Un método innovador de aislamiento de endosomas de tejidos cardíacos de ratón y cocultivo con cardiomiocitos

Resumen

Los endosomas son una colección de orgánulos de clasificación intracelular que forman parte de la vía de transporte de la membrana endocítica. Establecimos un nuevo método para aislar endosomas del tejido cardíaco utilizando un equipo de nanofiltración automática e investigamos la captación celular de endosomas cocultivándolos con cardiomiocitos primarios.

Resumen

Los endosomas son orgánulos unidos a la membrana que desempeñan funciones esenciales en el tráfico intracelular, la transducción de señales y el reciclaje de membranas. Aunque sus funciones en biología cardiovascular están ganando reconocimiento, el aislamiento eficiente de los endosomas del tejido cardíaco sigue siendo un desafío técnico importante. Desarrollamos un protocolo rápido y de alto rendimiento para aislar endosomas del tejido cardíaco de ratón mediante la combinación de fraccionamiento subcelular con una plataforma de aislamiento de nanofiltración ultrarrápida. Este método incluye centrifugación secuencial, nanofiltración y recuperación de vesículas basada en membranas nanoporosas. Los endosomas aislados se caracterizaron mediante western blotting, dispersión dinámica de luz (DLS) y análisis de citometría de nanoflujo (NanoFCM). Para evaluar la bioactividad, los endosomas purificados se cocultivaron con cardiomiocitos neonatales primarios. Los marcadores endosomales EEA1 y Rab7 estaban altamente enriquecidos en vesículas aisladas. El análisis DLS reveló un diámetro medio de vesícula de 187,30 ± 23,42 nm y un potencial zeta de -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). La cuantificación de NanoFCM arrojó aproximadamente 1,07 ± 0,31 × 10¹² partículas/ml (n = 12) de 100 mg de tejido cardíaco. Se observó una captación funcional de endosomas por parte de los cardiomiocitos después del cocultivo in vitro , lo que indica la preservación de la integridad y actividad de las vesículas. Esta plataforma de aislamiento integrada proporciona un método reproducible y eficiente para la extracción de endosomas de alta pureza de los tejidos cardíacos. El protocolo facilita los estudios bioquímicos y funcionales posteriores, ofreciendo una herramienta valiosa para investigar el papel de los endosomas en la fisiología y la enfermedad cardiovascular.

Introducción

Los endosomas son orgánulos intracelulares esenciales que regulan la endocitosis, la clasificación de la carga y las vías de señalización ^1,2. Los receptores de señalización activados y otras proteínas reguladas a la baja se clasifican inicialmente en vesículas intralumenales (ILV) dentro de los endosomas tempranos (EE), que luego maduran en cuerpos multivesiculares (MVB) o vesículas portadoras endosomales (ECV). Estas vesículas se fusionan posteriormente con endosomas tardíos (LE), que sirven como centros de clasificación secundarios para dirigir la carga hacia la degradación lisosomal o vías alternativas. Los ILV también pueden secretarse como exosomas después de la fusión endosómica con la membrana plasmática ^3,4. Paralelamente, la vía de la autofagia entrega material citosólico a los LE a través de autofagosomas, que adquieren capacidad degradativa al fusionarse con compartimentos endocíticos tardíos⁵. Los endosomas ahora se reconocen como reguladores críticos del reciclaje de receptores⁶, la localización de canales iónicos⁷, la biogénesis de exosomas⁸ y la comunicación intercelular⁹, procesos que son especialmente pertinentes en células especializadas como neuronas y cardiomiocitos.

La evidencia emergente ha destacado el papel fundamental de las vías endosomales en la función cardiovascular. La proteína 3 del dominio de homología Eps15 (EHD3) regula el reciclaje endosómico de los transportadores de iones cardíacos clave, incluido el intercambiador de Na⁺/Ca²⁺ y los canales de Ca²⁺ de tipo L. La deficiencia de EHD3 en ratones conduce a bradicardia, anomalías de conducción y alteración del manejo de Ca^{2+ 10}. El tráfico funcional endosoma-lisosoma en las células del músculo liso vascular previene la calcificación medial inducida por fosfato, que es relevante para la enfermedad renal crónica y la aterosclerosis¹¹. Sin embargo, las funciones de los endosomas en las enfermedades cardiovasculares y su potencial como dianas terapéuticas siguen sin comprenderse completamente, lo que justifica una mayor investigación.

Múltiples métodos han permitido el aislamiento bioquímico de endosomas funcionalmente intactos. Marsh y sus colegas combinaron por primera vez la centrifugación en gradiente de densidad con la electroforesis de flujo libre para recuperar endosomas tempranos y tardíos, preservando su acidificación e integridad estructural¹². Las metodologías recientes, como el enfoque del gradiente de sacarosa, ofrecen una ruta estandarizada para separar las poblaciones endosomales tempranas y tardías, esencial para los estudios proteómicos y lipidómicos posteriores¹³. Se han desarrollado kits comerciales basados en columnas de centrifugación para aplicaciones de alto rendimiento.

El aislamiento de exosomas a través del sistema automático de aislamiento ultrarrápido utiliza una innovadora tecnología de nanofiltración ultrasónica, que tiene un sistema de nanofiltración de doble membrana integrado con oscilación periódica de presión negativa y oscilaciones armónicas de doble acoplamiento para permitir el aislamiento de exosomas de alta pureza de biofluidos¹⁴. Aquí, combinamos el fraccionamiento subcelular con el aislamiento de endosomas utilizando el sistema automático de aislamiento ultrarrápido para lograr un nuevo método para el aislamiento rápido de endosomas con alto rendimiento y alta pureza del tejido cardíaco de ratón.

Además, cocultivamos los endosomas extraídos con cardiomiocitos primarios (MC) in vitro y descubrimos que los endosomas exógenos ingresaron al MC con éxito. Usando un reportero de endosoma, en el que la proteína Numb localizada en el endosoma se fusionó con la proteína fluorescente roja mCherry^15,16, observamos la fluorescencia mCherry localizada dentro de los CM con un patrón de puntuación.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud sobre el Uso de Animales de Laboratorio y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston.

NOTA: Antes de iniciar el procedimiento de aislamiento, es esencial asegurarse de que todos los tampones necesarios se hayan preparado y enfriado a 4 °C. Los instrumentos esterilizados, las placas de cultivo de tejidos y los tubos apropiados deben colocarse en estaciones de trabajo designadas, con todos los materiales mantenidos en hielo o a 4 ° C a menos que se especifique lo contrario. Las centrífugas y los rotores deben preequilibrarse a 4 °C durante un mínimo de 2-3 h antes de su uso. El tampón de fraccionamiento debe prepararse antes del día del experimento y almacenarse a 4 °C, y mantenerse en hielo durante el experimento hasta que se necesite. A menos que se indique lo contrario, todas las etapas de incubación y centrifugación deben realizarse a 4 °C.

1. Preparación del lisado del corazón

1. Desinfecte el área quirúrgica con etanol al 70%, seguido de la colocación de una almohadilla absorbente estéril en la superficie de trabajo, sobre la cual se colocan los instrumentos quirúrgicos esterilizados.
2. Eutanasia ratones (machos C57BL/6, 8-12 semanas, 20-25 g, y mCherry: machos NumbKI, 8-12 semanas, 20-25 g) mediante inhalación de CO₂ (10-30% CO₂ durante 3-5 min) o mediante un método alternativo aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales pertinente.
   PRECAUCIÓN: Opere en un espacio abierto y asegúrese de que el cilindro de CO₂ se cierre a tiempo para evitar fugas. Los ratones deben ser monitoreados durante la eutanasia para confirmar la pérdida de conciencia y el procedimiento adecuado. Una vez inconsciente, use un método secundario, como dislocación cervical, toracotomía o exanguinación, para asegurar la muerte.
3. Coloque el ratón en posición supina y limpie la zona torácica con etanol al 70%.
   1. Abra la cavidad torácica rápidamente para extraer el corazón y transfiéralo a la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) helada en un plato de 60 mm colocado sobre hielo.
   2. Retire la sangre residual suavemente de las cámaras cardíacas con unas pinzas y lave muy bien el corazón hasta que no quede más sangre en las cámaras. Mantenga el corazón en hielo durante todo el procesamiento.
      NOTA: Guarde 50-100 mg de tejido cardíaco para el análisis de western blot (WB) como control positivo. El corazón puede congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses.
4. Agregue 8 ml de tampón de fraccionamiento (Tabla 1) a un tubo de 50 ml en hielo. Transfiera 100-120 mg de tejido cardíaco de ratón fresco o congelado a un tubo que contenga el tampón de fraccionamiento.
   NOTA: Cualquier parte del tejido cardíaco del ratón se puede utilizar para extraer endosomas. Se requiere un mínimo de 100 mg de tejido cardíaco para producir suficientes endosomas para análisis posteriores. Para garantizar la consistencia entre los grupos experimentales, el tejido debe pesarse con precisión antes de la adición al tampón de fraccionamiento.
   PRECAUCIÓN: Use el EPP adecuado cuando opere el tampón de fraccionamiento para evitar cualquier contacto directo con el cuerpo.
5. Picar el tejido en trozos de aproximadamente 1 mm³ con tijeras de microcirugía en tampón de fraccionamiento en hielo todo el tiempo.
6. Homogeneizar con un homogeneizador eléctrico a velocidad media, en un ciclo de parada de 40 s y 30 s. Homogeneizar durante 5-7 ciclos (Figura 1A).
   NOTA: Un proceso de homogeneización completo es esencial y ayudará a aumentar la concentración final de endosomas.
7. Sonicar el lisado de corazón homogeneizado durante 10 min en el baño de agua helada con un baño ultrasónico (Figura 1A).

2. Fraccionamiento subcelular

1. Coloque un filtro celular de 40 μm sobre un tubo de centrifugación de 50 ml y filtre el lisado cardíaco homogeneizado a través del filtro (Figura 1A).
2. Para el pellet nuclear: centrifugar el lisado cardíaco a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante y colóquelo en un tubo nuevo etiquetado.
   NOTA: Recoja el sedimento, que es la fracción nuclear, y vuelva a suspender el sedimento nuclear en un tampón de lisis WB de 200 μL si se necesita la fracción nuclear para WB. Pipetee suavemente el sedimento nuclear con tampón de ensayo de inmunoprecipitación por radio (RIPA) hacia arriba y hacia abajo 20 veces y sonique durante 10 min. Centrifugar el lisado nuclear a 14.000 × g durante 10 min. Recoja el sobrenadante y guárdelo a -80 °C para su uso posterior. El paso 2.2 es opcional; se puede omitir si solo se requieren vesículas.
3. Para la fracción mitocondrial: centrifugar de nuevo el sobrenadante a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C. El gránulo contiene la fracción mitocondrial. Transfiera el sobrenadante y colóquelo en un tubo ultracentrifugado nuevo.
   NOTA: Si se desea una fracción mitocondrial para WB, guarde el gránulo como paso 2.2 como se describe en la NOTA anterior.
4. Equilibre cuidadosamente los tubos. Pese cada tubo y agregue un tampón de fraccionamiento en frío adicional al tubo más liviano para garantizar el mismo peso. Preenfríe el rotor de ultracentrífuga y los adaptadores durante 2-3 h a 4 °C. Ultracentrifugar el sobrenadante a 160.000 × g durante 30 min a 4 °C.
   NOTA: Durante el paso de ultracentrifugación, es fundamental asegurarse de que todos los tubos de ultracentrífuga estén correctamente equilibrados y llenos de tampón a aproximadamente 0,5-1 cm por debajo del borde. Un llenado inadecuado puede provocar la deformación o el colapso del tubo debido a las altas fuerzas centrífugas aplicadas.
5. Retire el sobrenadante en un tubo nuevo. El sobrenadante contiene endosomas. Coloque una jeringa de 10 ml conectada a un filtro de jeringa de 0,45 μm en la parte superior de un tubo de centrifugación de 50 ml y filtre el sobrenadante en el tubo. Agregue 5 ml de tampón PBS esterilizado para diluir la solución y evitar obstruir el filtro.
   NOTA: El paso de filtrado garantiza que todos los endosomas del sobrenadante estén <450 nm al iniciar los pasos de aislamiento.
6. Vuelva a suspender el gránulo con 5 ml de tampón PBS esterilizado del paso 2.4 y pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces para mezclar bien el gránulo. El gránulo contiene otras vesículas intracelulares. Coloque una jeringa de 10 ml conectada a un filtro de jeringa de 0,45 μm en la parte superior de un tubo de centrifugación de 50 ml y filtre la solución de pellets en el tubo. Agregue 5 ml adicionales de tampón PBS esterilizado para diluir la solución y evitar obstruir el filtro.
   NOTA: El paso de filtrado asegura que todas las vesículas del gránulo estén a <450 nm al iniciar los pasos de aislamiento.

3. Proceso de aislamiento de endosomas y otras vesículas intracelulares

1. Diluya el sobrenadante filtrado del paso 2.5 y la solución de pellets filtrada del paso 2.6 con tampón PBS esterilizado hasta un volumen final de 30 ml en tubos de 50 ml, respectivamente. Almacenar las muestras a 4 °C (Figura 1A).
   NOTA: Las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante 24 h. Si no hay tiempo suficiente para llevar a cabo los siguientes pasos el mismo día, se pueden guardar en un frigorífico a 4 °C y luego esperar al día siguiente para continuar con el experimento.
2. Encienda el instrumento e inicie el programa de limpieza diario, que generalmente toma 20 minutos.
3. Elija el dispositivo de aislamiento Medium EXODUS (M EID) para el aislamiento. Instale un adaptador de tubo de 50 ml y coloque el tubo de 50 ml con la muestra en la posición de muestra. Toque EID en la pantalla y cargue M EID.
   NOTA: La EID media es para una muestra de 20-50 ml, recomendando 30 ml.
4. Configurar el programa:
   1. Introduzca el nombre de la muestra y el volumen de la muestra.
   2. Seleccione el tipo de muestra: Plasma.
   3. Seleccionar programa: Plasma. Strong-MA. A03.
   4. Seleccione un tubo de centrífuga: 50 ml.
   5. Active el modo de alta pureza.
   6. Seleccione la opción de programa 3000.
   7. Toca Aceptar para comenzar.
      NOTA: Todo el proceso de aislamiento tarda entre 1 y 2 horas en completarse. Una mayor concentración de muestras llevará más tiempo.
5. Recuperar endosomas y otras vesículas intracelulares:
   1. Recupere el EID y llévelo al capó para los siguientes pasos.
   2. Transfiera 200 μl de tampón PBS esterilizado a la EID con una pipeta de 200 μl. Enjuague ambos lados de la membrana nanoporosa 20 veces, respectivamente.
   3. Recoger los endosomas u otras vesículas intracelulares, resuspender en 200 μL en un tubo de 1,5 mL. Guárdelo a 4 °C si se usa en 24-48 h, o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
      NOTA: El eluido contiene los endosomas u otras vesículas intracelulares y se utiliza para análisis adicionales y cocultivo con cardiomiocitos. La muestra de endosomas es estable cuando se almacena a -80 °C durante 5 meses, según los datos obtenidos.
6. Eluir endosomas y otras vesículas intracelulares para WB:
   1. Recupere el EID. Transfiera 80 μl de tampón de lisis WB a la EID. Enjuague ambos lados de la membrana nanoporosa 20 veces, respectivamente.
   2. Incube la EID en hielo durante 30 min para asegurar una solubilización completa, pipetee el tampón dentro de la EID cada 10 min. Recoja los endosomas u otras vesículas intracelulares lisadas en tubos de 1,5 ml. Centrifugar durante 10 min a 14.000 × g a 4°C. Recoger y almacenar el sobrenadante a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Deseche el pellet si queda algún pellet en el tubo.

4. Cuantificación de proteínas endosómicas y caracterización de vesículas

1. Análisis de Western blot
   1. Guarde 5 μL de cada muestra para cuantificar la concentración de proteínas mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA).
   2. Diluya las muestras en un tampón de muestras Laemmli al 4× y mezcle bien mediante vórtice. Calentar las muestras a 95 °C durante 10 min para desnaturalizar las proteínas.
   3. Centrifugar las muestras desnaturalizadas a 14.000 × g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante resultante para su análisis.
   4. Ensamble geles de poliacrilamida en el aparato de electroforesis y llene la cámara con tampón de funcionamiento de dodecil sulfato de sodio (SDS).
   5. Cargue un marcador de peso molecular y las muestras de proteínas preparadas en el gel, seleccionando un porcentaje de acrilamida apropiado basado en el peso molecular de las proteínas diana.
      NOTA: Por lo general, se cargan 20 μg de proteína por pocillo tanto para lisados de tejido cardíaco como para lisados de endosomas.
   6. Ejecute el gel a 6 V durante aproximadamente 120 min o hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.
   7. Transfiera proteínas del gel a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un sistema de transferencia Western blotting.
      NOTA: El método de transferencia húmeda también funciona bien.
   8. Enjuague brevemente la membrana de PVDF con solución salina tamponada con Tris que contenga 0,05% de Tween-20 (TBST).
   9. Bloquear la membrana con TBST suplementado con albúmina sérica bovina (BSA) al 1% durante 1 h a temperatura ambiente.
   10. Incubar la membrana durante la noche a 4 °C con anticuerpo primario (tabla de materiales) específico para el marcador endosomal seleccionado, utilizando un balanceo suave.
   11. Al día siguiente, lave la membrana tres veces con TBST, cada lavado dura 10 minutos a temperatura ambiente en un balancín.
       NOTA: El lavado adecuado es esencial para reducir el fondo inespecífico; Asegúrese de que la membrana permanezca completamente hidratada durante todo el proceso.
   12. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario apropiado (Tabla de materiales) durante 1 h a temperatura ambiente.
   13. Lave la membrana tres veces con TBST, cada lavado dura 10 minutos en un balancín a temperatura ambiente.
   14. Aplicar sustrato quimioluminiscente a la membrana para la detección de proteínas unidas a anticuerpos.
   15. Usar un sistema de imágenes en gel para exponer la membrana y tomar imágenes de las proteínas.
2. Análisis de dispersión dinámica de luz (DLS)
   1. El tamaño de partícula y el potencial zeta de los endosomas se miden utilizando la técnica de dispersión dinámica de luz (DLS)¹⁷. utilizando un Litesizer 500 (Anton Paar) equipado con la versión 2.10.4 del software Kalliope. Las mediciones de DLS se realizan por triplicado utilizando un láser de 658 nm con un ángulo de detección de 90° a 25 °C.
   2. Haga una dilución de "nanoesferas de tamaño estándar" en agua ultrapura, agregue 1 ml de volumen en la cubeta desechable y colóquela en la cámara.
      NOTA: Utilice nanoesferas estándar (pequeñas o grandes) de acuerdo con el tamaño esperado de la muestra desconocida.
   3. Abra el software DLS y haga clic en la nueva pestaña de medición . Seleccione el tamaño de partícula en el modo de medición. Asigne un nombre al archivo en el campo Sin título y coloque los parámetros de entrada (solvente, temperatura, etc.) y haga clic en iniciar. Después de determinar el tamaño de las partículas estándar, saque la cubeta de la cámara.
   4. Haga una dilución del "material de referencia del potencial zeta" en agua ultrapura, colóquelo en la cubeta omega del potencial zeta y colóquelo en la cámara de la cubeta. Haga clic en la nueva pestaña de medición en el software. Seleccione el potencial zeta en el modo de medición. Asigne un nombre al archivo en el campo Sin título y coloque los parámetros de entrada (solvente, temperatura, etc.) y haga clic en inicio.
   5. Para la determinación del tamaño de partícula y el potencial zeta de los endosomas, diluya la muestra de endosoma en agua ultrapura, colóquela en las respectivas cubetas y colóquelas en la cámara de cubetas. Tome medidas de la misma manera que se describe para los estándares.
      NOTA: Realice una dilución de las muestras desconocidas de acuerdo con la concentración de las muestras en agua ultrapura.
3. Análisis de NanoFCM
   NOTA: Las concentraciones de partículas de endosomas se determinan utilizando NanoFCM Flow NanoAnalyzer con el software Professional Suite V2.3¹⁸. La adquisición de la señal de partículas se realiza durante 2 min utilizando un láser azul de 488 nm ajustado a 20 mW con un 0,2% de decaimiento de SS y/o un láser rojo de 638 nm ajustado a 8 mW con un 10% de decaimiento de SS, a una presión de muestreo de 1,0 kPa modulada y mantenida por un módulo de presión basado en aire. La muestra se enfoca a 1,4 μm utilizando agua ultrapur como fluido de vaina a través de una alimentación por gravedad. La alineación óptima del láser se prueba y calibra utilizando perlas de control de calidad de cóctel de nanoesferas de sílice (S16M-Exo). Las mediciones de calibración de tamaño se realizan antes del análisis utilizando perlas estándar de tamaño S16M-Exo (cóctel de nanopartículas de sílice que contiene diámetros de 68, 91, 113 y 155 nm de partículas con concentración conocida de 2,17 × 10¹⁰/mL).
   1. Adquisición de estándares de concentración:
      1. Inicie e inicialice los fluidos de nanoFCM. Diluya las perlas de control de calidad (1:100) en agua ultrapura filtrada por membrana de 0,22 μm, agréguelas a un tubo de 0,5 ml y colóquelas en el muelle de carga. Seleccione QC FL SiNPs en el menú desplegable Sample Inf e ingrese el factor de dilución de la muestra de perlas de QC.
      2. En el menú desplegable Flujo de muestra , seleccione aumentar para introducir la muestra de control de calidad a alta velocidad y eliminar la solución de limpieza del sistema durante 45 s. Durante el impulso, ajuste la potencia del láser a 20/50 mV para el láser azul de 488 nm y a 20/100 mW para el láser rojo de 638 nm, con un decaimiento del 0,2% de SS.
      3. Seleccione el muestreo en el menú desplegable Flujo de muestra y realice el ajuste del umbral para la señal grande. Durante el muestreo, ajuste manualmente la alineación de la lente de condensación de señal y la alineación de la lente de enfoque láser desde el software, si es necesario. El ajuste automático del umbral para una señal grande debe permanecer entre 50-120 para el canal de dispersión lateral y menos de 75 para ambos canales de fluorescencia.
      4. Haga clic en Tiempo para registrar para adquirir los datos de 120 s. Asegúrese de que la región de interés (ROI) esté entre 1500-15000 al adquirir los datos. Guarde el archivo de resultados en la carpeta emergente con la extensión "nfa" y descargue el tubo de muestra.
         NOTA: Después de cada ejecución de muestra, use una solución de limpieza (1x) para eliminar la muestra procesada del tubo potenciándolo durante 45 s. A continuación, sumerja la punta capilar en agua pura para eliminar la solución de limpieza residual del exterior del capilar antes de cargar la siguiente muestra.
   2. Adquisición estándar de tamaño:
      1. Diluya las "perlas estándar de tamaño" (1:100) en agua de aluminio filtrada por membrana de 0,22 μm y colóquelas en el muelle de carga. Seleccione 68-155 S16M-Exo en el menú desplegable Sample Inf e ingrese el factor de dilución de la muestra de perlas estándar de tamaño.
      2. En el menú desplegable Flujo de muestra , seleccione aumentar para introducir las perlas estándar de tamaño y eliminar la solución de limpieza del sistema durante 45 s. Mientras aumenta, ajuste la potencia del láser a 8/50 mV para el láser azul de 488 nm y 20/100 mW para el láser rojo de 638 nm, con un 10% de decaimiento de SS.
      3. Seleccione Muestreo en el menú desplegable Flujo de muestra y realice el ajuste de umbral para una señal pequeña. Cuatro picos distintos (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) deben ser visibles en la ventana. Haga clic en Tiempo para registrar para adquirir los datos de 120 s. Guarde el archivo de resultados en la carpeta emergente con extensión "nfa" y descargue el tubo de muestra.
   3. Adquisición estándar en blanco:
      1. Utilice agua ultrapura o (tampón/diluyente de la muestra) para realizar la medición en el mismo proceso descrito anteriormente, guarde el archivo con el nombre "blank" en la carpeta con extensión "nfa" y descargue el tubo de muestra.
   4. Determinación de la concentración de partículas de los endosomas
      1. Diluya la muestra de endosoma en agua ultrapura y colóquela en el muelle de carga.
      2. Después de aumentar y muestrear la muestra, haga clic en Tiempo de registro para iniciar las mediciones. Si el umbral no está dentro del rango de 50-120 para el canal de dispersión lateral, o el ROI es superior a 15,000, considere diluir la muestra.
   5. Análisis de datos:
      1. Cambie de la pestaña Adquisición a la pestaña Análisis en el software y abra los archivos "nfa" guardados. Establezca el estándar de concentración abriendo el archivo guardado de resultados de control de calidad date__QC FL SnNPs.nfa, establezca el umbral en señal grande haciendo clic en la herramienta establecer umbral.
      2. Seleccione la concentración de partículas con la herramienta de compuerta circular. Haga clic en Contar STD y verifique la concentración de perlas de control de calidad (2.17 × 10¹⁰ / ml) antes de cerrar la ventana.
      3. Para establecer el estándar de tamaño, abra el archivo date_68-155 S16M-Exo.nfa. Haga clic en la herramienta Tamaño para abrir la ventana de generación de curvas estándar y establezca el umbral para la señal pequeña haciendo clic en la herramienta establecer umbral.
      4. Seleccione S16 exo 68-155 nm en el menú desplegable Definido por el usuario. Haga clic en Buscar picos para identificar las intensidades máximas de SS de las poblaciones de cuatro tamaños.
      5. Seleccione el archivo en blanco y haga clic en Establecer en blanco para identificar el número de falsos positivos para la extracción de la muestra. Para analizar la concentración del endosoma, primero seleccione la muestra y establezca el umbral en una señal pequeña haciendo clic en la herramienta de ajuste de umbral. Presente los datos cuantificados como un informe de tamaño (nm) y concentración (partículas/ml).

5. Cultivo primario de cardiomiocitos

NOTA: Aísle los cardiomiocitos utilizando un kit de aislamiento primario de cardiomiocitos, que proporciona suficientes reactivos para el aislamiento de cardiomiocitos de hasta 50 corazones neonatales de ratón o rata. El kit también incluye componentes que son adecuados para apoyar el cultivo primario de cardiomiocitos. Todos los medios y tampones deben retirarse con precaución para evitar perturbar las células. Se recomienda el pipeteo manual con una punta de pipeta de 1000 μl, se debe evitar la aspiración al vacío. La solución salina equilibrada de Hank (HBSS) debe enfriarse previamente a 4 °C antes de iniciar el procedimiento.

1. Reconstituya la enzima de aislamiento de cardiomiocitos 1 (que contiene papaína), disponible en el kit, agregando 2. ml de HBSS refrigerado en un vial. Mezcle suavemente durante aproximadamente 5 minutos o hasta que la enzima se disuelva por completo. Mantenga la solución enzimática en hielo durante todo el procedimiento.
   NOTA: Un solo vial de enzima 1 reconstituida es suficiente para el aislamiento de cardiomiocitos de 10 corazones neonatales. Se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 6 meses y es estable durante dos ciclos de congelación y descongelación. Si se almacena a 4 °C, la solución debe utilizarse en el plazo de 1 semana para garantizar la actividad enzimática.
2. Coloque los corazones neonatales recién disecados en un individuo estéril 1. mL de tubos de microcentrífuga e inmediatamente agregue 500 μL de HBSS helado a cada tubo.
   NOTA: Se recomienda procesar un corazón por tubo para maximizar el rendimiento y la reproducibilidad.
3. Pica el tejido cardíaco en fragmentos de 1 mm³ con tijeras de disección estériles. Lave cada muestra dos veces con 500 μL de HBSS helado para eliminar la sangre residual.
4. A cada tubo, agregue 200 μL de Enzima 1 de Aislamiento de Cardiomiocitos reconstituida (papaína) y 10 μL de Enzima 2 de Aislamiento de Cardiomiocitos (que contiene termolisina), disponibles en el kit. Mezclar suavemente e incubar los tubos a 37 °C durante 30-35 min.
   NOTA: La enzima de aislamiento de cardiomiocitos 2 se proporciona como suspensión en HBSS y debe descongelarse en hielo antes de su uso. Homogeneice la enzima pipeteando hacia arriba y hacia abajo para garantizar una suspensión uniforme antes de agregarla a las muestras.
5. Después de la digestión enzimática, aspire cuidadosamente la solución enzimática y lave cada muestra dos veces con 500 μL de HBSS helado.
6. Agregue ml de DMEM completo para el aislamiento de células primarias a cada tubo. Triture suavemente el tejido pipeteando hacia arriba y hacia abajo 25-30 veces con una punta de pipeta estéril de 1,0 ml. Minimice la formación de burbujas de aire durante este paso.
   NOTA: La alteración del tejido mediante pipeteo mejora el rendimiento celular. Sin embargo, el pipeteo excesivo puede provocar daños celulares.
7. Centrifugar el sobrenadante a 300 × g durante 5 min.
8. Retire el DMEM completo con cuidado con una pipeta. Añada 1 ml de DMEM completo fresco al tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo 25-30 veces con una punta de pipeta estéril de 1,0 ml. Evite las burbujas de aire al pipetear.
9. Después de que el tejido sea principalmente una suspensión unicelular, agregue 0,5 ml de DMEM completo para el aislamiento de células primarias a cada tubo para llevar el volumen total a 1,5 ml. Combine suspensiones celulares individuales para la determinación de la concentración celular y la viabilidad celular.

6. Cocultivo de endosomas con cardiomiocitos

1. Siembre los cardiomiocitos en un plato de 60 mm y agregue DMEM completo al volumen total.
   NOTA: Se espera que cada corazón de ratón neonatal se siembre en un plato, y se espera que el volumen total de cada pocillo sea de 5 ml (Figura 1B).
2. Incubar la placa de 60 mm a 37 °C en una incubadora de_CO2 al 5% durante 24 h. Después de 24 h, reemplace el medio con un volumen equivalente de DMEM completo fresco para el aislamiento de células primarias que contenga un suplemento de crecimiento de cardiomiocitos diluido 1000x.
3. Transfiera el eluido endosómico producido por el paso 3 de -80 °C a -20 °C durante 1 h. Luego, coloque los endosomas en hielo y descongélelos gradualmente.
   NOTA: La descongelación gradual en hielo puede hacer que la membrana de los endosomas esté más intacta y reducir la degradación.
4. Después de 48 h, mezcle cada 100 μL de eluido endosómico con 5 mL de DMEM completo fresco y reemplace el medio antiguo en cada plato. Cocultivo de endosomas con cardiomiocitos durante 24 h.
5. Lave los cardiomiocitos con 2 ml de PBS estéril en frío. Agregue tampón de lisis helado a cada plato con tampón de lisis de 80-100 μL. Raspe las células con un raspador de células de plástico frío y recoja las células en tubos de 1,5 ml.
6. Realice el protocolo WB descrito en el paso 4.1.
7. Para la inmunotinción (IF), siga los pasos que se describen a continuación.
   1. Siembre los cardiomiocitos en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos. Diluya la suspensión unicelular con DMEM completo de 1,5 ml a 3 ml.
   2. Sembrar 300 μL de la suspensión en cada cámara. Repita los pasos 6.2-6.4.
   3. Fije los cardiomiocitos con 200 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 20 min a temperatura ambiente y lávelos con 200 μL de PBS estéril tres veces. El portaobjetos de cámara de 8 pocillos está listo para IF.
      PRECAUCIÓN: Cuando manipule PFA al 4%, use el EPP adecuado. Deseche el PFA al 4% en un recipiente adecuado después de su uso.

Resultados

Examinamos los niveles de expresión de marcadores para endosomas tempranos, endosomas tardíos, lisosomas y autofagosomas entre cinco grupos: lisado de tejido cardíaco, fracción nuclear, fracción mitocondrial, otras vesículas intracelulares del paso 2.6 y paso 3.6, y endosomas del paso 2.5 y paso 3.6. El resultado de Western blot mostró que EEA1 (antígeno endosomal temprano 1) tenía el nivel de expresión más alto en los endosomas y casi no se expresaba en otros grupos (Figura 2A, B

Discusión

En este estudio, presentamos un método rápido y reproducible para aislar endosomas de alta pureza de tejidos cardíacos de ratón mediante la combinación de fraccionamiento subcelular con una plataforma de aislamiento ultrarrápida¹⁴. Los enfoques tradicionales para el aislamiento de endosomas, como la centrifugación por gradiente de densidad¹² o el aislamiento inmunológico, a menudo requieren mucho tiempo y mano de obra y requieren grandes ca...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
µ-Diapositiva 8 Pozo alto	Ibíd.	80806-90
Tubo de microcentrífuga graduado de 1,5 ml	USA Científico	1615-5500
10x Tampón Tris/Glicina	Bio Rad	1610734
4x Tampón de muestra Laemmli	Bio Rad	1610747
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	Centrífuga Eppendorf 5810R
Albúmina sérica bovina	Sigma	Referencia A9418
colador de células	Corning	CLS431750	Tamaño de poro 40  μ m, estéril
Placas de cultivo de tejidos CELLSTAR	VWR	82050-546	Poliestireno, estéril, 60 mm y agudo; 15 milímetros
Sistema de imágenes ChemiDoc	Bio Rad	ChemiDoc XRS+
Solución de limpieza	NanoFCM	17159
DMEM para kits de aislamiento de células primarias Pierce	Fisher Scientific	PI88287
TDT	Fisher Scientific	BP172
Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Scientific	10010023
Reactivo de detección de Western blot ECL	Bio Rad	1705061
EDTA	Sigma	E4884
EEE1	Señalización celular	3288S	WB (1:1000)
EGTA	Sigma	E-4378-25
EID	ÉXODO	MA03 EID
ERp72	Señalización celular	5033S	WB (1:1000)
Etanol	Tienda de investigación UH		Prueba de 200, 5 galones
ÉXODO H-600	ÉXODO	H-600
GAPDH	Tecnología de proteínas	10494-1-AP	WB (1:5000)
Hank' s solución salina equilibrada (HBSS)	Thermo Scientific	14175095
HEPES	Sigma	H3375
Homogeneizador	Fisher Scientific	15340167
Kcl	Sigma	P3911
Lámpara1	Abcam	AB320851	WB (1:2000)
LC3	Señalización celular	2775S	WB (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	Otros equipos como Zetasizer (Malvern) o DLS  (Wyatt) se puede utilizar
mCereza	Biorbyt	ORB66657	WB (1:500)
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaCl	Sigma	S7653
NanoFCM	NanoFCM	Nanoanalizador de flujo
Estándares de tamaño de nanoesferas	Thermo Scientific	3020A
Microscopio confocal Nikon AXR	Nikon	AXR
Solución de paraformaldehído al 4% en PBS	Biotecnología de Santa Cruz	SC-281692
Sondas de etiquetado de faloidina	Invitrogen	Referencia A22284	SI (1:500)
Kits de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermo Scientific	23227
Kit de aislamiento de cardiomiocitos primarios Pierce	Thermo Scientific	88028
Filtro de jeringa de polietersulfona	Millipore	SLHPR33RS	Tamaño de poro 0.45  μ m, estéril
Geles de proteínas prefabricadas	Bio Rad	4561093
Cuentas de control de calidad	NanoFCM	QS2503
Rab7	Señalización celular	9367S	WB (1:1000)
Tampón de lisis y extracción RIPA	Thermo Scientific	89900
Roche PhosSTOP (Cóctel PI)	Roche	4906837001
Nanoesferas de sílice	NanoFCM	S16M-EXO
Sacarosa	Sigma	84097
Rotor de cubeta oscilante	Beckman Coulter	SW55Ti
Sistema de transferencia Trans-Blot Turbo RTA Kits de transferencia	Bio Rad	1704270
Interpolación 20	Bio Rad	1662404
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XE-90
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	326819
Baño de limpieza ultrasónica	Branson Ultrasonics	CPX952238R
VWR Tubo Cent 50 mL	VWR	89039-656
Centrífuga de tubos VWR de 15 ml	VWR	89039-666
Material de referencia del potencial Zeta	Anton Paar	175108