2 en cada fracción mediante RT-qPCR con genes de referencia específicos de fracciones.
3. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
   1. Sintetice ADNc a partir de 1 μg de ARN total utilizando un kit de reactivos de transcripción inversa con cebadores aleatorios.
   2. Realice qPCR utilizando el kit Premix Ex Taq II con cebadores específicos de genes en un sistema de PCR en tiempo real.
   3. Valide la especificidad del cebador mediante el análisis de la curva de fusión y confirme un solo amplicón mediante electroforesis en gel.
   4. Utilice las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s.
   5. Calcule los niveles relativos de expresión de ARNm utilizando el método ^2-ΔΔCt con β-actina como referencia interna.
   6. Incluya controles sin plantilla y valide la estabilidad del gen de referencia en condiciones experimentales mediante el análisis geNorm (valor de estabilidad M < 0,5).
      NOTA: Puntuaciones de reproducibilidad: coeficiente de variación (CV) intraensayo <10% en tres ejecuciones independientes.
4. MeRIP-qPCR para el análisis de modificación de m6A
   1. Extraiga el ARN total (mínimo 20 μg) y fragmente a 100-200 nucleótidos utilizando el reactivo de fragmentación de ARN (10 mM ZnCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) a 70 °C durante 5 min.
   2. Realice la inmunoprecipitación utilizando anticuerpos específicos m6A (2 μg por 20 μg de ARN) durante la noche a 4 °C con rotación (10 rpm) en tampón de inmunoprecipitación (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% NP-40).
   3. Valide la especificidad de los anticuerpos utilizando controles de ARN modificados y no modificados con m6A conocidos.
   4. Lave los complejos inmunoprecipitados cinco veces con tampón de lavado.
   5. Eluya el ARN unido y transcriba inversamente utilizando cebadores aleatorios.
   6. Transcribe inversamente el ARN eluido utilizando cebadores aleatorios y realiza análisis de qPCR utilizando cebadores específicos de Nrf2 que cubren posibles sitios m6A.
   7. Realice análisis de qPCR utilizando cebadores específicos de Nrf2 y calcule el enriquecimiento en relación con el ARN de entrada.
      NOTA: Si la detección es inconsistente, optimice el tiempo de fragmentación (4-6 min) para mejorar la reproducibilidad; Punto de referencia cuantitativo: relación señal-ruido >15:1 en comparación con los controles IgG.

4. Análisis y validación de proteínas

1. Extracción y cuantificación de proteínas
   1. Lisar células (1 × 10⁶ células) u homogeneizar muestras de tejido (100 mg de tejido estriatal) en 200 μl de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contiene inhibidores de la proteasa (1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 μg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de pepstatina A) e inhibidores de la fosfatasa (1 mM de ortovanadato de sodio, 5 mM de fluoruro de sodio).
   2. Incubar lisados en hielo durante 30 min con vórtice periódico (cada 10 min durante 10 s).
   3. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C para eliminar los restos celulares y recoger el sobrenadante.
   4. Cuantifique la concentración de proteínas mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) con patrones de albúmina sérica bovina (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg/mL) en mediciones por triplicado.
   5. Valide la integridad de las proteínas mediante el análisis de los niveles de proteínas de mantenimiento (GAPDH, MW esperado: 36 kDa) en todas las muestras mediante Western blot.
2. Análisis de Western blot
   1. Preparar muestras de proteínas con carga igual (30-50 μg) en tampón de carga de electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida sódica (SDS-PAGE) (concentraciones finales: 62,5 mM de Tris-HCl, pH 6,8, SDS al 2%, glicerol al 10%, β-mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol al 0,003%) y desnaturalizar a 95 °C durante 5 min.
   2. Separe las proteínas mediante SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida al 10%, funcionando a 80 V durante 30 min seguido de 120 V durante 90 min en tampón Tris-glicina-SDS.
   3. Transfiera proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un sistema de transferencia semiseco (400 mA durante 90 min) en tampón de transferencia (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol).
   4. Confirme la eficiencia de transferencia mediante tinción de proteínas reversible (Ponceau S: 0,1% en ácido acético al 5% durante 5 min) antes de proceder a la incubación de anticuerpos.
   5. Bloquee las membranas con leche desnatada al 5% en TBST (TBS + 0,1% Tween-20) durante 1 h a RT con agitación suave.
   6. Incubar con anticuerpos primarios diluidos 1:1000 en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C con agitación suave.
   7. Lavar las membranas tres veces con TBST (10 min cada una) e incubar con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (dilución 1:5000) durante 1 h a RT.
   8. Detecte bandas de proteínas mediante quimioluminiscencia mejorada y cuantifique mediante densitometría.
   9. Normalice la expresión de la proteína diana al control de carga (GAPDH) y valide la especificidad de los anticuerpos utilizando los controles adecuados (bloqueo de péptidos para anticuerpos primarios, controles solo secundarios).

5. Evaluación conductual y análisis funcional

1. Prueba de colocación de extremidades anteriores
   1. Deje que el ratón se aclimate al entorno de prueba (habitación silenciosa, 22 °C, iluminación tenue) durante 30 minutos antes de la evaluación.
   2. Sujete al ratón suavemente por la piel dorsal, suspendiendo las cuatro extremidades aproximadamente 0,5 cm por encima del borde de la mesa mientras se asegura de que el ratón no pueda ver la superficie de la mesa.
   3. Cepille las vibrisas de cada lado contra el borde de la mesa para activar el reflejo de colocación y registrar la colocación exitosa de las extremidades anteriores en 2 s.
   4. Realice 10 ensayos por lado con intervalos de 30 s entre ensayos, alternando los lados izquierdo y derecho.
   5. Realice pruebas en condiciones de iluminación consistentes (50-100 lux) y hora del día (13:00-17:00) para minimizar las influencias circadianas.
   6. Calcule la tasa de éxito como un porcentaje de las colocaciones exitosas: (colocaciones exitosas/pruebas totales) × 100.
2. Aceleración de la prueba de la varilla rotativa
   1. Ajuste el aparato de varilla rotativa a una velocidad inicial de 4 rpm con aceleración lineal a 40 rpm durante 5 minutos de duración.
   2. Entrene a los ratones en el rotarod durante 3 días consecutivos (3 pruebas por día, intervalos de 15 minutos) antes de probar para minimizar los efectos de aprendizaje.
   3. Estandarice las condiciones de prueba, incluidos los niveles de RT (22 ± 2 °C), iluminación (100 lux) y ruido de fondo (<50 dB).
   4. Coloque el mouse en la varilla giratoria mirando hacia adelante e inicie el protocolo de aceleración inmediatamente.
   5. Registre la latencia hasta la caída (tiempo desde el inicio hasta que el ratón cae o completa la prueba de 5 minutos) para cada prueba, probando 5 veces por animal con intervalos de descanso de 15 minutos.
   6. Calcule la latencia promedio de las tres pruebas más largas para minimizar la variabilidad debido a factores motivacionales.
3. Prueba de campo abierto
   1. Utilice un aparato de campo abierto (caja de acrílico transparente de 50 cm × 50 cm × 50 cm) con un sistema de seguimiento de video colocado a 1 m por encima de la arena.
   2. Limpie el aparato con etanol al 70% entre animales (rocíe y limpie, seque al aire durante 5 minutos) para eliminar las señales de olor.
   3. Coloque el mouse en el centro del aparato y registre la actividad durante 10 minutos bajo una iluminación constante (200 lux) con captura de video a 30 fps.
   4. Analice múltiples parámetros utilizando software de seguimiento automatizado:
      Distancia total recorrida (cm)
      Tiempo de la zona central (definido como 10 cm de las paredes, informado en s)
      Velocidad de movimiento (cm/s)
      Tiempo de permanencia en la periferia frente a las zonas centrales
4. Defina la zona central como 10 cm de las paredes y cuantifique el tiempo empleado y la distancia recorrida en el centro frente a las zonas periféricas.

6. Microscopía e imágenes avanzadas

1. Tinción DHE para la detección de ROS
   1. Prepare una solución fresca de dihidroetidio (DHE) a 10 μM en PBS inmediatamente antes de su uso (proteger de la luz).
   2. Realice una tinción de coinmunofluorescencia combinando DHE con el anticuerpo triptófano hidroxilasa 2 (TPH2) (dilución 1:500) para identificar específicamente las neuronas de serotonina.
      NOTA: Este enfoque de doble etiquetado permite la discriminación de la producción de ROS dentro de los cuerpos celulares neuronales positivos para TPH2 del estrés oxidativo en las células gliales circundantes, basado en el principio de que la DHE, al oxidarse por superóxido, forma productos fluorescentes impermeables a la membrana que permanecen localizados dentro de la célula de origen.
   3. Incube secciones de tejido (20 μm de espesor) con solución DHE durante 30 min a 37 °C en condiciones de oscuridad en una cámara humidificada.
   4. Incluya controles negativos (sin DHE) y controles positivos (tratamiento con 100 μM H₂O₂ durante 30 min) para validar la especificidad de la detección de ROS.
   5. Lave las secciones tres veces con PBS y móntelas con un medio de montaje antidecoloración.
   6. Imagen mediante microscopía de fluorescencia (DHE: excitación de 518 nm/emisión de 605 nm, TPH2: excitación de 488 nm/emisión de 525 nm) con ajustes de exposición consistentes (200 ms) en todas las muestras; Los sistemas de imágenes se calibraron semanalmente utilizando perlas de fluorescencia estándar (relación señal-ruido > 20:1).
   7. Cuantifique la intensidad de la fluorescencia en células positivas para TPH2 solo utilizando el software ImageJ con protocolos de análisis estandarizados (umbral: 50-255, tamaño de partícula: 10-∞ píxeles²). Establecer límites de ROI basados en la inmunorreactividad de TPH2 para garantizar la medición del estrés oxidativo específicamente dentro de las neuronas serotoninérgicas, excluyendo la señal de la microglía, los astrocitos u otros tipos de células adyacentes. Para cada animal, analice un mínimo de 50 neuronas positivas para TPH2 en múltiples secciones de tejido.
2. Inmunohistoquímica
   1. Fije las secciones de tejido en paraformaldehído al 4% en PBS durante 24 h a 4 °C con agitación suave.
   2. Deshidratar a través de una serie de etanol graduado (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 h cada uno) e incrustar en parafina utilizando un procesador automatizado.
   3. Corte secciones de 5 μm con un micrótomo y móntelas en portaobjetos de vidrio cargado, asegurando 3-4 secciones por portaobjetos.
   4. Desparafinar las secciones con xileno (2 × 10 min) y rehidratar a través de etanol graduado en agua.
   5. Realice la recuperación de antígenos utilizando tampón de citrato (citrato de sodio 10 mM, pH 6,0) en un microondas (750 W durante 10 min con intervalos de enfriamiento de 2 min).
   6. Valide la especificidad de los anticuerpos utilizando controles negativos apropiados (sin anticuerpos primarios) y tejidos de control positivo (secciones del cerebro que se sabe que expresan proteínas diana).
   7. Bloquee la actividad de la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 10 min a temperatura ambiente.
   8. Aplicar anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
   9. Detectar utilizando anticuerpos secundarios conjugados con HRP (dilución 1:500, 1 h a RT) y cromógeno DAB (incubar hasta que se desarrolle un color marrón, normalmente 2-5 min).
   10. Contratinción con hematoxilina (30 s), deshidratar, limpiar y montar con medio de montaje permanente.
   11. Cuantifique las células positivas utilizando métodos estereológicos con muestreo aleatorio sistemático (cada 5ª sección, 3 fotogramas de conteo por sección, 40× aumento).

7. Análisis estadístico y validación de datos

1. Diseño y análisis estadístico
   1. Realice análisis de potencia para determinar tamaños de muestra adecuados para detectar diferencias biológicamente significativas (tamaño del efecto ≥ 0,8, potencia ≥ 0,80, α = 0,05) utilizando el software G*Power 3.1.9.7.
   2. Valide la normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk y evalúe la homogeneidad de la varianza mediante la prueba de Levene antes del análisis paramétrico.
   3. Analizar datos utilizando un software estadístico con pruebas estadísticas apropiadas basadas en el diseño experimental y la distribución de datos.
   4. Aplicar análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparaciones de un solo factor y ANOVA de dos vías para diseños factoriales (p. ej., interacciones de tratamiento × tiempo).
   5. Utilice la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples cuando ANOVA muestre significancia (p < 0.05), aplicando la corrección de Bonferroni cuando sea apropiado.
   6. Establezca un umbral de significación estadística en p < 0,05 para todos los análisis con notación adicional para p < 0,01 y p < 0,001.
   7. Informe los tamaños del efecto (d de Cohen o η²) y los intervalos de confianza del 95% junto con los valores p para proporcionar una interpretación estadística completa.
   8. Presente los datos como media ± SEM de un mínimo de tres experimentos independientes, con puntos de datos individuales mostrados cuando n ≤ 10.
      NOTA: Todos los experimentos de cultivo celular deben repetirse de forma independiente al menos tres veces, y cada experimento incluye controles apropiados y múltiples réplicas técnicas, y la variabilidad observada (p. ej., CV <15% para datos de comportamiento) se minimizó mediante cegamiento y sincronización estandarizada.

El protocolo demuestra con éxito que la expresión de Mettl3 disminuye en las células microgliales tratadas con LPS (Figura 1), como lo demuestran las reducciones en el nivel de ARNm y proteínas en comparación con los grupos de control (Figura 1B, C). El análisis ELISA confirma la activación inflamatoria mediada por LPS exitosa a través de niveles elevados de IL-6 y TNF-α en sobrenadantes de cultivo (Figura 1A).

El análisis de MeRIP-qPCR revela que la sobreexpresión de Mettl3 mejora la metilación del ARNm M6A de Nrf2, lo que paradójicamente aumenta la estabilidad y expresión de proteínas en lugar de promover la degradación, lo que es consistente con la evidencia emergente de que las modificaciones de m6A pueden mejorar la eficiencia de traducción en contextos celulares específicos (Figura 2A, B). Los experimentos de fraccionamiento de citoplasma nuclear demuestran que, si bien la distribución del ARNm de Nrf2 permanece sin cambios en los compartimentos celulares, los niveles de proteína están significativamente modulados por el estado de expresión de Mettl3 (Figura 2C, D).

Los experimentos in vivo que utilizan modelos de EP inducidos por MPTP muestran que los déficits de comportamiento se correlacionan con cambios moleculares en el eje Mettl3 / Nrf2. Todas las muestras de tejido se obtuvieron de la región estriatal (coordenadas: +0,5 a -0,5 mm del bregma, ±1,5 a ±2,5 mm lateral, -2,5 a -3,5 mm ventral). Los ratones en el grupo Modelo exhiben una precisión reducida en la colocación de las extremidades anteriores, un rendimiento disminuido de la barra rotativa y una disminución de la actividad en campo abierto en comparación con los controles simulados (Figura 3A). La eliminación de Nrf2 exacerba estos déficits, mientras que la sobreexpresión de Nrf2 proporciona protección parcial. El análisis inmunohistoquímico revela una disminución de las poblaciones microgliales (células positivas para Iba1) en las regiones estriatales de los modelos de EP, con la modulación de Nrf2 que afecta la supervivencia microglial en consecuencia (Figura 3B).

Los niveles de citoquinas proinflamatorias (IL-1β, IL-18, TNF-α) aumentan significativamente en los modelos de enfermedad como se esperaba, con el grupo Modelo mostrando niveles elevados en comparación con los controles simulados, y la sobreexpresión de Nrf2 proporcionando efectos antiinflamatorios (Figura 3C). El análisis molecular demuestra marcadores de piroptosis elevados, incluidos GSDMD-N, caspasa-1 escindida y NLRP3 en animales tratados con MPTP, con resultados de Western blot corregidos que muestran marcadores de peso molecular adecuados (Figura 3D). La microscopía electrónica de barrido confirma un aumento de la formación de cuerpos piroptóticos en animales enfermos, con modulación de Nrf2 que afecta el alcance de la muerte celular piroptótica (Figura 3E).

La tinción de DHE combinada con inmunofluorescencia de TPH2 revela niveles elevados de ROS específicamente en las neuronas de serotonina de los modelos de EP (Figura 4A). La colocalización de los productos de oxidación de DHE dentro de los cuerpos celulares positivos para TPH2 indica la generación endógena de superóxido en estas neuronas, consistente con la disfunción mitocondrial inducida por citoquinas inflamatorias y el deterioro de las defensas antioxidantes. La distribución espacial de la señal DHE coincide con la morfología neuronal en lugar de la oxidación tisular difusa, lo que respalda el estrés oxidativo específico del tipo de célula. La inmunohistoquímica muestra una disminución de la expresión de los marcadores neuronales serotoninérgicos TPH2 y SLC6A4 en los grupos Modelo y Modelo + Nrf2-KD, con efectos protectores observados en el grupo Modelo + oe-Nrf2 (Figura 4B). Estos hallazgos indican que la piroptosis microglial conduce al estrés oxidativo y al posterior daño de las neuronas de serotonina.

La vía mecanicista general se resume en la Figura 5, que ilustra cómo la modificación m6A mediada por Mettl3 de Nrf2 suprime la piroptosis microglial y protege las neuronas de serotonina.

Los experimentos exitosos suelen mostrar relaciones claras de dosis-respuesta entre los niveles de expresión de Mettl3 / Nrf2 y los marcadores inflamatorios posteriores. Pueden ocurrir resultados subóptimos debido a una transducción viral incompleta, una activación inadecuada de LPS o problemas técnicos durante el procesamiento de tejidos. Los experimentos de control demuestran consistentemente la especificidad adecuada de los anticuerpos y la ausencia de unión no específica en los análisis inmunohistoquímicos. La eficacia de la infección viral en el cuerpo estriado se validó mediante la colocalización con marcadores Iba1 y NeuN, lo que confirma la orientación microglial predominante.

Figura 1: Infraexpresión de Mettl3 en células microgliales inducidas por LPS. (A) Medición ELISA de los niveles de IL-6 y TNF-α en células microgliales tratadas con LPS. (B) Medición RT-qPCR de los niveles de ARNm de Mettl3 en células microgliales tratadas con LPS. (C) Medición de Western blot de los niveles de proteína Mettl3 en células microgliales tratadas con LPS que muestra Mettl3 a 64 kDa y GAPDH a 36 kDa. **Los datos representan la media ± SEM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Mettl3 afecta la traducción de Nrf2 a través de la modificación de m6A en células microgliales inducidas por LPS. (A) Medición RT-qPCR de los niveles de ARNm de Nrf2 en los grupos oe-NC y oe-Mettl3. (B) Medición MeRIP-qPCR de los niveles de metilación de Nrf2 en los grupos oe-NC y oe-Mettl3. (C) Medición RT-qPCR de los niveles de ARNm de Nrf2 en el núcleo y el citoplasma de los grupos experimentales. (D) Medición de Western blot de los niveles de proteína Nrf2 en grupos experimentales que muestran Nrf2 a 110 kDa y GAPDH a 36 kDa. **Los datos representan la media ± SEM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Demostración in vivo del eje Mettl3 / Nrf2 que desencadena la piroptosis microglial a través del inflamasoma NLRP3. (A) Evaluaciones de comportamiento que incluyen la colocación de las extremidades anteriores, rotarod y pruebas de campo abierto. (B) Detección inmunohistoquímica de la expresión de la proteína Iba en el tejido cerebral (barra de escala = 50 μm). (C) Detección ELISA de citoquinas inflamatorias en el tejido cerebral que muestra una elevación esperada en los grupos modelo con reducción ante la sobreexpresión de Nrf2. (D) Detección de Western blot de marcadores de piroptosis con anotaciones de peso molecular: NLRP3 a 110 kDa, caspasa-1 escindida a 22 kDa, GSDMD-N a 31 kDa y GAPDH a 36 kDa. (E) Detección por microscopía electrónica de barrido de cuerpos piroptóticos (indicados por flechas blancas que muestran vesículas características unidas a la membrana de 1-5 μm). Cuantificación basada en 5 campos por sección, n = 6 animales/grupo. **Los datos representan la media ± SEM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo Sham. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: La piroptosis microglial causa daño mitocondrial y promueve la apoptosis de las neuronas 5-HT. (A) Tinción DHE combinada con inmunofluorescencia TPH2 para la detección de ROS específicamente en neuronas 5-HT (barra de escala = 50 μm). El enfoque de colocalización permite la discriminación del estrés oxidativo dentro de los cuerpos celulares neuronales positivos para TPH2 de las células gliales circundantes. (B) Detección inmunohistoquímica de la expresión de las proteínas TPH2 y SLC6A4 en neuronas 5-HT (barra de escala = 50 μm). **Los datos representan la media ± SEM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo Sham. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Representación esquemática de la supresión mediada por Mettl3 de la progresión de la enfermedad de Parkinson a través de la modificación m6A de Nrf2 y la inhibición de la muerte neuronal 5-HT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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