Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad del Deporte de Pekín (Aprobación nº 2022034A). Las ratas se alojaban individualmente en la instalación veterinaria de la Universidad Deportiva de Pekín bajo condiciones controladas (temperatura: 22-24 °C; humedad: 45%-55%; ciclo de 12 horas luz/oscuridad). Se obtuvieron hembras específicas libres de patógenos (SPF) de 11 semanas y machos de 12 semanas, junto con ratas WKY normotensas de edad igual, de Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Licencia nº SYXK [Pekín] 2021-0053) con fines de cría. Los reactivos y el equipo utilizado para este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Animales experimentales y agrupación
A las ratas preñadas se les proporcionó una dieta estándar de reproducción para roedores y agua ad libitum. Todas las ratas dieron a luz espontáneamente y sus crías fueron destetadas con una dieta estándar de roedores. Para el apareamiento, las hembras y los machos de la misma cepa (WKY o SHR) fueron alojados juntos en una proporción de 1:1. La presencia de un tapón vaginal y esperma en un citologio vaginal se utilizó para designar el día de gestación 1 (GD1). Al confirmar el embarazo, las ratas se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos: normotensa sedentaria (p-WKY-SED), normotensa de ejercicio (p-WKY-EX), hipertensa sedentaria (p-SHR-SED) o hipertensa de ejercicio (p-SHR-EX). Se realizaron análisis experimentales en ratas en el día 21 de gestación (GD21), fetos en el día 21 embrionario (ED21) y en crías masculinas y hembras de 3 hombres de cada grupo.
2. Procedimiento de ejercicio aeróbico materno
Antes del apareamiento, las ratas hembras se aclimataron a la instalación de alojamiento durante una semana, seguida de un periodo de adaptación al agua de 5 días que implicaba 15 minutos de exposición diaria a 10 cm de profundidad mantenida a 34-35 °C. Tras un apareamiento exitoso, las ratas del grupo de ejercicio comenzaron un régimen de natación estructurado. El protocolo comenzó con una fase de adaptación de 4 días en aguas de 40 cm de profundidad (34-35 °C), donde la duración diaria de la natación se incrementó progresivamente de los primeros 20 minutos a 10 minutos cada día. Desde el día 5 hasta el día 20, estas ratas nadaron durante 60 minutos al día, 6 días a la semana. Para controlar el estrés potencial de la inmersión en agua, las ratas de los grupos sedentarios fueron colocadas en aguas poco profundas (10 cm de profundidad, 34-35 °C) durante la misma duración sin participar en nataciónactiva 10.
3. Medición de la presión arterial
Se midieron la presión arterial sistólica (SBP), la presión arterial diastólica (DBP) y la presión arterial media (MAP) en ratas descendientes de 3 millones (tanto machos como hembras) utilizando el sistema de cola y manguito CODA Monitor en condiciones de conciencia y reposo. Todas las mediciones se realizaron en un entorno tranquilo entre las 8:00 y las 12:00 a una temperatura ambiente de aproximadamente 25 °C.
La almohadilla eléctrica se encendía con 1 hora de antelación y se ajustaba a 37-38 °C para asegurar que el dispositivo alcanzara la temperatura requerida antes de medirla. Se seleccionó un sujetivo de tamaño adecuado en función del peso corporal de cada rata, y el animal fue guiado suavemente hacia el sujetador. Tras la fijación, la rata se colocaba sobre la almohadilla calefactora durante 5 minutos para permitir suficiente flujo sanguíneo a la cola. Se seleccionó un manguito de oclusión de tamaño adecuado (O-Cuff) y un manguito de registro de presión volumétrica (VPR-Cuff) en función del tamaño de la cola de la rata. Durante la operación, el O-Cuff se colocó cuidadosamente aproximadamente a 1 cm de la base de la cola, seguido de la colocación del VPR-Cuff sobre la cola. Tras el periodo de aclimatación de 5 minutos, se iniciaron mediciones de la presión arterial mientras la rata permanecía consciente y en reposo. Cada rata pasó por cinco ciclos de aclimatación seguidos de diez ciclos consecutivos de medición para registrar datos de presión arterial. Durante todo el procedimiento, los animales fueron vigilados de cerca y retirados rápidamente del restricción al completar el protocolo de medición.
4. Cirugía de MI/IR en ratas
Las ratas estuvieron en ayunas durante 12 horas antes de la cirugía, con acceso libre al agua. El peso corporal se medía antes de la anestesia. Durante el procedimiento, se indujo la anestesia con isoflurano al 5% y se mantuvo con isoflurano al 2%. Cada rata se colocó en posición supina y se aseguró en una almohadilla térmica ajustada a 37 °C.
La intubación endotraqueal oral se realizó utilizando un catéter de 16 G, que se insertó suavemente en la tráquea y se fijó en su lugar. El catéter se conectó entonces a un sistema integrado de anestesia y ventilación. Los parámetros de ventilación se ajustaron a una frecuencia respiratoria de 70 respiraciones por minuto, un volumen mareal de 8 mL/kg y una proporción inspiratoria-espiratoria de 1:2.
Los electrodos se insertaban subcutáneamente en las extremidades de la rata según la colocación estándar del plomo: negro para la extremidad anterior derecha, verde para la trasera derecha y rojo para la trasera izquierda. Los electrodos se conectaron a un sistema experimental de función biológica y a un bioamplificador, y se realizó la monitorización electrocardiográfica (ECG) utilizando el software LabChart.
Se rapó el vello del pecho de la rata y se desinfectó el lugar quirúrgico con alcohol. Se realizó una incisión en la piel del lado izquierdo del esternón, correspondiente al corazón. Se realizó una disección contundente para exponer las costillas. Se insertó un separador torácico entre la tercera y la cuarta costilla para abrir la cavidad torácica. El pericardio fue cuidadosamente desgarrado y separado para dejar completamente el corazón al descubierto. La gran vena cardíaca que la acompañaba se utilizó como punto de referencia. Aproximadamente 1-2 mm por debajo del apéndice auricular izquierdo, un 8-0 Se suturó a través de la superficie epicárdica para ligar la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD). Se colocó un pequeño tubo de madera en el lugar del nudo y se ató un nudo corredizo para obstruir el flujo sanguíneo. La cavidad torácica se cerró rápidamente después. La ligadura exitosa se confirmó mediante elevación del segmento ST en el electrocardiograma y cianosis visible en la región isquémica del miocardio.
Tras 45 minutos de oclusión, se aflojó el nudo corredizo y se retiró el tubo de madera para iniciar la reperfusión. El aire se expulsaba por la cavidad torácica, que luego se cerraba y se suturaba. El lugar quirúrgico fue desinfectado con povidona-yodo, completando el procedimiento.
Así, se estableció un modelo MI/IR tras 24 horas de reperfusión. Una vez que se reanudó la respiración espontánea, se retiró el tubo endotraqueal y la rata fue devuelto a una jaula limpia.
5. Ecocardiografía
La evaluación ecocardiográfica se realizó utilizando un sistema de ultrasonido Doppler en color de animales pequeños equipado con una sonda de matriz lineal de alta frecuencia L22-8K3 (frecuencia central: 15 MHz). Las ratas fueron anestesiadas con isoflurano al 5% para inducción y mantuvieron bajo el 2% de isoflurano durante todo el procedimiento. Cada rata fue colocada en posición supina y asegurada en la plataforma quirúrgica, manteniendo la temperatura en 37 °C. El estado respiratorio se monitorizaba continuamente y el caudal de isoflurano se ajustaba según fuera necesario para evitar anestesias demasiado profundas o superficiales, que pudieran comprometer la precisión de las mediciones de ecografía cardíaca.
Después de afeitar la zona del pecho, se aplicó la cantidad adecuada de gel acoplador de ultrasonidos. La sonda de ultrasonido se colocó sobre la pared torácica anterior izquierda para obtener imágenes ecocardiográficas en modo M a partir de las vistas parasternales de eje largo y corto del ventrículo izquierdo. Para cada parámetro, se calculó el valor medio de seis ciclos cardíacos consecutivos. La función cardíaca se evaluó midiendo el diámetro interno del ventrículo izquierdo en sístole (LVIDs), el diámetro interno del ventrículo izquierdo en diástole (LVIDd), el acortamiento fraccionado (FS) y la fracción de eyección (FE).
6. Cirugía MCAO en ratas
Las ratas estuvieron en ayunas durante 12 horas antes de la cirugía, pero tenían acceso libre al agua. El modelo MCAO se estableció utilizando un método optimizado de sutura Zea-Longa. Se indujo anestesia con isoflurano al 5% y se mantuvo con isoflurano al 2%. Una vez observada la relajación muscular y estabilizada la respiración y la frecuencia cardíaca, las ratas se colocaban en posición supina y se aseguraban en una almohadilla térmica controlada por termostografía.
La región cervical de la rata se afeitaba y desinfectaba de forma rutinaria. Se realizó una incisión en la línea media ligeramente a la izquierda del cuello y se diseccionaron de forma contundente las capas musculares para exponer y aislar la arteria carótida común izquierda (CCA), la arteria carótida externa (ECA) y la arteria carótida interna (ICA). El ECA fue ligado con hilo fino para sutura, y el CCA y ICA fueron temporalmente pinzados con clips para arterias. Se realizó una incisión en el ECA y el émbolo de sutura se insertó en el CCA a través de la abertura del ECA. Tras transectar el ECA, se tiró suavemente hacia abajo para alinearse con el ICA, facilitando un camino recto para la inserción del émbolo. El émbolo fue cuidadosamente avanzado hacia el segmento intracraneal de la ACI. La inserción se detenía al encontrar una ligera resistencia, lo que indicaba la posición correcta. En este punto, el émbolo se insertó a 18-20 mm de la bifurcación de la ECA y la ICA, correspondiente a la profundidad premarcada, con la punta ocluyendo el origen de la arteria cerebral media (MCA).
El diámetro de la punta del émbolo se seleccionó en función del peso corporal de la rata: 0,31-0,32 mm para ratas <200 g, y 0,38-0,40 mm para ratas que pesan entre 281 y 330 g. Tras confirmar la colocación correcta, se aseguró el émbolo en su lugar, se retiraron los clips de las arterias, se suturó la incisión cutánea y se desinfectó el lugar quirúrgico con povidona-yodo.
La inserción exitosa de la sutura se confirmó mediante una reducción de más del 50% en la perfusión sanguínea en el lado afectado. Tras 2 horas de isquemia, se retiró el émbolo para iniciar la reperfusión. Se estableció un modelo de lesión isquemia-reperfusión cerebral tras 24 horas de reperfusión.
Los déficits neurológicos en ratas se evaluaron 24 horas después del MCAO utilizando el sistema de puntuación Zea Longa. Los criterios de puntuación fueron los siguientes (Tabla 1).
Solo se incluyeron ratas con puntuaciones de Zea Longa del 1 al 3 en los análisis posteriores. Se excluyeron ratas con puntuaciones de 0 o 4 debido a la ausencia de oclusión efectiva o lesión cerebral excesiva, respectivamente.
7. Imagen por contraste de moteas láser (LSCI)
Las ratas estuvieron en ayunas durante 12 horas antes del experimento, pero tenían acceso libre al agua. Se indujo anestesia con isoflurano al 5% y se mantuvo al 2% isoflurano.
Las ratas se colocaban entonces en posición prona y se aseguraban en un aparato estereotáxico. Tras afeitarse y desinfectar el cuero cabelludo, se realizó una incisión en la línea media a lo largo de la sutura sagital para exponer el cráneo. El tejido conectivo y el periosteo de la superficie del cráneo fueron cuidadosamente retirados. Mientras se preservaba la integridad de la duramadre, ambos lados del cráneo se adelgazaban usando un taladro craneal hasta que el hueso se volvía transparente. Se creó una ventana craneal de 8 mm × 15 mm, que permitió visualizar claramente los vasos sanguíneos corticales bajo un microscopio.
Se activó el sistema LSCI, y se ajustó la posición y la distancia focal del dispositivo hasta que la ventana craneal quedó claramente visualizada. Se utilizó una fuente láser de luz con una longitud de onda de 780 nm. El área de iluminación se capturaba usando un dispositivo acoplado de carga con un tiempo de exposición de 15 ms y una tasa de 15 fotogramas por segundo. Se realizó monitorización continua durante 15-30 segundos para obtener imágenes con una resolución de 1280 × 960 píxeles. Posteriormente, el sistema convirtió las imágenes originales de speckle en mapas de flujo sanguíneo y datos cuantitativos de perfusión.
El flujo sanguíneo cerebral basal en las regiones de suministro de MCA en ambos hemisferios se registró por primera vez antes de la isquemia. Luego se suturó y desinfectó el cuero cabelludo antes de iniciar el procedimiento MCAO. El flujo sanguíneo cerebral en ambos hemisferios se monitorizó de forma continua inmediatamente después de la oclusión, 2 horas y 24 horas después de la isquemia.
Durante todo el periodo de monitorización, se mantuvo la anestesia con isoflurano y la almohadilla térmica se reguló para mantener la temperatura corporal de la rata constante en 37 °C. La adquisición de datos comenzó una vez que el animal mostró respiración y ritmo cardíaco estables.
8. Tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
La solución TTC al 2% (p/v) se preparó disolviendo 0,2 g de polvo de TTC en 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). La solución se transfería a un tubo de centrífuga envuelto en lámina, se vórtizaba a fondo para asegurar la disolución completa y luego se colocaba en un baño maria precalentado a 37 °C.
Tras 24 horas de reperfusión, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano al 5% y eutanasiadas mediante exanguinación a través de la aorta abdominal. El corazón y el cerebro fueron extraídos y enjuagados a fondo con 10 mL de PBS. Los tejidos se congelaron rápidamente a −40 °C durante 30 minutos, luego se incrustaron en moldes y se seccionaron coronalmente de anterio a posterior con un grosor de 2-3 mm por corte. Las rodajas se incubaron en una solución de 2% para intentar concebir. Las rodajas de corazón se incubaron en un baño maria a 37 °C protegido de la luz durante 10 minutos, mientras que las lonchas cerebrales se incubaron en las mismas condiciones durante 25 minutos. Las rodajas se giraban cada 5 minutos durante la incubación para asegurar una tinción uniforme. Tras la tinción, las rodajas se enjuagaron tres veces con 10 mL de PBS y se fijaron en 10 mL de formol al 10% durante 24 horas.
Tras 24 horas de fijación, se retiraron las lonchas de tejido y se secaron suavemente con gasa para eliminar el exceso de humedad. Cada rebanada se colocó sobre una placa de vidrio transparente, y se escanearon tanto la parte delantera como la trasera. En las imágenes escaneadas, las regiones blancas indicaban tejido infartado (isquémico), mientras que las regiones rojas representaban tejido viable (no isquémico). El análisis de imagen se realizó utilizando el software ImageJ para calcular la relación del área del infarto tanto de las secciones de miocardio como cerebral. Área del infarto de miocardio (%) = (Área del infarto / Área total de miocardio) × 100%; Área del infarto cerebral (%) = (Área del infarto en el lado MCAO / Área total del hemisferio ipsilateral) × 100%.
9. Notas de seguridad y manipulación de materiales peligrosos
El isoflurano se manipulaba dentro de una campana extractora para evitar la exposición a la inhalación y se almacenaba en un lugar fresco y bien ventilado. El formalín y la concesión se manipularon con guantes de nitrilo y mascarillas faciales para minimizar el contacto con la piel y el riesgo de inhalación. El TTC fue reconocido como fotosensible y, por tanto, se almacenó y utilizó en recipientes envueltos en papel de aluminio.
La zona quirúrgica fue desinfectada con etanol al 75% y todos los instrumentos se autoclavaron a 121 °C durante 20 minutos antes del uso. Los operadores llevaban guantes y batas estériles para mantener condiciones asépticas durante todo el procedimiento.
La monitorización postquirúrgica se realizó cada 6 horas durante 24 horas para garantizar el bienestar animal. Los animales que presentaban un malestar severo, como temblores continuos o falta de alimento y agua, fueron inmediatamente eutanasiados conforme a las directrices éticas institucionales.
Todos los residuos de la TTC y de formalina se recogieron en contenedores etiquetados de biohazard y se eliminaron siguiendo el protocolo institucional de gestión de residuos peligrosos. Los tejidos animales se incineraban en la instalación designada de residuos biológicos de la universidad. Los materiales quirúrgicos contaminados se autoclavaron antes de su eliminación.
10. Análisis estadístico
Todos los datos se presentaron como media ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 8. Las diferencias entre los cuatro grupos se evaluaron mediante análisis bidireccional de la varianza (ANOVA bidireccional; factores: hipertensión y ejercicio). Las comparaciones entre descendencia masculina y hembra se evaluaron utilizando un test t de Student de dos colas sin pareja. Se consideró estadísticamente significativo el valor de < 0,05.