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Artículo de método

Inhibición de la osteoclastogénesis por LY90009 a través de la modulación de la señalización de Notch en modelos de enfermedad osteolítica

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DOI:

10.3791/69178

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7 de octubre de 2025

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1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los efectos inhibidores del inhibidor de la γ-secretasa LY900009 sobre la osteoclastogénesis inducida por RANKL en macrófagos derivados de la médula ósea. El protocolo incluye evaluación de citotoxicidad, ensayos funcionales, análisis moleculares y validación in vivo en un modelo osteolítico murino, con aplicaciones en el desarrollo terapéutico de enfermedades osteolíticas.

Resumen

La actividad desregulada de los osteoclastos contribuye profundamente a la progresión de la enfermedad osteolítica, pero el alcance de las modalidades de intervención terapéutica se ve limitado por los efectos adversos. Este estudio investigó LY900009, un inhibidor de la γ-secretasa, y su capacidad para suprimir la osteoclastogénesis inducida por RANKL a través de la modulación de la señalización de Notch. Utilizando macrófagos derivados de la médula ósea, realizamos evaluaciones integrales in vitro de citotoxicidad, diferenciación y ensayos funcionales. Se utilizaron análisis de expresión génica y proteica mediante qPCR y western blot para dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes. La eficacia in vivo se corroboró utilizando un modelo de resorción ósea inducida por lipopolisacáridos murinos. LY900009 inhibió la formación de osteoclastos inducida por RANKL y la función de reabsorción de una manera dependiente de la dosis sin citotoxicidad a concentraciones terapéuticas. Este tratamiento redujo significativamente el número de osteoclastos positivos para TRAP, alteró la formación de cinturones de actina y suprimió la degradación de la matriz ósea. La expresión de marcadores osteoclastos, incluidos NFATc1, c-Fos, catepsina K y TRAP, se reguló notablemente a la baja. Mecánicamente, LY900009 interrumpió la señalización de Notch y las vías MAPK / Akt aguas abajo. La administración in vivo redujo sustancialmente la destrucción ósea inducida por LPS, mejorando los parámetros óseos y reduciendo la presencia de osteoclastos. Estos hallazgos demuestran que LY900009 inhibe eficazmente la osteoclastogénesis y la reabsorción ósea mediante la modulación del eje de señalización Notch / MAPK / Akt, lo que lo convierte en un candidato terapéutico prometedor para los trastornos osteolíticos.

Introducción

La homeostasis ósea constituye un paradigma fisiológico exquisitamente orquestado en vertebrados, armonizado por el delicado equilibrio entre la formación ósea mediada por osteoblastos y la reabsorción ósea impulsada por osteoclastos1. Este intrincado equilibrio mantiene la integridad esquelética, la resistencia biomecánica y la fidelidad metabólica a lo largo de la vida, respondiendo dinámicamente a las demandas mecánicas, las perturbaciones endocrinas y los desafíos patológicos2. El ciclo de remodelación ósea implica fases secuenciales de activación, reabsorción, transición, formación y terminación, cada una gobernada por intrincadas cascadas moleculares que aseguran la sincronización espaciotemporal de las actividades celulares3.

La alteración de este mecanismo homeostático, particularmente a través de una actividad excesiva de los osteoclastos o una función osteoblástica inadecuada, precipita la pérdida ósea patológica, característica de numerosos trastornos osteolíticos 4,5. Estas afecciones abarcan un amplio espectro de enfermedades, incluida la osteoporosis posmenopáusica y senescente, la artritis reumatoide, la artritis inflamatoria, la afectación ósea neoplásica, la enfermedad de Paget y los trastornos periodontales6. Las manifestaciones clínicas de la reabsorción ósea excesiva incluyen un mayor riesgo de fractura, deformidad esquelética, dolor crónico, discapacidad funcional y una carga sanitaria sustancial 6,7. Las métricas epidemiológicas contemporáneas indican que la osteoporosis por sí sola afecta a más de 200 millones de personas en todo el mundo, con fracturas asociadas que resultan en una morbilidad, mortalidad y costos económicos significativos que superan los miles de millones de dólares anuales 7,8.

Los osteoclastos se manifiestan como células gigantes multinucleadas altamente especializadas derivadas de precursores hematopoyéticos del linaje de fagocitos mononucleares, específicamente macrófagos derivados de la médula ósea9. Su formación representa un complejo proceso de varios pasos que requiere la coordinación precisa de señales extracelulares, cascadas de señalización intracelular y programas transcripcionales10. Las citocinas esenciales que gobiernan la osteoclastogénesis incluyen el receptor activador del ligando del factor nuclear κB (RANKL) y el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), que se unen a sus respectivos receptores RANK y c-Fms para iniciar programas de diferenciación11. La interacción RANKL-RANK desencadena la activación de múltiples vías de señalización posteriores, incluidas las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), el factor nuclear κB (NF-κB), la fosfoinositida 3-quinasa/proteína quinasa B (PI3K/Akt) y las vías de calcio/calcineurina, que convergen en el factor nuclear de las células T activadas citoplasmáticas 1 (NFATc1), el regulador transcripcional maestro de la osteoclastogénesis 10,11,12.

Entre los diversos mecanismos reguladores que controlan la biología de los osteoclastos, la señalización de Notch ha surgido como un modulador crítico con funciones complejas y dependientes del contexto13. La vía Notch es un sistema de comunicación célula-célula evolutivamente conservado que gobierna la determinación, diferenciación, proliferación y apoptosis del destino celular en diversos tejidos y etapas de desarrollo14. En los mamíferos, cuatro receptores Notch (Notch1-4) interactúan con cinco ligandos canónicos (tipo Delta 1, 3 y 4, y Jagged 1 y 2) para mediar la señalización intercelular. La activación de la vía implica la unión de ligandos, cambios conformacionales y escisión proteolítica secuencial por metaloproteasas ADAM y el complejo γ-secretasa, que finalmente libera el dominio intracelular Notch (NICD) para la translocación nuclear y la regulación transcripcional de genes diana, incluidas las familias Hes y Hey14,15. El papel de la señalización de Notch en la osteoclastogénesis sigue siendo polémico y parece depender en gran medida del contexto, con estudios que informan efectos estimulantes e inhibidores según los subtipos específicos de receptores, la disponibilidad de ligandos, el microambiente celular y las condiciones experimentales 16,17,18.

Los enfoques terapéuticos predominantes para las enfermedades osteolíticas se centran principalmente en estrategias antirresortivas, incluidos los bifosfonatos, el denosumab (inhibidor de RANKL), los moduladores selectivos de los receptores de estrógeno y la calcitonina 7,8,19. Aunque estos tratamientos reducen eficazmente la reabsorción ósea y el riesgo de fractura, se asocian con limitaciones significativas, que incluyen toxicidad gastrointestinal, osteonecrosis de la mandíbula, fracturas atípicas, mayor riesgo de infección y preocupaciones sobre la seguridad a largo plazo. Además, estos agentes pueden suprimir excesivamente el recambio óseo, lo que puede comprometer la calidad ósea y los mecanismos de reparación. En consecuencia, existe una necesidad clínica urgente de nuevos agentes terapéuticos que puedan inhibir selectivamente la actividad patológica de los osteoclastos al tiempo que minimizan los efectos adversos y preservan la capacidad fisiológica de remodelación ósea 8,14.

Los inhibidores de la γ-secretasa representan una clase prometedora de compuestos con aplicaciones potenciales en enfermedades osteolíticas a través de la modulación de la señalización de Notch14,20. Estos agentes se han estudiado ampliamente en la investigación de enfermedades neurodegenerativas y oncológicas, con varios compuestos que avanzan a ensayos clínicos para la enfermedad de Alzheimer y varios tipos de cáncer. LY900009, un inhibidor de la γ-secretasa potente y selectivo, ha demostrado propiedades farmacológicas favorables, incluyendo alta especificidad, biodisponibilidad y un perfil de seguridad manejable en estudios preliminares21,22. Sin embargo, sus efectos específicos sobre la osteoclastogénesis inducida por RANKL y su posible utilidad terapéutica en enfermedades osteolíticas siguen sin caracterizarse de forma completa. Este estudio fue diseñado para evaluar si LY900009 podría inhibir la osteoclastogénesis a través de la interrupción de la señalización de Notch, ofreciendo potencialmente un nuevo enfoque terapéutico para las enfermedades osteolíticas. Desarrollamos protocolos integrales para evaluar sus efectos sobre la formación de osteoclastos, la actividad de resorción ósea, las vías de señalización y la eficacia in vivo en modelos de pérdida ósea inflamatoria.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Central afiliado a la Primera Universidad Médica de Shandong (número de aprobación IACUC-2024-015). El estudio se adhirió a los principios éticos establecidos para la investigación con animales y las pautas ARRIVE, incluido el alojamiento de animales en jaulas estándar (5 ratones / jaula, ciclo de luz / oscuridad de 12 h, comida / agua ad libitum ) y la aleatorización a grupos

1. Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea

  1. Eutanasia ratones machos C57BL/6 de 5 semanas de edad (n = 5 por aislamiento) colocándolos en una cámara de CO2 con un caudal del 30% del volumen de la cámara por minuto durante 5 min. Confirmar la muerte por luxación cervical.
  2. Rocíe el ratón con etanol al 70%. Haga una incisión en la línea media desde el pubis hasta el esternón con unas tijeras estériles. Extirpar fémures y tibias asépticamente. Coloque los huesos en PBS estéril sobre hielo.
  3. Limpie los huesos de tejido blando con una gasa estéril. Corta ambos extremos de los huesos con unas tijeras estériles. Enjuague la médula con una aguja de 25G con 10 ml de α-MEM frío por ratón. Pasar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm.
  4. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet en α-MEM que contenga 10% de FBS y 33,3 ng/mL M-CSF. Cuente las células con un hemocitómetro con exclusión de azul de tripano. Placa a 2 x 106 celdas/ml en matraces T75.
  5. Mantener los cultivos a 37 °C en atmósfera de 5% deCO2 con cambios de medio cada 48 h.
  6. Cosecha 1x 106 celdas. Lavar con PBS que contenga un 2% de FBS. Incubar con anti-CD11b-FITC (1:100) y anti-F4/80-PE (1:100) durante 30 min a 4 °C en oscuridad. Analice por citometría de flujo utilizando la siguiente estrategia de compuerta: Primero, las células de puerta basadas en la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para excluir los desechos y seleccionar células viables. En segundo lugar, las células CD11b positivas de la población de células viables. En tercer lugar, a partir de células positivas para CD11b, puertas F4 / 80 positivas para identificar macrófagos doble positivos CD11b + / F4 / 80+ . Establezca puertas basadas en controles sin teñir y controles de un solo color. Proceda solo si el >95% de las células son CD11b+/F4/80+.

2. Evaluación de la citotoxicidad

  1. Siembre macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) a 1 x 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos utilizando 100 μL de medio por pocillo. Deje que las células se adhieran durante 4 h a 37 °C.
  2. Preparar LY900009 diluciones en medio completo: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Retirar el medio viejo. Agregue 100 μL de medio de tratamiento por pocillo. Prepare triplicados para cada concentración.
  3. Incubar durante 24 h, 48 h o 96 h. Retire el medio de cultivo por completo. Añadir 100 μL de medio fresco que contenga un 10% de reactivo CCK-8 (10 μL de CCK-8 en 90 μL de medio). Incubar durante exactamente 2 h a 37 °C. Utilice un lector de microplacas para medir la absorbancia a 450 nm con una referencia a 650 nm.
  4. Calcule IC50 usando GraphPad Prism. Software abierto, concentración de entrada (eje X) y porcentaje de viabilidad (eje Y). Seleccione Analizar > Regresión no lineal > Dosis-respuesta > Inhibición > log(inhibidor) frente a respuesta con pendiente variable. Establezca restricciones: Bottom=0, Top=100. Registre IC50 con un intervalo de confianza del 95%.

3. Diferenciación de osteoclastos y tinción TRAP

  1. Sembrar macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) a 1 x 104 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Cultivo durante la noche en α-MEM con 10% de FBS y 33,3 ng/mL M-CSF.
  2. Reemplace el medio con 100 μL de medio de diferenciación: α-MEM que contiene 10% de FBS, 33,3 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL RANKL y LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Prepare cuadruplicados para cada condición.
  3. Reemplace el medio cada 48 h con medio de diferenciación fresco. Continuar durante 6 días. Monitoree diariamente usando un microscopio invertido a 100x para la formación de osteoclastos.
  4. Retire todo el medio por aspiración. Lavar una vez con 200 μL de PBS. Agregue 100 μL de paraformaldehído al 4% en PBS. Incubar durante exactamente 15 minutos a temperatura ambiente. Retire el fijador. Lavar 3 veces con 200 μL de PBS.
  5. Prepare la solución de tinción TRAP: Mezcle 50 ml de tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH 5,0), 10 ml de tartrato de sodio 50 mM, 1 ml de fosfato AS-MX de naftol 5 mg / ml en dimetilformamida y 0,5 ml de sal Fast Red Violet LB. Filtrar a través de un filtro de 0,22 μm. Aplicar 200 μL por pocillo. Incubar a 37 °C durante 30 min en la oscuridad. Detenga la reacción lavando 3 veces con agua destilada.
  6. Identificar los osteoclastos como células positivas para TRAP (púrpura/rojo) que contienen tres o más núcleos. Cuente con un microscopio invertido con un aumento de 100x. Fotografíe cinco campos aleatorios por pozo.
  7. Cuantificar usando ImageJ. Haga clic en la imagen > Convertir a 8 bits (Imagen > Tipo > 8 bits) > Establecer umbral (Imagen > Ajustar umbral >) > Seleccione áreas positivas para TRAP > Analizar partículas (Analizar > Analizar partículas: tamaño 100-Infinito μm2, circularidad 0-1.0) > Exportar resultados a Excel 23.

4. Ensayo de reabsorción ósea funcional

  1. Cultivo de BMM en placas de seis pocillos (2 x 105 células/pocillo) con M-CSF durante 24 h. Agregue RANKL (100 ng / mL) para inducir la formación de preosteoclastos durante 3 días.
  2. Recolectar células con tripsina-EDTA al 0,25% durante 5 min a 37 °C. Neutralizar con medio completo. Cuente las células viables usando azul de tripano.
  3. Sembrar 1 x 104 preosteoclastos por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas de hidroxiapatita. Deje adjuntar durante 4 h.
  4. Tratar con M-CSF (33.3 ng/mL), RANKL (100 ng/mL) y LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) durante 4 días. Cambie el medio cada 2 días.
  5. Retire las células con lejía al 10% durante 10 min. Lavar 5 veces con agua destilada. Secar al aire completamente.
  6. Visualice los pozos de reabsorción utilizando un lector de imágenes automatizado con un aumento de 4x. Capture toda el área del pozo. Cuantifique el área reabsorbida como un porcentaje del área total usando ImageJ.

5. Microscopía de inmunofluorescencia

  1. Cultive osteoclastos en cubreobjetos de vidrio en placas de 24 pocillos durante 5-7 días como se describe en el paso 3.
  2. Fijar con paraformaldehído al 4% durante 15 min. Permeabilizar con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 10 min. Bloquear con BSA al 1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
  3. Incubar con rodamina-faloidina (1:200) en tampón de bloqueo durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Contratinción de núcleos con DAPI (1 μg/mL) durante 10 min.
  4. Monte los cubreobjetos en las guías utilizando un medio de montaje antidecoloración. Examine con un microscopio de fluorescencia con un aumento de 200x. Mida el área del anillo de actina usando ImageJ.

6. Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real

  1. Extraiga el ARN total de 2 x 106 células utilizando un reactivo de extracción de ARN. Homogeneizar mediante pipeteo. Incubar 5 min a temperatura ambiente.
  2. Añadir 200 μL de cloroformo. Agitar vigorosamente durante 15 s. Incubar 3 min. Centrifugar a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  3. Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo. Agregue 500 μL de isopropanol. Mezclar suavemente. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  4. Lavar el pellet con 1 mL de etanol al 75%. Secar al aire durante 10 min. Disolver en 30 μL de agua libre de ARNasa. Mida la concentración con un espectrofotómetro (requiere una relación A260/A280 >1,8).
  5. Sintetice ADNc utilizando 1 μg de ARN con el kit de transcripción inversa según el protocolo del fabricante.
  6. Prepare reacciones de qPCR: 10 μL de Master Mix, 1 μL de ADNc, 0,5 μL de cada cebador (10 μM), 8 μL de agua. Funciona con un sistema de PCR en tiempo real: 95 °C durante 10 min, luego 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s. Calcule la expresión relativa utilizando el método 2-ΔΔCt con GAPDH como gen de referencia.

7. Análisis de Western blot

  1. Lisar las células en tampón RIPA que contenga inhibidores de proteasa y fosfatasa en hielo durante 30 min. Centrifugar a 14.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  2. Determine la concentración de proteínas utilizando el ensayo BCA según las instrucciones del fabricante. Prepare muestras de proteínas de 30 μg en tampón de carga. Hervir durante 5 min.
  3. Cargue muestras en geles SDS-PAGE al 10%. Funciona a 80 V durante 30 min, luego a 120 V durante 90 min. Transfiera a membranas de PVDF a 100 V durante 90 min en tampón de transferencia en frío.
  4. Bloquee las membranas con leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 al 0,1% (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente con un balanceo suave.
  5. Incubar con anticuerpos primarios detallados en la Tabla de Materiales (1:1000) durante la noche a 4 °C con balanceo suave. Lavar 3 veces con TBST durante 10 minutos cada una.
  6. Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:5000) durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar 3 veces con TBST.
  7. Detecte usando el reactivo ECL según las instrucciones del fabricante. Capture imágenes utilizando un sistema de imágenes infrarrojas. Cuantifique la intensidad de la banda usando ImageJ.

8. Modelo de reabsorción ósea inducida por LPS in vivo

  1. Calcule el tamaño de la muestra usando G * Power 3.1 (tamaño del efecto = 0.8, α = 0.05, potencia = 0.80, lo que produce n = 5 / grupo). Asigne aleatoriamente ratones machos C57BL / 6 de 7-8 semanas a grupos utilizando un generador de números aleatorios. Aloje 5 ratones por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura 22 ± 2 °C, humedad 55% ± 10%, acceso ad libitum a comida y agua estándar.
  2. Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Confirme la anestesia mediante el reflejo de pellizco del dedo del pie.
  3. Prepare el control del vehículo: PBS que contiene DMSO al 1%. Preparar LY900009: Dosis baja (2,5 mg/kg) y dosis alta (5 mg/kg) en vehículo. Inyectar 100 μL por vía subcutánea sobre la calvaria con una aguja de 27G diariamente durante 14 días. Inyecte LPS (10 mg / kg) los días 1 y 8.
  4. Monitoree a los ratones 2 veces al día para detectar signos de angustia. Defina puntos finales humanos: pérdida de peso >20%, incapacidad para deambular, postura encorvada, aseo reducido. Eutanasia inmediatamente si se alcanzan los puntos finales.
  5. Eutanasia el día 15 con sobredosis de pentobarbital (100 mg/kg por vía intraperitoneal). Cosecha calvariae. Fijar en paraformaldehído al 4% durante 48 h a 4 °C.

9. Micro-CT y análisis histológico

  1. Escanee las calvarias fijas con un escáner micro-CT con los siguientes parámetros: 70 kV, 114 μA, filtro de aluminio de 0,5 mm, resolución de 9 μm, rotación de 180° con pasos de 0,4°.
  2. Reconstruya imágenes utilizando el software NRecon. Analizar usando el software CTAn. Defina la región de interés como un área de 3 x 3 mm centrada en la sutura sagital. Calcule BMD, BV/TV, TB.N, Tb.Th.
  3. Descalcificar muestras en EDTA al 10% (pH 7,4) durante 14 días con cambios diarios. Finalización de la descalcificación de la prueba mediante la prueba de oxalato de calcio24.
  4. Proceso para la inclusión de parafina: deshidratar a través de alcohol graduado, limpiar en xileno, infiltrarse con parafina. Sección a 4 μm de espesor con micrótomo.
  5. Garantizar el cegamiento: codifique todas las muestras utilizando números aleatorios de tres dígitos. Pídale a un colega que mantenga la clave de código. Realizar todos los análisis sin conocimiento de los grupos de tratamiento. Decodifique solo después de que se complete la recopilación de datos.
  6. Realice tinción de H&E: desparafina, rehidratar, teñir con hematoxilina durante 5 min, diferenciar en alcohol ácido, teñir con eosina durante 2 min, deshidratar y montar.
  7. Realice la tinción TRAP como en el paso 3.5. Cuente las células multinucleadas positivas para TRAP a lo largo de la superficie ósea. Exprésate como un número por mm de perímetro óseo.

10. Análisis estadístico

  1. Calcule el tamaño de muestra requerido usando G * Power 3.1: tamaño del efecto de entrada f = 0.8, α = 0.05, potencia = 0.80, número de grupos. Registre el mínimo n por grupo.
  2. Pruebe la normalidad utilizando la prueba de Shapiro-Wilk en SPSS 28.0. Considere p > 0.05 como distribuido normalmente. Pruebe la homogeneidad de la varianza utilizando la prueba de Levene. Considere p > 0.05 como varianzas iguales.
  3. Aplique pruebas apropiadas basadas en la distribución: Para datos normales con varianzas iguales, use pruebas paramétricas. Para los dos grupos, aplique la prueba t de Student no emparejada. Para varios grupos, utilice ANOVA unidireccional.
  4. Realice un análisis post hoc: Para ANOVA significativo (p<0.05), aplique la prueba de diferencia honestamente significativa de Tukey para todas las comparaciones por pares.
  5. Utilice alternativas no paramétricas para datos no normales: aplique la prueba U de Mann-Whitney para dos grupos y Kruskal-Wallis con el post hoc de Dunn para múltiples grupos.
  6. Calcule los tamaños del efecto: d de Cohen para las pruebas t, eta cuadrada parcial para ANOVA.
  7. Informe valores p exactos con tres decimales e intervalos de confianza del 95%. Presentar datos normales como media ± desviación estándar, no normales como mediana (rango intercuartílico).
  8. Considere p < 0.05 estadísticamente significativo. Aplique la corrección de Bonferroni cuando se realicen comparaciones múltiples.

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Resultados

La implementación exitosa de este protocolo reveló que LY900009 ejerció potentes efectos inhibidores sobre la formación y función de osteoclastos a través de múltiples mecanismos interconectados. La evaluación inicial de la citotoxicidad en macrófagos derivados de la médula ósea demostró aumentos de toxicidad dependientes del tiempo, con valores calculados de IC50 de 4,44 μM, 3,66 μM y 2,93 μM a las 24 h, 48 h y 96 h, respectivamente (Figura 1A, B). Es importante ...

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Discusión

La presente investigación proporciona evidencia convincente de que LY900009 representa un agente terapéutico prometedor para enfermedades osteolíticas a través de su inhibición potente y selectiva de la osteoclastogénesis, lo que concuerda con el creciente interés en los inhibidores de la γ-secretasa para trastornos relacionados con los huesos 14,20,21. Los hallazgos demuestran que este inhibido...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos ni conflictos de intereses. Ningún autor tiene ninguna relación financiera con las entidades comerciales mencionadas en este trabajo. Todos los autores han completado los formularios de divulgación del ICMJE.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al personal del Hospital Central Afiliado a la Primera Universidad Médica de Shandong y al Hospital Popular de Feicheng por su apoyo técnico y asistencia durante el curso de este estudio. También agradecemos las contribuciones de nuestros colegas de laboratorio por sus valiosas discusiones y asistencia con experimentos con animales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de cultivo celular de 24 pocillosCorning3524Microscopía de inmunofluorescencia
placas de cultivo celular de 6 pocillosCorning3516Cultivo celular y western blot
70% EtanolSigma-AldrichE7023Esterilización y desinfección
Etanol al 75%Sigma-AldrichE7148Tampón de lavado de ARN
Placas de cultivo celular de 96 pocillosCorning3596Cultivos celulares y ensayos
Filtro de aluminio (0,5 mm)BrukerN/AFiltro de escaneo Micro-CT
Anticuerpo anti-CD11b-FITCBioLeyenda101206Citometría de flujo - marcador de macrófagos
Anticuerpo anti-hendidura Notch1 (monoclonal de conejo)Tecnología de señalización celular4147SWestern blot - Señalización de muesca
Anticuerpo anti-F4/80-PEBioLeyenda123108Citometría de flujo - marcador de macrófagos
Medio de montaje antidecoloraciónLaboratorios VectorH-1000Montaje de microscopía de fluorescencia
Anticuerpo anti-Hes1 (monoclonal de conejo)Tecnología de señalización celular11988SWestern blot - Objetivo descendente de muesca
Anticuerpo anti-NFATc1 (monoclonal de ratón)Biotecnología de Santa CruzSC-7294Western blot - regulador maestro osteoclasto
Anticuerpo antifosfo-Akt (Ser473)Tecnología de señalización celular4060SWestern blot - Señalización PI3K/Akt
Anticuerpo antifosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)Tecnología de señalización celular4370SWestern blot - Señalización MAPK
Antifosfo-NF-κ Anticuerpo B p65 (Ser536)Tecnología de señalización celular3033SWestern blot - NF-κ Señalización B
Anticuerpo antifosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)Tecnología de señalización celular4511SWestern blot - señalización MAPK p38
Anticuerpo anti-β-actina (monoclonal de ratón)Tecnología de señalización celular4970SControl de carga de Western blot
Lector de imágenes automatizadoDispositivos molecularesImageXpress MicroCuantificación de fosas de reabsorción
Kit de ensayo de proteínas BCAPierce/Thermo Fisher23225Determinación de la concentración de proteínas
Lejía (10% de hipoclorito de sodio)Sigma-Aldrich425044Eliminación de células de placas de reabsorción
BSA (albúmina sérica bovina)Sigma-AldrichReferencia A7906Tampón de bloqueo para inmunofluorescencia
Ratones C57BL/6 (machos, 5-8 semanas de edad)Laboratorios Charles River27Aislamiento in vitro de BMM y estudios in vivo
Reactivo de prueba de oxalato de calcioSigma-AldrichC0350Prueba de finalización de descalcificación
Reactivo CCK-8 (kit de recuento de células-8)Tecnologías moleculares DojindoCK04Evaluación de la viabilidad celular
Filtro de células (70 μ m)BD Halcón352350Filtración de células de médula ósea
Centrífuga (refrigerada)Eppendorf5424RPreparación de células y muestras
CloroformoSigma-AldrichC2432Separación de fases de extracción de ARN
Cámara 2Euthanex CorpEX-075Eutanasia animal
Software CTAnBrukerVersión 1.20Análisis de imágenes de micro-CT
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)Sigma-AldrichD9542Contratinción nuclear
Dimetilformamida (DMF)Sigma-AldrichD4551Disolvente de tinción TRAP
DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma-AldrichD2650Preparación del control del vehículo
Sustrato Western Blot ECLPierce/Thermo Fisher32106Detección de proteínas en Western blot
EDTA (10%, pH 7,4)Sigma-AldrichE6758Solución de descalcificación
Eosina YSigma-AldrichE4009H& Tinción histológica E
Sal rápida de violeta roja LBSigma-AldrichF3381Cromógeno de tinción TRAP
Suero fetal bovino (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Suplemento de cultivo celular
Citómetro de flujoBD BiocienciasFACSCaliburCaracterización de BMM
Microscopio de fluorescenciaOlimpoIX73Imágenes de inmunofluorescencia
Software G*PowerUniversidad Heinrich HeineVersión 3.1Análisis estadístico de potencia
Cubreobjetos de vidrio (22 &veces; 22 mm)Fisher Scientific12-541-BMicroscopía de inmunofluorescencia
Prisma GraphPadGraphPad SoftwareVersión 9.0Cálculo y gráficos de IC50
HematoxilinaSigma-AldrichH3136H& Tinción histológica E
HemocitómetroHausser Científico3200Recuento de células
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidadBiosistemas aplicados4368814Síntesis de ADNc a partir de ARN
IgG anti-ratón conjugada con HRPTecnología de señalización celular7076SAnticuerpo secundario Western blot
IgG anti-conejo conjugada con HRPTecnología de señalización celular7074SAnticuerpo secundario Western blot
Placas de 96 pocillos recubiertas de hidroxiapatitaCorning BioCoat354651Ensayo funcional de reabsorción ósea
ImagenJNIHVersión 1.53eAnálisis y cuantificación de imágenes
Incubadora (CO2)Termo Fisher51033058Mantenimiento de cultivos celulares
Sistema de imágenes infrarrojasBio-RadChemiDoc MPDetección de Western blot
Microscopio invertidoOlimpoCKX41Monitorización de cultivos celulares, recuento TRAP
IsopropanolSigma-AldrichI9516Precipitación de ARN
LPS (lipopolisacárido de E. coli)Sigma-AldrichL4391Reabsorción ósea inflamatoria in vivo
LY900009 (inhibidor de la γ-secretasa)Productos químicos SelleckS7999Compuesto de prueba - inhibidor de osteoclastos
M-CSF (factor estimulante de colonias de macrófagos)R& Sistemas D416-ML-010Supervivencia de macrófagos y diferenciación de osteoclastos
Escáner Micro-CTBrukerSkyScan 1272Análisis de microarquitectura ósea
Lector de microplacasBioTekSinergia H1Mediciones de absorbancia (CCK-8)
MicrotomoLeicaRM2255Sección histológica
Naftol AS-MX fosfatoSigma-AldrichN5000Sustrato de tinción TRAP
Agujas (25G, 27G)BD305122, 305109Lavado de médula ósea, inyecciones
Software NReconBrukerVersión 1.7Reconstrucción de imágenes de micro-CT
ParafinaSigma-AldrichP3683Inclusión de tejidos
Paraformaldehído (4%)Sigma-AldrichP6148Fijación celular y tisular
PBS (solución salina tamponada con fosfato)Gibco/Thermo Fisher14190-144Lavado de celdas y preparación de tampones
Pentobarbital sódicoSigma-AldrichP3761Anestesia animal y eutanasia
Cóctel de inhibidores de la fosfatasaRoche4906837001Conservación de la fosforilación
Mezcla maestra verde PowerUp SYBRBiosistemas aplicadosA25742PCR cuantitativa en tiempo real
Cóctel de inhibidores de proteasaRoche11697498001Prevención de la degradación de proteínas
Membrana de PVDF (0,45 μ m)Bio-Rad1620177Transferencia de proteína Western blot
RANKL (Receptor Activador de NF-κ ligando B)R& Sistemas D462-TEC-010Inducción de diferenciación de osteoclastos
Sistema de PCR en tiempo realBiosistemas aplicados7500 RápidoAnálisis cuantitativo de la expresión génica
Rodamina-faloidinaInvitrogen/Thermo FisherR415Visualización de F-actina
Tampón RIPATecnología de señalización celular9806SExtracción de proteínas
Agua libre de ARNasaAmbion/Thermo FisherAM9937Disolución de ARN y PCR
Geles SDS-PAGE (10%)Bio-Rad4561036Separación de proteínas Western blot
Leche descremada en polvoBio-Rad1706404Bloqueo de Western blot
Tampón de acetato de sodio (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichS2889Tampón de tinción TRAP
Tartrato de sodio (50 mM)Sigma-AldrichS4297Especificidad de tinción TRAP
EspectrofotómetroTermo FisherNanoDrop 2000Medición de la concentración de ARN/proteína
SPSSCorporación IBMVersión 28.0Análisis estadístico
Jeringas (1 ml, 10 ml)BD309659, 309604Lavado de médula ósea, inyecciones
Matraces de cultivo celular T75Corning430641Cultivo primario de BMM
TBST (solución salina tamponada con Tris con 0,1% de Tween-20)Bio-Rad1706531Tampón de lavado Western blot
Búfer de transferenciaBio-Rad1704270Transferencia de proteína Western blot
Tritón X-100Sigma-AldrichT8787Permeabilidad celular
Reactivo TRIzolInvitrogen/Thermo Fisher15596026Extracción total de ARN
Azul de tripano (0,4%)Sigma-AldrichT8154Evaluación de la viabilidad celular
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco/Thermo Fisher25200-056Recolección y desprendimiento de células
Sistema de transferencia Western blotBio-RadTrans-Blot TurboTransferencia de proteínas a la membrana
XilenoSigma-AldrichX3750Procesamiento y limpieza de tejidos
α-MEM (Medio esencial mínimo alfa)Gibco/Thermo Fisher12561-056Medio de cultivo celular

Referencias

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