Este artículo demuestra el funcionamiento y el efecto de la microscopía confocal in vivo en el diagnóstico y tratamiento del ojo seco e investiga la aplicación y los resultados de la microscopía confocal in vivo para proporcionar una base para futuras investigaciones.
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Artículo de método
In vivo Microscopía confocal en el diagnóstico y manejo del ojo seco: un enfoque en los protocolos de imagen y la interpretación
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Resumen
Resumen
La microscopía confocal in vivo (IVCM) ha ganado una atención significativa por su naturaleza no invasiva y alta resolución. Permite la observación in vivo y la cuantificación objetiva de numerosas estructuras de la superficie ocular relacionadas con la enfermedad del ojo seco (DED), incluida la córnea, la conjuntiva, el margen del párpado, las glándulas de Meibomio y parásitos como Demodex, a nivel celular. Esta capacidad ayuda a los oftalmólogos a identificar etiologías y subtipos específicos de ED, lo que facilita el diagnóstico preciso, el tratamiento dirigido y la evaluación pronóstica. Sin embargo, siguen faltando protocolos estandarizados para la operación y la presentación de informes de IVCM. La competencia tanto en el conocimiento oftálmico como en la operación técnica es esencial para utilizar eficazmente este dispositivo y generar informes de alta calidad. Este artículo detalla los pasos del procedimiento y los matices del examen IVCM para pacientes con ED. Este es el primer protocolo IVCM paso a paso de JoVE para DED. Su objetivo es servir como referencia para los médicos, ayudándoles a evitar ineficiencias operativas y obtener constantemente imágenes de la superficie corneal y ocular de alta calidad para guiar el manejo clínico.
Introducción
Debido a las limitaciones de los recursos médicos locales o a las cargas financieras de los pacientes, el diagnóstico clínico de la DED a menudo se centra solo en un aspecto básico (p. ej., observación bajo el microscopio con lámpara de hendidura, queja de sequedad y picazón en los ojos) o incluso en un solo indicador (p. ej., tiempo de ruptura de la película lagrimal invasiva, prueba de secreción lagrimal o infestación por Demodex). La aplicación IVCM no está ampliamente disponible, y mucho menos estandariza los protocolos para ella. Sin embargo, para las instituciones oftálmicas equipadas con IVCM, el autor recomienda que los pacientes primerizos se sometan a un examen microscópico completo para evitar omisiones, incluida la córnea, la conjuntiva y el margen palpebral. Para casos equívocos de DED o para detectar Demodex, IVCM es especialmente adecuado para una respuesta explícita.
La enfermedad del ojo seco (DED) se define como una afección crónica de la superficie ocular causada por anomalías en la calidad o cantidad del líquido lagrimal y disminución de la estabilidad de la película lagrimal. En el Taller de Ojo Seco II (DEWS II), DED se clasifica en cinco tipos: ojo seco con deficiencia acuosa (ADE), ojo seco evaporativo (EDE), ojo seco mixto (MDE), predisposición al ojo seco y estado preclínico de ojo seco1. Ralene et al. resumieron la importante práctica clínica de la MCIV en diferentes tipos de ojo seco, incluyendo la literatura publicada de 2017 a 20222. Investigaciones recientes han demostrado que la inflamación juega un papel clave en la patogénesis de la DED 3,4. Especialmente, la densidad de células dendríticas (DC) puede ser un buen indicador de DED asociada con un proceso sistémico inmunomediado5.
El IVCM utiliza tecnología de tomografía láser confocal. Ofrece resoluciones horizontales y verticales de 1 μm. Las especificaciones técnicas detalladas del dispositivo están documentadas en el informe de Jeremy et al6. Durante el examen de la superficie ocular, la MCVI se aplica primero a la córnea7, seguida de la conjuntiva y las glándulas de Meibomio8. La blefaritis por Demodex ha recibido una atención clínica cada vez mayor en los últimos años 9,10. La MCIV proporciona imágenes claras de la córnea, la conjuntiva y el margen palpebral. Estas imágenes permiten a los médicos evaluar el estado de la enfermedad y facilitan la obtención de imágenes y la cuantificación de las células inflamatorias e inmunitarias.
En la evaluación de la EOS, nuestro enfoque incluye: células epiteliales corneales (CIC); fibras nerviosas subepiteliales (SNF); células inflamatorias/inmunitarias interepiteliales y subepiteliales; células caliciformes conjuntivales (CGC); células inflamatorias/inmunitarias conjuntivales; acinos y orificios de las glándulas de Meibomio; Demodex folliculorum y Demodex brevis; y células inflamatorias dentro de los tejidos circundantes. Este énfasis se deriva de la fisiopatología: la disfunción de las glándulas de Meibomio conduce a una secreción reducida o una composición alterada de la capa lipídica de la película lagrimal, lo que resulta en una evaporación lagrimal acelerada y daño a la superficie ocular. La infestación de Demodex contribuye a la picazón y las molestias oculares. Los CGC secretan mucina, un componente crítico de la película lagrimal; su agotamiento puede causar DED deficiente en mucina. Por el contrario, la DED en sí misma daña las estructuras de la superficie ocular, incluidas la CEC y la SNF, y posteriormente eleva la densidad de células inflamatorias / inmunes en los tejidos corneales y conjuntivales. Después de obtener las imágenes ideales, podemos utilizar de manera efectiva las herramientas cuantitativas integradas del software para contar las multitudinarias celdas mencionadas (Figura 1). Pero para la diversidad morfológica de SNF, necesitamos confiar en el software analítico para ayudar con la cuantificación11,12.
La IVCM es indispensable para la evaluación en tiempo real de las capas corneales, las fibras nerviosas y las células inflamatorias/inmunitarias en los tejidos de la superficie ocular. Para evaluar las CGC, la citología de impresión sirve como método alternativo. Esta técnica se dirige a la conjuntiva del fórnix, donde la densidad de células caliciformes alcanza su punto máximo, produciendo valores típicamente más altos que las mediciones de IVCM13,14. Sin embargo, los resultados están sujetos a la variabilidad de la tinción y a la experiencia del operador, mientras que el protocolo requiere mucho tiempo limita la implementación clínica rutinaria. La obstrucción del orificio de la glándula de Meibomio es directamente observable a través de la microscopía con lámpara de hendidura, pero este método no puede detectar bloqueos inducidos por Demodex brevis, que IVCM identifica con precisión. Para diagnosticar la infestación por Demodex, la depilación de pestañas con microscopía óptica proporciona un método de bajo costo. Si bien es técnicamente simple, este enfoque conlleva limitaciones significativas: la incomodidad del paciente restringe el muestreo múltiple, los ácaros que residen en lo profundo de los folículos de las pestañas o los orificios de las glándulas de Meibomio permanecen indetectables15. Por el contrario, IVCM permite un examen completo de múltiples sitios de márgenes del párpado, incluidos los folículos de las pestañas y los orificios de las glándulas de Meibomio, con una molestia mínima para el paciente. Este enfoque logra tasas de positividad diagnóstica sustancialmente más altas a través de la visualización in vivo en tiempo real de los parásitos dentro de sus microhábitats16,17.
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Protocolo
El procedimiento de examen ha sido aprobado por el Comité de Ética del Hospital Oftalmológico Hankou Aier y se ha obtenido el consentimiento informado de todos los pacientes.
NOTA: Los criterios de inclusión para la selección de pacientes incluyen pacientes que presentan quejas de sequedad y picazón en los ojos, y personas que buscan exámenes oculares de rutina. Los criterios de exclusión para la selección de pacientes incluyen pacientes con perforación corneal o perforación corneal inminente, aquellos alérgicos a los anestésicos oculares tópicos, individuos demasiado jóvenes (p. ej., menores de 3 años) o demasiado mayores para cooperar, pacientes con fisuras palpebrales estrechas que no pueden acomodar un espéculo palpebral, mujeres embarazadas e individuos que no pueden cooperar por otras razones. En la Figura 2 se puede encontrar un breve diagrama de flujo de trabajo. Y los pasos de operación detallados son los siguientes.
1. Examen previo
- Preparación de materiales: dispositivo IVCM, tapa de contacto corneal, anestésico tópico oftálmico, agente de acoplamiento, hisopos médicos de algodón, espéculo palpebral, bolas de alcohol, depósito de alcohol, gotas oftálmicas antiinflamatorias (Figura 3).
- Comprenda los componentes clave del equipo IVCM (módulo de córnea Rostock de tomografía retiniana de Heidelberg (HRT-RCM)), perilla de enfoque, cámara de monitoreo, luz de guía de la mirada, mentonera, reposacabezas, botón para cambiar entre ojos izquierdo / derecho, perillas giratorias para mover HRT-RCM triaxialmente, botón de captura de imágenes y pedal, computadora con software IVCM dedicado) y prepare el dispositivo IVCM con gel de acoplamiento.
- Preparación del examinador: Use una máscara y desinfecte las manos con gel a base de alcohol o use guantes desechables.
- Desinfección del dispositivo: Limpie la frente y los mentones del equipo con hisopos con alcohol.
- Explicación del procedimiento: Explique brevemente al paciente que el examen es indoloro para aliviar la ansiedad.
2. Durante el examen
- Verifique y cree un nuevo registro de paciente con el software adjunto en la computadora.
- Administrar anestésico tópico: Administre dos gotas en la parte inferior del fórnix a un intervalo de 3 minutos antes del procedimiento.
- Prepare el módulo de córnea rostock (RCM) del dispositivo IVCM: Cubra el área emisora de láser de RCM con gel de acoplamiento (asegúrese de que no haya burbujas de aire) (Figura 4 y Figura 5), y solo una cantidad suficiente de agente de acoplamiento (generalmente una o dos gotas, no demasiado) puede garantizar el contacto completo con la tapa de contacto corneal y, en última instancia, lograr la interfaz de puesta a cero ideal. Coloque una tapa de contacto corneal desechable.
- Coloque el dispositivo: Retraiga el RCM por completo. Asegure el reposacabezas horizontalmente. Ajuste la cámara de monitoreo al lado temporal del sujeto. Encuentre la posición del punto de parada de la cámara, que es perpendicular al eje óptico del RCM.
- Calibrar enfoque: gire la perilla de enfoque hasta que el software muestre un fácula blanco maximizado con el valor de calidad de imagen exactamente 100. Restablezca el valor de profundidad a cero (puesta a cero).
- Seleccionar modo de escaneo: Predeterminado en Modo de sección a menos que se especifique lo contrario. Para observar la actividad de los ácaros Demodex, se puede utilizar el modo de secuencia para la grabación continua de imágenes dinámicas.
- Coloque a los pacientes: Apoye la barbilla firmemente en el mentón. Presione su frente contra el reposacabezas. Ajuste la mesa de examen y el mentón a la altura del paciente.
- Inserte el espéculo del párpado: Pídale al paciente que mire hacia abajo mientras usa un hisopo de algodón para levantar el párpado superior para colocarlo, y pídale al paciente que mire hacia arriba mientras tira suavemente hacia abajo del párpado inferior con un hisopo de algodón para colocarlo.
- Instrucciones finales: Vuelva a confirmar la posición adecuada de la cabeza. Recuérdele al paciente que permanezca relajado y evite el movimiento. Informe cualquier molestia de inmediato.
- Protocolo de examen de la córnea
- Comience con la alineación macroscópica: ajuste visualmente el RCM para aproximarse al ápice corneal (Figura 6). Cambie a la cámara de monitoreo del dispositivo para realizar ajustes precisos a medida que el RCM se acerca a la córnea. Guiar al paciente para que gire la mirada en busca de córneas lesionales, centrando la lesión debajo de la MCR. Mantenga un contacto suave para evitar daños en la córnea.
- Técnica clave: La tapa de contacto corneal tiene un gran tamaño físico pero una zona óptica extremadamente pequeña (limitada al área central emisora de láser). Requisito crítico: Logre un contacto de alta precisión entre la tapa y el tejido objetivo, ya que la mala adhesión causa artefactos de imagen (por ejemplo, burbujas, interferencia de aceite o pérdida completa de señal).
NOTA: Para obtener imágenes continuas, presione el pedal para un escaneo prolongado para capturar imágenes de profundidad secuenciales y evitar perder datos críticos.
- Evaluación corneal en capas: Escanee desde las capas superficiales hasta las profundas en este orden: CEC, SNF, células inflamatorias subepiteliales.
- Concéntrese en el verticilo inferior, que es el punto de referencia recomendado, y las regiones superiores / inferiores adyacentes18.
- Examen nasal conjuntival
- Restablezca el plano focal al valor de profundidad de cero. Aplique gel de acoplamiento a la tapa. Indique al paciente que mire temporal o inferotemporalmente. Avance el RCM suavemente sobre la superficie conjuntival. Maniobras simultáneas: Ajuste la posición del RCM para un campo de visión óptimo con la mano derecha. Gire la perilla de enfoque para identificar las células caliciformes en la capa conjuntival más externa con la mano izquierda.
- Extracción del espéculo del párpado: indique al paciente que mire hacia abajo y use un hisopo de algodón para levantar el párpado superior para extraerlo. E indique al paciente que mire hacia arriba y presione suavemente el párpado inferior con un hisopo para extraerlo.
- Reinicio del dispositivo: Suelte y eleve el reposacabezas. Ponga a cero la perilla de enfoque. Vuelva a aplicar gel de acoplamiento a la superficie RCM.
- Evaluación de la glándula de Meibomio y los folículos de las pestañas
- Posicionamiento del paciente: Instruir la mirada hacia abajo. Maniobra del examinador: Eleve suavemente y presione la piel del párpado superior hacia adentro para alinear el margen del párpado paralelo al plano de la tapa corneal. Mueva el RCM horizontalmente para ver más imágenes de la misma estructura de tipo; mueva el RCM verticalmente (de abajo hacia arriba) para pasar de examinar los orificios de las glándulas de Meibomio a los acinos de la glándula y luego a las raíces de las pestañas.
NOTA: Los principiantes pueden echarle el párpado para una mejor exposición al examinar los orificios de la glándula de Meibomio. Sugerimos la ubicación de la inspección en el 1/3 central del párpado superior para esta parte. - Estándares cuantitativos (protocolo institucional): Evaluar 8 folículos consecutivos con acinos15 adyacentes y examinar 4-8 orificios secuenciales de las glándulas. Calibración de profundidad: Para adquirir imágenes claras de los folículos, enfoque hasta que los ácaros Demodex muestren bordes nítidos (si están presentes). Para adquirir imágenes claras de acinis, el valor recomendado es de aproximadamente 30-50 μm de profundidad. Y para los orificios, es de alrededor de 30 μm (ajuste la visibilidad de Demodex brevis si está infestado)19.
- Posicionamiento del paciente: Instruir la mirada hacia abajo. Maniobra del examinador: Eleve suavemente y presione la piel del párpado superior hacia adentro para alinear el margen del párpado paralelo al plano de la tapa corneal. Mueva el RCM horizontalmente para ver más imágenes de la misma estructura de tipo; mueva el RCM verticalmente (de abajo hacia arriba) para pasar de examinar los orificios de las glándulas de Meibomio a los acinos de la glándula y luego a las raíces de las pestañas.
3. Examen posterior
- Cuidados posteriores al procedimiento: Realice la higiene de manos y desinfecte bien las manos. Limpie suavemente el gel de acoplamiento residual, las lágrimas o los desechos de la superficie ocular con un hisopo de algodón. Administre gotas antibióticas para los ojos para prevenir infecciones.
- Instrucciones para el paciente: Aconseje al paciente que evite frotarse los ojos el día del examen.
- Informes: analice todas las imágenes adquiridas de forma exhaustiva y genere un informe de diagnóstico. Requisitos de informes: Incluya al menos una imagen por estructura de tejido, agregando más para hallazgos anormales según sea necesario. Todas las imágenes seleccionadas deben organizarse por secuencia de examen y valor de profundidad, seguidas de descripciones y mediciones precisas.
- Instrucciones de eliminación de residuos: Para materiales desechables (tapas de contacto, hisopos, recipientes anestésicos), tírelos al contenedor de desechos médicos para su posterior eliminación profesional.
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Resultados
Todas las imágenes microscópicas de IVCM se adquirieron a una resolución de 384 píxeles × 384 píxeles, un campo de observación de 400 μm × 400 μm. Cuando se "pone a cero" correctamente, este examen mostrará solo tres resultados posibles en el marco de la imagen: i) Ninguna imagen en absoluto (experimento fallido): la zona óptica central no hizo contacto con el tejido objetivo. ii) Solo una imagen parcial (Figura 7) u otras situaciones anormales (
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Discusión
Una búsqueda bibliográfica en PubMed utilizando las palabras clave "microscopía confocal in vivo " y "enfermedad del ojo seco" (recuperada en junio de 2025) arrojó > 300 publicaciones. En particular, las tasas de publicación anual se han estabilizado en aproximadamente 40 artículos por año desde 2021. Las aplicaciones más amplias de la MCVI en los trastornos de la superficie ocular han generado > 2.000 estudios en las últimas dos décadas (2004-2024). Clínicamente, la MCVI ha rev...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Lina Jin del Hospital Oftalmológico Hankou Aier y a Min Chen del Departamento de Oftalmología del Hospital del Corazón de Wuhan Asia por ayudar con algunas imágenes, y a todos los participantes y miembros del personal que trabajan para el procedimiento quirúrgico. Esta investigación fue apoyada por una subvención de Proyectos de Investigación Científica de la Comisión Municipal de Salud de Wuhan (WX23A20).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bolas de algodón absorbentes | JIAN QI, China | http://www.hnjianqi.com | Para hacer bolas de alcohol, pequeñas |
| Gel a base de alcohol | Li Kang, Shanghái, China | 31107904 | Gel antiséptico de manos sin enjuague, 500 ml |
| Colirios Carbomer | Vidisic, Alemania | 8187195 | Gel oftálmico estéril para agente acoplador, 10g |
| Tapa de contacto córnea (TomoCap) | Heidelberg, Alemania | 18829 | Medio óptico y córnea de contacto aséptica |
| Espéculo del párpado | Asicon, China | 6102A | Por abrir los ojos |
| Software Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg, Alemania | Versión 1.5.2.0 | El software que viene con el dispositivo IVCM |
| Dispositivo IVCM | Heidelberg, Alemania | HRT-?,08398 | El equipo principal del examen |
| Hisopos de algodón médicos | Esound Med, China | www.e-soundmed.com | Para limpiar los ojos de los pacientes y ayudar a abrirlos, 10 cm |
| 75% Alcohol medicinal | HUICHANG, China | www.huichang888.cn | Para hacer bolas de alcohol, 75% y plusmn; 5% 500ml |
| Gotas oculares de oxibuprocaína clorhidrato al 0,4% | Santen, Japón | http://www.santen.co.jp | Anestésico tópico oftálmico, 0,4% (0,5ml: 2mg) |
| Gotas para los ojos de tomamisina | TOBREX, Bélgica | 8453824 | Colirios antiinflamatorios, 0,3% (5ml: 15mg) |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
