CLCF1 Protocolo de mioquina inducida por el ejercicio para investigar los mecanismos de protección ósea RANKL / OPG en la osteoporosis posmenopáusica

Houling Zhao; Hongfei Li; Yanbin Sun

doi:10.3791/69172

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CLCF1 Protocolo de mioquina inducida por el ejercicio para investigar los mecanismos de protección ósea RANKL / OPG en la osteoporosis posmenopáusica

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DOI:

10.3791/69172

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7 de noviembre de 2025

Houling Zhao¹ , Hongfei Li¹ , Yanbin Sun¹

¹Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo completo para investigar el factor 1 de citoquinas similares a la cardiotrofina (CLCF1) como mediador inducido por el ejercicio de la protección ósea a través de la modulación del eje RANKL / OPG en la osteoporosis posmenopáusica.

Resumen

Estudios recientes han identificado el factor 1 de citoquinas similar a la cardiotrofina (CLCF1) como una "molécula de juventud" inducida por el ejercicio que media los beneficios musculoesqueléticos, pero disminuye con la edad. Este protocolo describe un enfoque sistemático para investigar el papel regulador de CLCF1 en la protección ósea mediada por el ejercicio a través de mecanismos de diafonía inmunoósea. La metodología abarca el análisis de muestras clínicas, técnicas de caracterización molecular y ensayos funcionales para dilucidar la influencia de CLCF1 en el activador del receptor del eje de señalización del ligando del factor nuclear κB (RANKL)/osteoprotegerina (OPG). A través de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), western blotting, edición de genes CRISPR / Cas9 y sistemas de cocultivo, este protocolo demuestra las acciones duales de protección ósea de CLCF1 a través de la inhibición de osteoclastos mediada por STAT1 y la promoción de osteoblastos mediada por STAT3. Los métodos descritos permiten la evaluación integral de los patrones de expresión de CLCF1, los análisis de correlación con los parámetros de densidad mineral ósea y la evaluación mecanicista de posibles intervenciones de tratamiento mimético del ejercicio. A diferencia de las terapias antirresortivas tradicionales que se dirigen principalmente a los osteoclastos, las intervenciones basadas en CLCF1 pueden ofrecer la ventaja única de promover simultáneamente la formación ósea al tiempo que inhiben la reabsorción. Este protocolo proporciona a los investigadores procedimientos estandarizados para investigar la regulación del metabolismo óseo mediada por citoquinas inducida por el ejercicio y facilita el desarrollo de intervenciones terapéuticas específicas para los trastornos óseos relacionados con la edad.

Introducción

La osteoporosis postmenopáusica (PMOP) representa un ejemplo paradigmático de deterioro musculoesquelético relacionado con la edad en el que la desregulación del sistema inmunológico precipita la pérdida ósea patológica ^1,2,3. Aunque el ejercicio es ampliamente reconocido como la intervención no farmacológica más efectiva para prevenir el deterioro óseo relacionado con la edad, los mecanismos moleculares precisos que subyacen a la protección ósea inducida por el ejercicio han permanecido esquivos hasta hace poco⁴. La comprensión contemporánea del metabolismo óseo ha evolucionado más allá de los marcos endocrinológicos tradicionales para abarcar interacciones osteoinmunes complejas y mioquinas inducidas por el ejercicio que gobiernan la homeostasis esquelética⁵.

La reciente identificación del factor de citoquinas similares a la cardiotrofina 1 (CLCF1) como un factor inducido por el ejercicio que combate el deterioro musculoesquelético relacionado con la edad representa un cambio de paradigma en la comprensión de la diafonía hueso-músculo⁶. Este descubrimiento innovador explica los efectos protectores óseos bien establecidos del ejercicio a través de un mecanismo molecular previamente desconocido, posicionando a CLCF1 como el mediador clave del osteoanabolismo inducido por el ejercicio⁷. Los ratones transgénicos que sobreexpresan CLCF1 demostraron una mayor formación ósea, una mejor tolerancia a la glucosa y un rendimiento físico superior en comparación con los controles de tipo salvaje⁶, lo que sugiere que la suplementación con CLCF1 podría imitar los beneficios del ejercicio en poblaciones sedentarias o con movilidad reducida.

El tratamiento mimético del ejercicio se define como intervenciones farmacológicas que replican la cinética CLCF1 inducida por el ejercicio, proporcionando beneficios terapéuticos similares a la actividad física a través de vías moleculares⁸. El factor 1 de citocinas similares a la cardiotrofina (CLCF1), alternativamente designado como neurotrofina-1 (NNT-1) o factor estimulante de células B-3 (BSF-3), pertenece a la superfamilia de citocinas interleucina-6 (IL-6) y exhibe funciones biológicas pleiotrópicas⁸. Originalmente caracterizado por sus propiedades neurotróficas en la supervivencia y el desarrollo de las neuronas motoras espinales, el papel de CLCF1 como mioquina inducida por el ejercicio se ha convertido en un área importante de investigación. Estudios clínicos recientes han validado CLCF1 como un biomarcador para el estado de salud ósea, demostrando que los niveles de proteína CLCF1 en células mononucleares de sangre periférica disminuyen significativamente en mujeres posmenopáusicas con osteoporosis en comparación con controles sanos⁹. Estos estudios mostraron correlaciones positivas entre la expresión de CLCF1 y la densidad mineral ósea en múltiples sitios esqueléticos, proporcionando una validación clínica que fortalece el potencial traslacional de las intervenciones terapéuticas dirigidas a CLCF1.

Las citocinas operan a través de complejos receptores heteroméricos, incluidos los receptores del factor neurotrófico ciliar soluble (sCNTFR) y el factor similar al receptor de citoquinas 1 (CRLF-1), para orquestar diversas respuestas celulares^10,11. Estudios mecanicistas recientes han dilucidado el paradigma de señalización dual por el cual CLCF1 inhibe simultáneamente la reabsorción ósea y promueve la formación ósea 2,6,7,9. Esta doble acción se produce a través de la activación del transductor de señal diferencial y activador de la vía de transcripción (STAT): la fosforilación de STAT1 media la supresión de osteoclastos al interferir con el activador del receptor de la señalización del factor nuclear κB (RANKL) inducida por el factor nuclear κB (NF-κB), mientras que la activación de STAT3 en osteoblastos promueve la expresión de marcadores de formación ósea, incluida la fosfatasa alcalina y la osteocalcina.

Comprender cómo las respuestas agudas al ejercicio se traducen en adaptaciones óseas crónicas sigue siendo fundamental para el desarrollo terapéutico¹³. Si bien la elevación aguda de CLCF1 después de sesiones de ejercicio único proporciona información mecanicista, las respuestas agudas repetidas durante semanas o meses pueden conducir a efectos protectores óseos sostenidos a través de la señalización acumulativa y las adaptaciones celulares¹⁴.

La justificación para investigar CLCF1 en la fisiopatología osteoinmune se deriva de su papel establecido en la regulación de los linfocitos B y el reconocimiento de que las células B constituyen productores significativos tanto de RANKL como de osteoprotegerina (OPG)^12,13. El activador del receptor del eje ligando del factor nuclear κB (RANKL)/osteoprotegerina (OPG) sirve como mecanismo regulador central para la diferenciación de osteoclastos y la resorción ósea^14,15. A diferencia de otros miembros de la familia IL-6 que han demostrado control regulador sobre la homeostasis esquelética a través de la modulación de la remodelación ósea, el mecanismo único de protección ósea dual de CLCF1 ofrece un potencial terapéutico superior 16,17,18.

Las ventajas de este protocolo sobre las metodologías existentes incluyen su enfoque integral para la investigación osteoinmune del ejercicio, incorporando tanto análisis de correlación clínica como estudios celulares mecanicistas para proporcionar información traslacional sobre la regulación del metabolismo óseo mediada por CLCF1. La relevancia clínica de este protocolo se ve reforzada por la evidencia emergente de que los niveles de CLCF1 se pueden modular a través de intervenciones en el estilo de vida, posicionándolo como un objetivo terapéutico procesable para los trastornos óseos relacionados con la edad.

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Protocolo

Este protocolo ha sido aprobado por el comité institucional de ética en investigación (Protocolo #2024-CHSD-0156) y se adhiere a los principios de la Declaración de Helsinki. Todos los procedimientos con animales cumplieron con las pautas del comité institucional de cuidado y uso de animales (Protocolo #2024-037). Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.

1. Recolección de muestras clínicas y evaluación de la intervención con ejercicios

Reclutamiento de participantes y evaluación del historial de ejercicios
1. Reclutar mujeres posmenopáusicas de 55 a 75 años con una duración mínima de 1 año posmenopáusica.
2. Evaluar el historial detallado de ejercicios, incluida la frecuencia, la intensidad, el tipo y la duración de la actividad física durante los últimos 6 meses mediante cuestionarios estandarizados de actividad física.
3. Clasifique a los participantes en grupos sedentarios (< 150 min/semana), moderadamente activos (150-300 min/semana) y muy activos (> 300 min/semana) según las pautas de ejercicio de la OMS.
4. Realizar una evaluación integral del historial médico y un examen físico, incluida la revisión de medicamentos y la detección de comorbilidad.
5. Obtenga mediciones de absorciometría de rayos X (DXA) de energía dual utilizando el densitómetro Hologic Discovery A con el software APEX v4.5. Realice una calibración diaria con el maniquí de la columna vertebral. Coloque al paciente en decúbito supino con las piernas elevadas en un bloque de posicionamiento según las pautas de la Sociedad Internacional de Densitometría Clínica (ISCD).
6. Clasificar a los participantes según los criterios de osteoporosis de la Organización Mundial de la Salud (T-score ≤ -2,5 DE).
7. Aplicar criterios de exclusión: Terapia antiosteoporótica previa en 12 meses, tratamientos inmunosupresores, enfermedades óseas metabólicas, osteoporosis secundaria o contraindicaciones para la prueba de esfuerzo.
Evaluación de la respuesta CLCF1 inducida por el ejercicio
1. Recolecte muestras de sangre de referencia entre las 8:00 y las 10:00 a.m. después de 12 h de ayuno nocturno en tubos de EDTA.
2. Implementar un protocolo estandarizado de ejercicio agudo: 45 min de caminata de intensidad moderada al 65-70 % de frecuencia cardíaca máxima. Calcula la frecuencia cardíaca máxima utilizando la fórmula de Karvonen (220 años)¹⁹. Realice ejercicio en una cinta de correr motorizada con monitoreo continuo de la frecuencia cardíaca a través de un monitor de correa para el pecho. Mantenga la velocidad de marcha a 3,5-4,5 km/h con ajuste de pendiente para alcanzar la frecuencia cardíaca objetivo.
3. Recolecte muestras de sangre después del ejercicio en puntos de tiempo de 1 h, 4 h y 24 h para evaluar la cinética de CLCF1, manteniendo condiciones de recolección consistentes.
4. Almacenar las alícuotas séricas a -80 °C para su posterior cuantificación de CLCF1. Utilice el kit ELISA CLCF1 humano con un rango de detección de 31,2-2000 pg/ml. Diluir muestras 1:2 en diluyente de ensayo. Prepare una curva estándar de 7 puntos utilizando diluciones en serie de 2 veces. Ejecute muestras por duplicado. Lea placas a 450 nm con corrección de longitud de onda de 540 nm. Aceptar coeficiente de variación (CV) < 20 % entre duplicados.
Protocolo de intervención de ejercicio longitudinal
1. Diseñe un programa de ejercicios progresivos de 12 semanas con tres sesiones por semana.
2. Recolecte muestras de sangre al inicio del estudio, a las 4, 8 y 12 semanas para el análisis de la trayectoria de CLCF1.
3. Evalúe las mejoras en el estado físico mediante las pruebas de VO2 máx. al inicio y al final.
4. Correlacione los cambios de CLCF1 con las mejoras de la DMO medidas por DXA a las 12 semanas.
5. Documente las adaptaciones del entrenamiento, incluida la tolerancia al ejercicio y los patrones de recuperación.

2. Aislamiento y procesamiento mejorados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Aislamiento PBMC optimizado para el análisis CLCF1
1. Recolecte 20 ml de muestras de sangre venosa en tubos que contienen EDTA (5 ml de EDTA por tubo) en condiciones estériles.
2. Procese las muestras dentro de las 2 h posteriores a la recolección para una viabilidad celular óptima y la preservación de la expresión de CLCF1.
  1. Diluya las muestras de sangre 1:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente. Mezcle 20 ml de sangre con 20 ml de PBS.
  2. Coloque una capa de sangre diluida sobre un medio de gradiente de densidad en tubos cónicos de 50 ml. Use un medio de gradiente de densidad de 15 ml por cada 20 ml de sangre diluida (proporción 1: 1.33).
3. Centrifugar a 400 × g durante 30 min a temperatura ambiente sin freno.
4. Aspire cuidadosamente la capa de PBMC en la interfaz plasma-Ficoll con una pipeta Pasteur estéril.
5. Lavar las células dos veces con PBS que contenga suero fetal bovino (FBS) al 2% por centrifugación a 300 × g durante 10 min.
Evaluación de la viabilidad celular y medición de referencia CLCF1
1. Determinar la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de tripano (objetivo > 95% de viabilidad)²⁰.
2. Evaluar la expresión basal de CLCF1 intracelular inmediatamente después del aislamiento.
3. Ajuste la concentración celular a 1 × 10⁶ células/ml en el medio apropiado.
4. Asigne celdas para aplicaciones posteriores o almacene en nitrógeno líquido. Congele los PBMC en un medio de congelación que contenga 90% de FBS + 10% de DMSO. Utilice un recipiente de congelación de velocidad controlada a -1 °C/min a -80 °C. Almacene 1 ml de alícuotas (5 × 10⁶ células/vial) en crioviales.

3. Análisis cuantitativo exhaustivo de la expresión génica

Extracción y purificación de ARN con consideraciones específicas de CLCF1
1. Lisar 1 × 10⁶ PBMC en 1 ml de reactivo de lisis de ARN dentro de 1 h de aislamiento.
2. Agregue 200 μL de cloroformo, agite vigorosamente e incube durante 3 min a temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C para lograr la separación de fases.
4. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo, agregue un volumen igual de isopropanol.
5. Precipitar el ARN por centrifugación a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
6. Lave el gránulo de ARN con etanol al 75%, séquelo al aire y disuelva en agua libre de nucleasas.
7. Evalúe la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa o bioanalizador (RIN objetivo >7.0).
Transcripción inversa y PCR cuantitativa con conjuntos de cebadores actualizados
1. Cuantifique la concentración de ARN mediante análisis espectrofotométrico (relación objetivo A260/A280 1,8-2,2).
2. Realice la transcripción inversa utilizando 1 μg de ARN total con el kit de reactivos de transcripción inversa.
3. Preparar reacciones de qPCR: Preparar reacciones de 20 μL que contengan 10 μL de Master Mix, 0,8 μL de cada cebador (stock de 10 μM, 400 nM finales), 2 μL de plantilla de ADNc (50 ng), 6,4 μL de agua libre de nucleasas. Ejecutar triplicados. Utilice un sistema de PCR en tiempo real.
4. Utilice secuencias de cebadores validadas:
  1. CLCF1 a proa: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
    reverso: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
  2. CRLF1 hacia adelante: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
    reverso: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
  3. STAT1 delantero: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
    reverso: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
  4. STAT3 delantero: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
    reverso: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
5. Ejecute el protocolo qPCR: 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min.
6. Analice los resultados utilizando el método 2 ^(-ΔΔCt) con normalización de β-actina²¹.
Análisis de panel de genes de respuesta al ejercicio
1. Incluyen genes que responden al ejercicio: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 y miostatina.
2. Utilice secuencias de cebadores validadas:
  1. IL-6 delantero: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
    reverso: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3';
  2. TNF-α delantero: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
    reverso: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
  3. IL-1β hacia adelante: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
    reverso: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
  4. BDNF hacia adelante: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3',
    reverso: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
  5. IGF-1 hacia adelante: 5'-GCTCTTCAGTGTGTGTGTGGA-3',
    reverso: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
  6. Miostatina directa: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
    reverso: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
3. Correlacionar los cambios inducidos por el ejercicio en CLCF1 con otros patrones de expresión de mioquinas.
4. Evaluar las relaciones de coexpresión de CLCF1 / CRLF1 como indicadores de la formación de complejos de citocinas funcionales.

4. Análisis mejorado de la expresión de proteínas con enfoque en la vía STAT

Extracción y cuantificación de proteínas para el análisis STAT
1. Lisar PBMC en tampón de lisis (150 mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0) suplementado con cócteles de inhibidores de proteasa y fosfatasa.
2. Agregue algunos inhibidores específicos de la fosfatasa: ortovanadato de sodio (1 mM) y fluoruro de sodio (50 mM) inmediatamente antes de su uso.
3. Incubar lisados en hielo durante 30 min con vórtices periódicos a velocidad media cada 10 min.
4. Centrifugar a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C para eliminar los restos celulares.
5. Cuantifique la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford o el método BCA²².
6. Ajuste las concentraciones de proteínas a 2 μg/μL en un tampón de muestra y guárdelo a -80 °C hasta su posterior análisis para aplicaciones de transferencia occidental.
Análisis completo de Western blot con enfoque de señalización STAT
1. Prepare 10 ml de geles SDS-PAGE al 10% utilizando soluciones estándar de acrilamida/bisacrilamida.
2. Cargue 20 μg de proteína por carril junto con marcadores de peso molecular preteñidos y resuelva a 120 V durante 90 min.
3. Transfiera proteínas a membranas de PVDF a 100 V durante 2 h a 4 °C utilizando tampón de transferencia (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol).
4. Bloquee las membranas con 50 ml de leche en polvo descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1% (TBST).
5. Incubar con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C: Anti-CLCF1 (1:1.000); Anti-CRLF1 (1:1.000); Anti-OPG (1:1.000); Anti-RANKL (1:1.000); Anti-JAK2 (1:1.000); Antifosfo-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1.000); Anti-STAT1 (1:1.000); Antifosfo-STAT1 (Tyr701, 1:1.000); Anti-STAT3 (1:1.000); Antifosfo-STAT3 (Tyr705, 1:1.000); Anti-β-actina (1:1.000)
6. Lave las membranas 3 veces durante 10 min cada una con 15 ml de TBST. Incubar con anticuerpos secundarios apropiados durante 1 h a temperatura ambiente.
7. Detecte bandas de proteínas utilizando sustrato de quimioluminiscencia mejorado. Imagen mediante sistema de imágenes de quimioluminiscencia con optimización automática de la exposición. Cuantifique mediante análisis densitométrico con la herramienta de análisis de gel ImageJ v1.53.
Análisis de doble vía STAT1/STAT3
1. Calcule las proporciones fosfo-STAT1/STAT1 total y fosfo-STAT3/STAT3 total utilizando la versión 1.54f del software ImageJ/Fiji.
2. Evalúe el balance de activación de STAT1/STAT3 como indicador de la actividad funcional de CLCF1.
3. Correlacionar los patrones de activación de STAT con las proporciones de expresión de RANKL/OPG.
4. Evalúe la fosforilación de STAT1 / STAT3 a través de Western blot a los 0, 15, 30, 60, 120 y 240 min después del tratamiento CLCF1. Normalizar la fosfoproteína a los niveles totales de proteína mediante densitometría.

5. Knockout de genes avanzado mediado por CRISPR / Cas9 con validación

Construcción mejorada de vectores lentivirales
1. Diseño de ARN de guía única (sgRNA) dirigido a la secuencia del gen CLCF1:
  TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
2. Incluya secuencias de sgRNA adicionales para mejorar la eficiencia de eliminación:
  GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
3. Clone sgRNAs en un vector lentiviral utilizando técnicas estándar de clonación molecular.
4. Verifique la integridad de la construcción mediante el análisis de secuenciación de ADN.
5. Evalúe la eficiencia de corte de sgRNA utilizando el ensayo de endonucleasa I T7²³.
6. Incluya la validación de la especificidad de la vía mediante inhibidores: AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabina (STAT1, 10 μM) y Stattic (STAT3, 5 μM).
7. Realizar experimentos de rescate utilizando construcciones STAT constitutivamente activas para validar la necesidad de la vía.
Protocolo de transducción lentiviral optimizado
1. Cultivar células Raji en medio RPMI-1640 (500 ml) suplementado con FBS al 10%. Mantener todos los cultivos celulares a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Preequilibre los medios de cultivo durante al menos 30 minutos antes de su uso.
2. Pretratar las células con polibeno (8 μg/ml) para mejorar la eficiencia de la transducción.
3. Produzca lentivirus utilizando células HEK293T con plásmidos de embalaje y envoltura mediante transfección de fosfato de calcio. Determinar el título mediante p24 ELISA (> se requiere 10⁸ TU/ml). Seguir los procedimientos de contención BSL-2²³.
4. Transducir células con lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 100. Cambio de medios 24 h después de la transducción. Seleccione células transducidas con puromicina (4 μg/ml) durante 7 días, luego amplíe una región de 500 pb que abarque el sitio objetivo utilizando las siguientes condiciones de PCR: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s, con una extensión final a 72 °C durante 5 min. Para el ensayo de endonucleasa T7, desnaturalizar y recocer los productos de PCR, digerir con endonucleasa T7E1 durante 30 min a 37 °C, luego analizar los productos en un gel de agarosa al 2%.
5. Validar la eficiencia de knockout génico a través de western blot y secuenciación de Sanger ^24,25.
6. Realizar análisis fuera del objetivo utilizando GUIDE-seq o una metodología similar²⁶.
  NOTA: La evidencia reciente demuestra que la eficiencia de secreción de CLCF1 requiere la coexpresión con la proteína chaperona CRLF1. Considere los enfoques de doble knockout para la ablación funcional completa²⁷.

6. Sistema integral de cocultivo con miméticos del ejercicio

NOTA: Para la validación traslacional, adáptese a modelos de ratón ovariectomizados administrando rhCLCF1 a 10 μg/kg i.p. diariamente durante 4 semanas, evaluando la DMO mediante micro-CT.

Configuración avanzada de cocultivo Raji-MG-63
1. Siembra células similares a osteoblastos MG-63 en cámaras inferiores de placas de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10⁴ células/pocillo en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂ y 95% de humedad. Preequilibre el medio en la incubadora durante 30 min antes de su uso. Para mejorar la traducción, sustitúyalo por osteoblastos humanos primarios (densidad 1 × 10⁴/pocillo) de fuentes comerciales.
2. Coloque insertos de membrana de tamaño de poro de 0,4 μm en pocillos que contengan células MG-63.
3. Semillas de células Raji (de tipo salvaje, CLCF1-knockout o CLCF1-sobreexpresion) en cámaras superiores a una densidad de 1 × 10⁵ células/pocillo.
4. Mantener los cocultivos en medio RPMI-1640 completo (2 ml en la cámara inferior, 1,5 ml en la cámara superior) durante períodos experimentales específicos (7, 14, 21 días) a 37 °C con 5% de CO₂.
5. Incluir grupos de tratamiento CLCF1 recombinante (5-10 ng/mL) para evaluar las relaciones dosis-respuesta.
Protocolo de tratamiento CLCF1 mimético del ejercicio
1. Tratar los sistemas de cocultivo con concentraciones fisiológicas de CLCF1 recombinante (5-10 ng/mL) en función de los niveles inducidos por el ejercicio.
2. Aplique el régimen de tratamiento CLCF1 pulsátil: Aplique CLCF1 durante pulsos de 2 h a las 0, 8 y 16 h el día 1, seguido de una exposición continua durante 24 h, luego repita el ciclo. Duración total del tratamiento: 7 días con 9 pulsos totales.
3. Evalúe los efectos dependientes del tiempo a las 1 h, 4 h, 24 h y 7 días después del tratamiento.
4. Monitorizar la cinética de fosforilación de STAT1/STAT3 en ambas poblaciones celulares mediante Western blot a los 0, 15, 30, 60 min. Lisar las células en tampón (500 μL) con inhibidores, normalizar a STAT1/3 total y β-actina.
Evaluación mejorada de la diferenciación osteogénica
1. Induzca la diferenciación osteogénica utilizando un medio osteogénico estándar que contenga ácido ascórbico (50 μg/ml), β-glicerofosfato (10 mM) y dexametasona (10 nM). Cambiar el medio osteogénico cada 3 días (2 ml de cámara inferior, 1,5 ml de cámara superior). Prepare una solución fresca de ácido ascórbico para cada cambio; β-glicerofosfato y dexametasona permanecen estables.
2. Evalúe la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) mediante un ensayo enzimático colorimétrico en los días 7, 14 y 21²⁸. Utilice 500 μL de volumen de extracción. Leído a 405 nm. Normalizar al contenido total de proteínas. Gama de colores esperada: amarillo claro (bajo) a amarillo oscuro (alto).
3. Evalúe la deposición de calcio mediante tinción y cuantificación de Alizarina Rojo S en el día 21. Extracto con 500 μL de cloruro de cetilpiridinio, leído a 540 nm, rango de color esperado: rosa claro (baja mineralización) a rojo oscuro (alta mineralización).
4. Cuantifique la mineralización midiendo la absorbancia a 540 nm después de la extracción con cloruro de cetilpiridinio.
5. Analice la expresión génica osteogénica: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN y OPG utilizando los protocolos qPCR descritos en el paso 3.2.
6. Evaluar los marcadores relacionados con los osteoclastos: TRAP, catepsina K y RANKL en células MG-63.

7. Análisis estadístico avanzado e interpretación de datos

Metodología estadística integral
1. Realizar pruebas de normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk para todas las variables continuas²⁹. Utilizar pruebas no paramétricas cuando se violan los supuestos de normalidad (p < 0,05).
2. Aplicar la prueba U de Mann-Whitney para comparaciones no paramétricas entre grupos³⁰.
3. Realizar análisis de correlación de Spearman para estudios de asociación entre los niveles de CLCF1 y los parámetros clínicos³¹.
4. Realizar análisis de regresión múltiple para evaluar predictores independientes de DMO.
5. Utilice ANOVA de medidas repetidas para el análisis del curso del tiempo de intervención con ejercicios³².
6. Aplicar la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples³³.
7. Establezca un umbral de significación estadística en p < 0,05 para todos los análisis.
Presentación y análisis de datos mejorados
1. Presente datos continuos como media ± desviación estándar o mediana con rango intercuartílico.
2. Cree gráficos de correlación para la expresión de CLCF1 frente a la DMO, los recuentos de linfocitos y los parámetros de ejercicio utilizando GraphPad Prism v9 para estadísticas, ImageJ v1.53 para densitometría. No se necesitan scripts personalizados. Genere ROC a través de la herramienta incorporada de Prism; correlaciones a través de Spearman en Prism.
3. Genere gráficos de curso de tiempo para la cinética de respuesta CLCF1 inducida por el ejercicio.
4. Desarrollar curvas de características operativas del receptor (ROC) para CLCF1 como biomarcador de osteoporosis.
  NOTA: Las imágenes representativas de Western blot se crearon mediante análisis densitométrico cuantitativo.

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Resultados

La implementación de este protocolo demuestra con éxito el papel regulador de CLCF1 en el metabolismo óseo mediado por el sistema inmunitario utilizando múltiples enfoques experimentales. Los estudios de validación clínica muestran una regulación a la baja significativa de la expresión de CLCF1 en pacientes con PMOP en comparación con controles sanos, como se demuestra en la Figura 1A, el análisis cuantitativo de PCR de célul...

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Discusión

El protocolo descrito en este documento proporciona un marco metodológico integral para investigar el papel de CLCF1 como mediador de la protección ósea inducido por el ejercicio a través de un análisis sistemático del eje RANKL / OPG. Investigaciones recientes han identificado CLCF1 como un factor inducido por el ejercicio que combate el deterioro musculoesquelético relacionado con la edad, posicionándolo como un mediador central de la protección ósea inducida por el ejercicio 34,35,36....

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los participantes que se ofrecieron como voluntarios para este estudio y al personal clínico del Hospital Central Afiliado a la Primera Universidad Médica de Shandong por su ayuda con el reclutamiento de pacientes y la recolección de muestras. Agradecemos a los técnicos de laboratorio por su apoyo con experimentos de cultivo celular y biología molecular. H.Z. concibió y diseñó el estudio, realizó los experimentos, analizó los datos y escribió el manuscrito. H.L. contribuyó al diseño experimental, la recopilación de datos y la revisión de manuscritos. Y.S. supervisó el proyecto, proporcionó comentarios críticos y editó el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final para su envío.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
y Cultivo Celular fuertes Reactivos
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Purpose_Application: Componente del medio de criopreservación Specifications_Comments: grado de biología molecular, filtrado estéril
Medio DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	Purpose_Application: Medio de cultivo de osteoblastos MG-63 Specifications_Comments: Formulación de alta glucosa con L-glutamina
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16000044	Purpose_Application: Suplemento de cultivo celular (inactivado por calor) Specifications_Comments: Inactivado por calor en 56Â ° C durante 30 min
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Purpose_Application: Suplemento antibiótico para cultivo estéril Specifications_Comments: 100X stock, concentración final 1%
Polibrena (bromuro de hexadimetrina)	Santa Cruz Biotecnología	SC-134220	Purpose_Application: Potenciador de transducción lentivviral Specifications_Comments: 8 & icirc; ¼ Concentración de trabajo g/mL
Dihidrocloruro de puromicina	InvivoGen	ANT-PR-1	Purpose_Application: Antibiótico de selección para células transducidas Specifications_Comments: 4 & icirc; ¼ concentración de selección g/mL durante 7 días
Medio RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875093	Purpose_Application: Medio de cultivo de linfocitos B Raji Specifications_Comments: Con L-glutamina, prefiere sin fenol rojo
Solución azul de tripán	Thermo Fisher Scientific	15250061	Purpose_Application: Evaluación de viabilidad celular Specifications_Comments: solución del 0,4% para el ensayo de exclusión
Contenedor de congelación de tasa controlada	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Purpose_Application: Congelación de celdas a tasa controlada (-1Â ° C/min) Specifications_Comments: Mr. Frosty o equivalente para -1Â ° Refrigeración C/min
Tubos de recolección de sangre EDTA	BD Biociencias	366643	Purpose_Application: Recogida venosa con anticoagulante Specifications_Comments: capacidad de 10-20 mL, tubos superiores morados
Gradiente de densidad PLUS de Ficoll-Paque	Cytiva (GE Healthcare)	17144003	Purpose_Application: Aislamiento de PBMC mediante centrifugación de densidad Specifications_Comments: Estéril y probado con endotoxinas para separación celular
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190144	Purpose_Application: Lavado celular y tampón de dilución Specifications_Comments: Estéril, grado cultivo celular
ARN fuerte y qPCR
Cloroformo (grado ACS)	Sigma-Aldrich	C2432	Purpose_Application: Separación de fases en extracción de ARN Specifications_Comments: grado de reactivo ACS, â ‰ ¥ 99% de pureza
Etanol (75%, grado molecular)	Sigma-Aldrich	E7023	Purpose_Application: Lavado de granulados de ARN Specifications_Comments: grado de biología molecular, preparar fresco
Isopropanol (grado molecular)	Sigma-Aldrich	I9516	Purpose_Application: Precipitación de ARN Specifications_Comments: grado de biología molecular, â ‰ ¥ 99,5% de pureza
Agua libre de nucleasas	Thermo Fisher Scientific	AM9930	Purpose_Application: Preparación de la reacción PCR Specifications_Comments: libre de DNasa/RNasa, analizada para aplicaciones de PCR
Película adhesiva óptica	Thermo Fisher Scientific	4311971	Purpose_Application: Sellado óptico para placas qPCR Specifications_Comments: Calidad óptica para aplicaciones qPCR
Placas PCR (96 pozos)	Thermo Fisher Scientific	N8010560	Purpose_Application: Formato de 96 pozos para qPCR Specifications_Comments de alto rendimiento: Fondo blanco y transparente para detección óptica
Tiras de tubos PCR	Thermo Fisher Scientific	AB0451	Purpose_Application: Reacciones de PCR de bajo volumen Specifications_Comments: tiras de 8 tubos con condensadores individuales
Kit de reactivos PrimeScript RT	Biografía de Takara	RR037A	Purpose_Application: Transcripción inversa de ARN a cDNA Specifications_Comments: Con borrador de gDNA para la eliminación genómica de ADN
SYBR Green Master Mix	Biosistemas Aplicados	4309155	Purpose_Application: Amplificación y detección por PCR en tiempo real Specifications_Comments: Con colorante de referencia ROX para la normalización
Reactivo de Trizol (Lisis de ARN)	Thermo Fisher Scientific	15596026	Purpose_Application: Lisis celular y extracción de ARN Specifications_Comments: Almacenar en 4Â ° C, consumir en un plazo de 6 meses
Proteínas fuertes - Western Blot
Acrilamida/Bis-acrilamida (29:1)	Bio-Rad	1610146	Purpose_Application: SDS-PAGE polimerización en gel Specifications_Comments: solución de acrilamida al 30%
Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	Purpose_Application: Cuantificación de concentración de proteínas Specifications_Comments: Compatible con reducciones para una cuantificación precisa
Sustrato de Quimioluminiscencia (ECL) mejorada	Thermo Fisher Scientific	32106	Purpose_Application: Detección de proteínas quimioluminiscentes Specifications_Comments: Detección de sensibilidad por femtogramas
Leche seca desnatada	Laboratorio Científico	170-6404	Purpose_Application: Agente bloqueador de manchas occidental Specifications_Comments: Grado bloqueante, bajo fondo
Cóctel inhibidor de fosfatasas	Ciencias Aplicadas de Roche	4906845001	Purpose_Application: Previene la desfosforilación de proteínas Specifications_Comments: Incluye ácido okadaico y caliculina A
Escalera de proteínas prestainadas	Bio-Rad	1610394	Purpose_Application: Estándares de referencia de peso molecular Specifications_Comments: rango de 10-250 kDa con 11 bandas
Cóctel inhibidor de proteasas	Ciencias Aplicadas de Roche	11697498001	Purpose_Application: Prevenir la degradación de proteínas durante la lisis Specifications_Comments: Libre de EDTA para fosfatasas dependientes de metales
Membranas PVDF (0,45 & icirc; ¼ m)	Millipore Sigma	IPVH00010	Purpose_Application: Membrana de transferencia de proteínas (0,45 & Icirc; ¼ poro m) Specifications_Comments: Fondo de baja fluorescencia
Búfer de Lisis RIPA	Tecnología de señalización celular	9806S	Purpose_Application: Extracción de proteínas de células completas Specifications_Comments: Tampón lisis listo para usar con detergentes
Búfer de carga de muestras (4X)	Bio-Rad	1610747	Purpose_Application: Preparación de muestras de proteína para SDS-PAGE Specifications_Comments: Cargando tinte con Î ²-mercaptoetanol
SDS-PAGE Búfer de Ejecución	Bio-Rad	1610732	Purpose_Application: Electroforesis proteica Specifications_Comments: Sistema tampón Trisglicina-SDS
Fluoruro de sodio	Sigma-Aldrich	201154	Purpose_Application: Inhibición adicional de la fosfatasa Specifications_Comments: 50 mM concentración de trabajo
Ortovanadato de sodio	Sigma-Aldrich	S6508	Purpose_Application: JAK2/STAT fosforilación preservación Specifications_Comments: 1 mM concentración de trabajo, preparar fresco
Concentrado de Buffer de Transferencia	Bio-Rad	1704156	Purpose_Application: Transferencia de proteína semi-seca Specifications_Comments: 10 veces concentrado, diluir antes de usarlo
Solución salina con Tris-Buffer con Tween-20 (por confirmar)	Tecnología de señalización celular	9997S	Purpose_Application: Lavado de membranas y dilución de anticuerpos Specifications_Comments: 0,1% Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Edición Genética
Kit de transfección de fosfato de calcio	Promega	E1200	Purpose_Application: Transfección de ADN en células de envase Specifications_Comments: Alta eficiencia de transfección para la producción de lentivirus
Kit de extracción de gel de ADN	Qiagen	28706	Purpose_Application: Purificación de productos por PCR para secuenciación Specifications_Comments: Sistema de purificación basado en columnas
GV371 Lentiviral Vector	GeneChem Co., Ltd	GV371	Purpose_Application: Expresión de CRISPR/Cas9 para knockout génico Specifications_Comments: Sistema lentiviral CRISPR/Cas9 listo para usar
HEK293T Línea Celular	ATCC	CRL-3216	Purpose_Application: Línea celular de envasado lentival Specifications_Comments: línea celular de envasado altamente transfectable
Servicio de Secuenciación Sanger	Macrogen Inc.	Costumbre	Purpose_Application: Validación de eliminación y análisis fuera de objetivo Specifications_Comments: secuenciación estándar con cebadores personalizados
Endonucleasa T7 I	New England Biolabs	M0302S	Purpose_Application: Validación de eficiencia de corte CRISPR Specifications_Comments: Endonucleasa específica de desajuste para validación CRISPR
ELISA & Inmunoensayos
Placas ELISA (96 pozos, fondo plano)	Corning	3590	Purpose_Application: Reacción del sustrato ELISA Specifications_Comments: Alta unión y fondo plano para ELISA
CLCF1 DuoSet ELISA humano	R& Sistemas D	DY1234	Purpose_Application: Cuantificación de la proteína CLCF1 (31,2-2000 pg/mL) Specifications_Comments: Rango de detección: 31,2-2000 pg/mL, CV y 10%
Kit ELISA p24 (título lentiviral)	ZeptoMetrix Corporation	801111	Purpose_Application: Determinación de títulos lentivales Specifications_Comments: Para la determinación de títulos lentivirales (>10â ¸o; TU/mL)
Fuertes
Kit de tinción S de Alizarin Red	Sigma-Aldrich	A5533	Purpose_Application: Visualización de deposición de calcio Specifications_Comments: solución al 2% en agua destilada, pH 4,1-4,3
Kit de actividad de fosfatasa alcalina	Abcam	ab83369	Purpose_Application: Medición de la actividad enzimática ALP Specifications_Comments: ensayo colorimétrico, lectura a 405 nm
Ácido ascórbico (ácido L-ascórbico)	Sigma-Aldrich	A4544	Purpose_Application: Componente del medio osteogénico Specifications_Comments: 50 & icirc; ¼ Concentración final g/mL
Cloruro de cetilpiridinio	Sigma-Aldrich	C9002	Purpose_Application: Extracción S con Rojo de Alizarina para cuantificación Specifications_Comments: solución al 10% para extracción de colorante
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902	Purpose_Application: Componente del medio osteogénico Specifications_Comments: concentración final de 10 nM
Î ²-Glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	Purpose_Application: Componente del medio osteogénico Specifications_Comments: concentración final de 10 mM
Medio de diferenciación osteogénica	PromoCell	C-28010	Purpose_Application: Inducción de diferenciación de osteoblastos Specifications_Comments: Medio osteogénico completo listo para usar
Insertos de cultivo celular Transwell (0.4 & icirc; ¼ m)	Corning	3470	Purpose_Application: Sistema de co-cultura con 0,4 & Icirc; ¼ Separación M Specifications_Comments: Membrana tereftalato de polietileno, estéril
Equipamiento - Instrumentos principales
Centrífuga (de alta velocidad, refrigerada)	Eppendorf	5430R	Purpose_Application: Procesamiento de muestras y separación de celdas Specifications_Comments: refrigeradas, máximo 30.000 x g
Sistema de Imagen Quimioluminiscencia	Laboratorios Bio-Rad	12003154	Purpose_Application: Imagen y cuantificación por Western blot Specifications_Comments: Documentación de gel e imagen por Western blot
Incubadora de CO2 (Humidificada)	Thermo Fisher Scientific	51030287	Purpose_Application: Mantenimiento de cultivos celulares (37Â ° C, 5% CO2) Specifications_Comments: Triple gas (CO2/O2/N2), control de humedad
Monitor de frecuencia cardíaca (correa torácica)	Polar Electro	H10	Purpose_Application: Monitorización continua de la frecuencia cardíaca Specifications_Comments: conectividad Bluetooth y Acirc; ± Precisión de 1 bpm
Descubrimiento Hologic: Un escáner DXA	Hologic Inc.	Descubrimiento A	Purpose_Application: Medición de densidad mineral ósea Specifications_Comments: Con el software APEX v4.5, se requiere control de calidad diario
Lector de microplacas (Multimodo)	BioTek Instruments	Sinergia H1	Purpose_Application: Medición de placas ELISA y absorbancia Specifications_Comments: UV-Vis, fluorescencia, detección de luminiscencia
Cinta de correr motorizada	Fitness para la vida	95Ti	Purpose_Application: Intervención estandarizada de ejercicio Specifications_Comments: velocidad variable 0-16 km/h, pendiente 0-15%
Sistema de PCR en tiempo real (CFX96 o equivalente)	Laboratorios Bio-Rad	1855195	Purpose_Application: Amplificación y detección de PCR en tiempo real Specifications_Comments: bloque de 96 pozos, capaz de gradiente
Software y Software Herramientas de análisis
APEX Software v4.5 (Análisis DXA)	Hologic Inc.	v4.5	Purpose_Application: Análisis de escaneo DXA y cálculo de DMO Specifications_Comments: Análisis de DMO con base de datos de referencia
Bio-Rad CFX Maestro	Laboratorios Bio-Rad	CFX Maestro	Purpose_Application: Análisis de datos qPCR y determinación de CT Specifications_Comments: Análisis PCR en tiempo real y exportación de datos
GraphPad Prism v9.0	GraphPad Software	v9.0	Purpose_Application: Análisis estadístico y generación de grafos Specifications_Comments: Software estadístico con generación de grafos
ImageJ/Fiji v1.53	Institutos Nacionales de Salud	v1.53	Purpose_Application: Densitometría de Western blot y análisis de imágenes Specifications_Comments: Análisis de imágenes con herramientas de medición
Microsoft Excel 365	Microsoft Corporation	365	Purpose_Application: Organización de datos y cálculos básicos Specifications_Comments: Organización de datos y funciones estadísticas básicas
Consumibles y Consumibles Plástico
Tubos microcentrífugas de 1,5 mL	Eppendorf	22363204	Purpose_Application: Almacenamiento y procesamiento de muestras de pequeño volumen Specifications_Comments: libre de DNasa/RNasa, baja unión
Tubos cónicos de 15 mL	Corning	430766	Purpose_Application: Procesamiento de muestras de volumen medio Specifications_Comments: Polipropileno graduado, con tapas
Placas de cultivo celular de 24 pozos	Corning	3524	Purpose_Application: Co-cultivo y montaje de ensayo funcional Specifications_Comments: Cultivo de tejidos tratado, fondo plano
Tubos cónicos de 50 mL	Corning	430829	Purpose_Application: Recogida y procesamiento de muestras de gran volumen Specifications_Comments: Polipropileno graduado, con tapas
Crioviales (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418	Purpose_Application: Almacenamiento a largo plazo de celdas y muestras a -80Â ° C Specifications_Comments: Rosca externa, sello de junta tórica, -196Â ° Clasificación C
Pipetas Pasteur (Estériles)	Fisher Scientific	13-678-20A	Purpose_Application: Recogida y transferencia de muestras estériles Specifications_Comments: envueltas individualmente, estériles

Referencias

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