Un método innovador de aislamiento de endosomas de tejidos cardíacos de ratón y cocultivo con cardiomiocitos

Resumen

Los endosomas son una colección de orgánulos de clasificación intracelular que forman parte de la vía de transporte de la membrana endocítica. Establecimos un nuevo método para aislar endosomas del tejido cardíaco utilizando un equipo de nanofiltración automática e investigamos la captación celular de endosomas cocultivándolos con cardiomiocitos primarios.

Resumen

Los endosomas son orgánulos unidos a la membrana que desempeñan funciones esenciales en el tráfico intracelular, la transducción de señales y el reciclaje de membranas. Aunque sus funciones en biología cardiovascular están ganando reconocimiento, el aislamiento eficiente de los endosomas del tejido cardíaco sigue siendo un desafío técnico importante. Desarrollamos un protocolo rápido y de alto rendimiento para aislar endosomas del tejido cardíaco de ratón mediante la combinación de fraccionamiento subcelular con una plataforma de aislamiento de nanofiltración ultrarrápida. Este método incluye centrifugación secuencial, nanofiltración y recuperación de vesículas basada en membranas nanoporosas. Los endosomas aislados se caracterizaron mediante western blotting, dispersión dinámica de luz (DLS) y análisis de citometría de nanoflujo (NanoFCM). Para evaluar la bioactividad, los endosomas purificados se cocultivaron con cardiomiocitos neonatales primarios. Los marcadores endosomales EEA1 y Rab7 estaban altamente enriquecidos en vesículas aisladas. El análisis DLS reveló un diámetro medio de vesícula de 187,30 ± 23,42 nm y un potencial zeta de -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). La cuantificación de NanoFCM arrojó aproximadamente 1,07 ± 0,31 × 10¹² partículas/ml (n = 12) de 100 mg de tejido cardíaco. Se observó una captación funcional de endosomas por parte de los cardiomiocitos después del cocultivo in vitro , lo que indica la preservación de la integridad y actividad de las vesículas. Esta plataforma de aislamiento integrada proporciona un método reproducible y eficiente para la extracción de endosomas de alta pureza de los tejidos cardíacos. El protocolo facilita los estudios bioquímicos y funcionales posteriores, ofreciendo una herramienta valiosa para investigar el papel de los endosomas en la fisiología y la enfermedad cardiovascular.

Introducción

Los endosomas son orgánulos intracelulares esenciales que regulan la endocitosis, la clasificación de la carga y las vías de señalización ^1,2. Los receptores de señalización activados y otras proteínas reguladas a la baja se clasifican inicialmente en vesículas intralumenales (ILV) dentro de los endosomas tempranos (EE), que luego maduran en cuerpos multivesiculares (MVB) o vesículas portadoras endosomales (ECV). Estas vesículas se fusionan posteriormente con endosomas tardíos (LE), que sirven como centros de clasificación secundarios para dirigir la carga hacia la degradación....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud sobre el Uso de Animales de Laboratorio y con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston.

NOTA: Antes de iniciar el procedimiento de aislamiento, es esencial asegurarse de que todos los tampones necesarios se hayan preparado y enfriado a 4 °C. Los instrumentos esterilizados, las placas de cultivo de tejidos y los tubos apropiados deben colocarse en estaciones de trabajo designadas, con todos los materiales mantenidos en hielo o a 4 ° C a menos qu....

Resultados

Examinamos los niveles de expresión de marcadores para endosomas tempranos, endosomas tardíos, lisosomas y autofagosomas entre cinco grupos: lisado de tejido cardíaco, fracción nuclear, fracción mitocondrial, otras vesículas intracelulares del paso 2.6 y paso 3.6, y endosomas del paso 2.5 y paso 3.6. El resultado de Western blot mostró que EEA1 (antígeno endosomal temprano 1) tenía el nivel de expresión más alto en los endosomas y casi no se expresaba en otros grupos (Figura 2A, B

Discusión

En este estudio, presentamos un método rápido y reproducible para aislar endosomas de alta pureza de tejidos cardíacos de ratón mediante la combinación de fraccionamiento subcelular con una plataforma de aislamiento ultrarrápida¹⁴. Los enfoques tradicionales para el aislamiento de endosomas, como la centrifugación por gradiente de densidad¹² o el aislamiento inmunológico, a menudo requieren mucho tiempo y mano de obra y requieren grandes ca.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
µ-Diapositiva 8 Pozo alto	Ibíd.	80806-90
Tubo de microcentrífuga graduado de 1,5 ml	USA Científico	1615-5500
10x Tampón Tris/Glicina	Bio Rad	1610734
4x Tampón de muestra Laemmli	Bio Rad	1610747
Centrífuga de sobremesa	Eppendorf	Centrífuga Eppendorf 5810R
Albúmina sérica bovina	Sigma	Referencia A9418
colador de células	Corning	CLS431750	Tamaño de poro 40  μ m, estéril
Placas de cultivo de tejidos CELLSTAR	VWR	82050-546	Poliestireno, estéril, 60 mm y agudo; 15 milímetros
Sistema de imágenes ChemiDoc	Bio Rad	ChemiDoc XRS+
Solución de limpieza	NanoFCM	17159
DMEM para kits de aislamiento de células primarias Pierce	Fisher Scientific	PI88287
TDT	Fisher Scientific	BP172
Dulbecco' s solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Scientific	10010023
Reactivo de detección de Western blot ECL	Bio Rad	1705061
EDTA	Sigma	E4884
EEE1	Señalización celular	3288S	WB (1:1000)
EGTA	Sigma	E-4378-25
EID	ÉXODO	MA03 EID
ERp72	Señalización celular	5033S	WB (1:1000)
Etanol	Tienda de investigación UH		Prueba de 200, 5 galones
ÉXODO H-600	ÉXODO	H-600
GAPDH	Tecnología de proteínas	10494-1-AP	WB (1:5000)
Hank' s solución salina equilibrada (HBSS)	Thermo Scientific	14175095
HEPES	Sigma	H3375
Homogeneizador	Fisher Scientific	15340167
Kcl	Sigma	P3911
Lámpara1	Abcam	AB320851	WB (1:2000)
LC3	Señalización celular	2775S	WB (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	Otros equipos como Zetasizer (Malvern) o DLS  (Wyatt) se puede utilizar
mCereza	Biorbyt	ORB66657	WB (1:500)
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaCl	Sigma	S7653
NanoFCM	NanoFCM	Nanoanalizador de flujo
Estándares de tamaño de nanoesferas	Thermo Scientific	3020A
Microscopio confocal Nikon AXR	Nikon	AXR
Solución de paraformaldehído al 4% en PBS	Biotecnología de Santa Cruz	SC-281692
Sondas de etiquetado de faloidina	Invitrogen	Referencia A22284	SI (1:500)
Kits de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermo Scientific	23227
Kit de aislamiento de cardiomiocitos primarios Pierce	Thermo Scientific	88028
Filtro de jeringa de polietersulfona	Millipore	SLHPR33RS	Tamaño de poro 0.45  μ m, estéril
Geles de proteínas prefabricadas	Bio Rad	4561093
Cuentas de control de calidad	NanoFCM	QS2503
Rab7	Señalización celular	9367S	WB (1:1000)
Tampón de lisis y extracción RIPA	Thermo Scientific	89900
Roche PhosSTOP (Cóctel PI)	Roche	4906837001
Nanoesferas de sílice	NanoFCM	S16M-EXO
Sacarosa	Sigma	84097
Rotor de cubeta oscilante	Beckman Coulter	SW55Ti
Sistema de transferencia Trans-Blot Turbo RTA Kits de transferencia	Bio Rad	1704270
Interpolación 20	Bio Rad	1662404
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XE-90
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	326819
Baño de limpieza ultrasónica	Branson Ultrasonics	CPX952238R
VWR Tubo Cent 50 mL	VWR	89039-656
Centrífuga de tubos VWR de 15 ml	VWR	89039-666
Material de referencia del potencial Zeta	Anton Paar	175108