Artículo de investigación

Microlesión de la unión tendón-hueso causada por ejercicio exhaustivo agudo en ratas: cambios ultraestructurales y mecanismo

353 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69184

⸱

14 de noviembre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

En este artículo

Resumen

Este estudio tuvo como objetivo explorar los cambios y mecanismos ultraestructurales en la unión tendón-hueso debido al ejercicio exhaustivo agudo. El ejercicio exhaustivo agudo induce microlesiones en la unión tendón-hueso, activando transitoriamente el estrés del RE y sus vías de señalización apoptótica mediadas. Sin embargo, estas microlesiones y el estrés de la sala de emergencias se pueden restaurar progresivamente después del ejercicio.

Resumen

Las microlesiones inducidas por el ejercicio en la unión tendón-hueso (entesis) pueden provocar tendinopatía. La investigación de los cambios y mecanismos ultraestructurales dentro de la entesis después del ejercicio exhaustivo agudo puede mejorar nuestra comprensión de la tendinopatía y guiar los tratamientos clínicos. En este estudio, treinta y seis ratas Sprague-Dawley macho fueron asignadas aleatoriamente a dos grupos: control y ejercicio exhaustivo. El grupo de ejercicio exhaustivo se subdividió en cinco subgrupos según el tiempo posterior al ejercicio: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h. Se empleó tinción con hematoxilina-eosina y microscopía electrónica para examinar los cambios en la unión tendón-hueso del calcáneo. La expresión de las proteínas relacionadas con el estrés del retículo endoplásmico (ERS) GRP78, CHOP y Caspasa-12 en la unión tendón-hueso se cuantificó mediante inmunohistoquímica (IHC). Después del ejercicio exhaustivo agudo, las uniones tendón-hueso de las ratas que se sometieron a ejercicio exhaustivo mostraron alteraciones estructurales significativas. Los condrocitos y las fibras de colágeno exhibieron notables cambios ultraestructurales indicativos de ERS. Los niveles de proteína ERS aumentaron inmediatamente después del ejercicio, alcanzando su punto máximo a las 6 h. Estos niveles de proteínas comenzaron a disminuir a las 12 h después del ejercicio y volvieron a la línea de base a las 48 h. En conclusión, el ejercicio exhaustivo agudo induce microdaño y estrés del retículo endoplásmico en la unión tendón-hueso en ratas, pero no se produce ningún daño irreversible. El tratamiento y la reparación oportunos de estas microlesiones pueden prevenir daños excesivos y el desarrollo de tendinopatías.

Introducción

La tendinopatía de Aquiles es una afección clínica común causada por lesiones frecuentes por uso excesivo del tobillo. Este trastorno se caracteriza por hinchazón, dolor y disfunción de los tendones. Es más frecuente en personas mayores y atletas, particularmente corredores y saltadores. La tendinopatía de Aquiles se clasifica en tendinopatía insercional e insercional. La tendinopatía no insercional afecta al tendón de 2 a 6 cm por encima de su inserción ósea, mientras que la tendinopatía insercional afecta la unión tendón-hueso1. Además, la tendinopatía no insercional tiende a ocurrir en personas con sobrepeso, mayores y menos activas, mientras que la tendinopatía insercional tiende a ocurrir en personas más activas1.

La unión tendón-hueso, donde el tendón se inserta en el hueso, implica una transición gradual del tejido tendinoso al tejido óseo, incluido el fibrocartílago no calcificado y el fibrocartílago calcificado2. Este cambio proporciona una transición de un tejido tendinoso blando y flexible a un hueso duro. En términos de ingeniería, esta región sirve como punto de anclaje, transmitiendo fuerza muscular para facilitar el movimiento articular 3,4. Por lo tanto, esta región es un sitio de concentración de estrés y comúnmente está sujeta a lesiones por uso excesivo en los deportes.

La investigación clínica se ha centrado principalmente en la tendinopatía no insercional, con menos atención a la tendinopatía insercional en la unión tendón-hueso2. Las investigaciones indican que la carga de uso excesivo promueve la desorganización y fragmentación del colágeno, la infiltración del tejido adiposo y la neovascularización en el tendón. También conduce a hiperplasia de fibrocondrocitos, osificación endocondral y espolones óseos tanto en las regiones de fibrocartílago calcificadas como no calcificadas5. Sin embargo, estudios recientes sugieren que los patrones de contracción muscular pueden desempeñar un papel más significativo que la cantidad de ejercicio en la tendinopatía insercional 6,7. Por lo tanto, se necesita más investigación para comprender el impacto del uso excesivo en las uniones tendón-hueso. Estudios anteriores han explorado los efectos del uso excesivo, como saltar o correr a largo plazo, en estos cruces. Sin embargo, pocos han investigado el impacto del ejercicio exhaustivo agudo. Un estudio reciente sugiere que el ejercicio agudo induce estrés en el retículo endoplásmico en los riñones de ratas, lo que indica una regulación positiva de la señalización de IL-6 y las proteínas de choque térmico (HSP), y una disminución en el ARNm del complejo respiratorio mitocondrial8. No se ha informado si tales cambios ocurren en las uniones tendón-hueso. Este estudio se centra en la unión tendón-hueso (entesis) para dilucidar los cambios y mecanismos subyacentes inducidos por el ejercicio exhaustivo agudo. Los hallazgos tienen como objetivo contribuir al desarrollo de estrategias preventivas para la tendinopatía insercional.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos para animales de experimentación establecidos por el Departamento de Ciencia y Tecnología del Instituto Superior de Medicina Tradicional China de Sichuan (Aprobación No: 2023DS01). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño y procedimiento experimental

  1. Animales
    Treinta y seis ratas macho de 12 semanas de edad CD-Sprague-Dawley fueron alojadas y alimentadas ad libitum durante todo el período experimental. El ambiente se mantuvo a una temperatura de 20-25 °C y un nivel de humedad del 50%-60%, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
  2. Diseño de grupos
    Después de una semana de alimentación adaptativa, las ratas fueron asignadas aleatoriamente a un grupo de control (Con, n = 6) o a un grupo de ejercicio exhaustivo (EE, n = 30). Las ratas del grupo EE se sometieron a un entrenamiento de adaptación corriendo a una velocidad de 10 m / min durante 15 minutos en una cinta de correr cuesta arriba con una inclinación de 10 grados durante tres días. Después del entrenamiento adaptativo, el grupo de EE se dividió en cinco subgrupos de tiempo: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h después del ejercicio exhaustivo.
  3. Procedimiento de intervención
    Las ratas del grupo de control no hicieron ejercicio, mientras que las del grupo EE se sometieron a una carrera exhaustiva en una cinta de correr cuesta arriba con una inclinación de 10 grados (Figura 1A). Siguiendo el protocolo9 de Bedford, la carga de ejercicio se dividió en tres niveles: Nivel 1 a 10 m/min durante 15 min, Nivel 2 a 15 m/min durante 15 min y Nivel 3 a 20 m/min hasta el agotamiento (Figura 1B). El agotamiento se determinó cuando una rata ya no podía correr y permanecía atrapada en la pista tres veces en un período de menos de 1 minuto10, a pesar de la estimulación eléctrica repetida de baja intensidad (150 V, corriente alterna de 0,5 mA) y sonora (70 dB).

Las ratas fueron sacrificadas mediante inyección intraperitoneal excesiva de pentobarbital sódico al 3% (200 mg/kg) en los momentos especificados (0 h, 6 h, 12 h, 24 h y 48 h después del ejercicio exhaustivo). La piel y los tejidos subcutáneos del calcáneo se disecaron cuidadosamente y el tendón de Aquiles se cortó 2 cm por encima del calcáneo con unas tijeras oftálmicas. El calcáneo derecho (incluido el tendón de Aquiles adjunto) se conservó en paraformaldehído al 4% para el examen histopatológico y las pruebas inmunohistoquímicas. Además, se almacenaron tres muestras aleatorias del lado izquierdo en una solución de paraformaldehído al 2%-glutaraldehído al 2,5% para microscopía electrónica para estudiar los cambios ultraestructurales ( Figura 1C).

2. Histología de la unión tendón-hueso

Las muestras se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 48 h y se descalcificaron con EDTA al 15% durante 4 semanas a temperatura ambiente (20-25 °C), con la solución cambiada diariamente. El proceso de descalcificación concluía cuando el hueso podía perforarse fácilmente con una aguja sin aplicar ninguna fuerza. Después de la descalcificación, las muestras se sometieron a deshidratación a través de un proceso automatizado que involucró una serie graduada de etanol y xileno, seguido de tres lavados con PBS. Las muestras se incluyeron en parafina sagitalmente y se seccionaron a 5 μm. La tinción de hematoxilina-eosina se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar, y las imágenes se capturaron con un sistema de microcámara triocular digital Panthera con un aumento de 20× y 40×.

3. Escaneo de microscopía electrónica

Las muestras de la izquierda se prefijaron con paraformaldehído al 2%-glutaraldehído al 2,5% durante 48 h, luego se deshidrataron en una serie de soluciones de acetona, se infiltraron en un analizador de curado epoxi y se incrustaron sagitalmente. Las secciones semifinas se tiñeron con azul de metileno para identificar la región de unión tendón-hueso. Las secciones ultrafinas, de aproximadamente 60-90 nm de espesor, se cortaron con un cuchillo de diamante. Estas secciones se tiñeron con acetato de uranilo durante 10-15 min, seguido de citrato de plomo durante 1-2 min. Las secciones se examinaron bajo un microscopio electrónico de transmisión con aumentos de 6000×, 12000× y 25000×.

4. Ensayo inmunohistoquímico

La unión tendón-hueso se descalcificó y seccionó de forma rutinaria como se describió anteriormente. Después de la incubación con una solución de recuperación de antígeno tampón de citrato durante 10 min, las muestras se trataron con H2O2 al 3% durante 10 min para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, seguido de un bloqueo con suero de cabra normal durante 20 min a 25 °C. A continuación, las secciones se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios, incluido GRP78 (1:100). CHOP (1:100) y Caspasa-12 (1:100). Posteriormente, las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios durante 2 h a 25 °C. El desarrollo del color se logró utilizando DAB durante 8 min a 25 °C, lo que resultó en una señal positiva marrón-amarilla. Los núcleos se volvieron a teñir con hematoxilina durante 3 min. Se utilizó el software Image-Pro Plus 6.0 para analizar la densidad media. Se seleccionaron tres regiones de interés de la región de la unión tendón-hueso (tendón, fibrocartílago y fibrocartílago mineralizado) para el análisis, y se calculó el valor promedio.

5. Análisis estadístico

Se utilizó GraphPad Prism 8 para analizar los datos y generar gráficos. Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre diferentes grupos se realizaron utilizando ANOVA de una vía, y la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) se utilizó para las comparaciones por pares. Un valor de p de < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Como se muestra en la Figura 2A, en el grupo de control, los condrocitos y los fibrocitos de colágeno en la unión tendón-hueso están dispuestos regularmente, y hay una línea azul suave entre el fibrocartílago y el fibrocartílago mineralizado, conocida como marca de marea (flechas amarillas). En los grupos de ejercicio exhaustivo, se produjeron cambios ultraestructurales en la unión tendón-hueso. Los cambios implican un aument...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La unión tendón-hueso, también conocida como entesis o sitios de inserción, permite la inserción de tendones en el hueso y es un sitio de concentración de tensión donde los ligamentos y tendones se unen al hueso4. Como punto de anclaje, facilita el movimiento del tobillo, transmite la fuerza de contracción del músculo de la pantorrilla a los ligamentos y tendones del pie y participa en el movimiento del tobillo y el pie2. La unión tendón-hu...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean expresar su sincera gratitud por el apoyo recibido de la Fundación de Ciencias Naturales (Subvención No. 23ZRYB03), el Proyecto del Equipo de Investigación e Innovación (TD-2022-04), el Grupo de Innovación en Ciencias y Educación de Medicina Clínica y del Colegio de Medicina Tradicional China de Sichuan, así como el proyecto de investigación 2025 (25MSZX329) financiado por la Administración Provincial de Medicina Tradicional China de Sichuan.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de 2% de paraformaldehído-2,5% de glutaraldehídoMKBio, ChinaMM1515, Microscopía electrónica Escaneo
Anti-Caspasa12AnticuerpoHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.HA500144Ensayo inmunohistoquímico
Anticuerpo Anti-CHOPHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ET1703-05Ensayo inmunohistoquímico
Anticuerpo anti-GRP78Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ER1706-50Ensayo inmunohistoquímico
BiomicroscopyMotic Industrial Group Co., Ltd.CHINABA210DigitalBiomicroscopía para histoología de la unión tendón-hueso Ensayo inmunohistoquímico
Ratas CD-Sprague-DawleyBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK2021-0007 CD
Solución de recuperación de antígenos tampón de citratoZSGB-Bio, ChinaZLI-9065, Ensayo inmunohistoquímico
DAB   ZSGB-Bio, ChinaZLI-9018 Ensayo inmunohistoquímico
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Tinción de hematoxilina-eosina  
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Microscopía electrónica Escaneo
etanol y la informaciónSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Tinción de hematoxilina-eosina  
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.  GraphPad Prism 8 Análisis estadístico
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Ensayo inmunohistoquímico
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. EE. UU.Image-Pro Plus 6.0Ensayo inmunohistoquímico
Paraformaldehído Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Tinción de hematoxilina-eosina   Ensayo inmunohistoquímico
PBSZSGB-Bio, ChinaZLI-9062Microscopía electrónica Escaneo
Microscopio electrónico de transmisiónLABORATORIO DE ÓPTICA ELECTRÓNICA DE JAPÓN CO., LTDJEM-1400Flash, JapónMicroscopía electrónica Escaneo
Cinta de correr para ratas y RatónBioMed Easy Technologies Co., Ltd  CHINASA101Realizé ejercicio exhaustivo en la cinta
xilenoSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Tinción de hematoxilina-eosina  

Referencias

  1. Li, H. Y., Hua, Y. H. Achilles tendinopathy: Current concepts about the basic science and clinical treatments. Biomed Res Int. 2016, 6492597(2016).
  2. Tits, A., et al. Local anisotropy in mineralized fibrocartilage and subchondral bone beneath the tendon-bone interface. Sci Rep. 11 (1), 16534(2021).
  3. Doschak, M. R., Zernicke, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. J Musculoskelet Neuronal Interact. 5 (1), 35-40 (2025).
  4. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  5. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  6. Ozone, K., et al. Structural and pathological changes in the enthesis are influenced by the muscle contraction type during exercise. J Orthop Res. 40 (9), 2076-2088 (2022).
  7. Ozone, K., et al. Eccentric contraction-dominant exercise leads to molecular biological changes in enthesis and enthesopathy-like morphological changes. J Orthop Res. 41 (3), 511-523 (2023).
  8. da Silva, A. S. R., et al. Interleukin-6 modulates endoplasmic reticulum stress signaling and mitochondrial protein complexes in the kidney following acute exhaustive exercise. Cell Stress Chaperones. 30 (5), 100111(2025).
  9. Wang, Y., et al. Effect of one-time high load exercise on skeletal muscle injury in rats of different genders: oxidative stress and mitochondrial responses. Acta Cir Bras. 37 (8), e370805(2022).
  10. Świątkiewicz, M., et al. Increases in brain 1 H-MR glutamine and glutamate signals following acute exhaustive endurance exercise in the rat. Front Physiol. 8, 19(2017).
  11. Sun, Y., et al. Reconstruction of large chronic rotator cuff tear can benefit from the bone-tendon composite autograft to restore the native bone-tendon interface. J Orthop Translat. 24, 175-182 (2020).
  12. Gögele, C., Hahn, J., Schulze-Tanzil, G. anatomical tissue engineering of the anterior cruciate ligament entheses. Int J Mol Sci. 24 (11), 9745(2023).
  13. Sartori, J., et al. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  14. Wang, L., et al. VEGF and BFGF expression and histological characteristics of the bone-tendon junction during acute injury healing. J Sports Sci Med. 13 (1), 15-21 (2014).
  15. Benjamin, M., Rufai, A., Ralphs, J. R. The mechanism of formation of bony spurs (enthesophytes) in the Achilles tendon. Arthritis Rheum. 43 (3), 576-583 (2000).
  16. Luo, J., et al. Animal model for tendinopathy. J Orthop Translat. 42, 43-56 (2023).
  17. Cook, J. L., et al. Revisiting the continuum model of tendon pathology: What is its merit in clinical practice and research. Br J Sports Med. 50 (19), 1187-1191 (2016).
  18. Yu, C., et al. Exercise effects on the biomechanical properties of the Achilles tendon: A narrative review. Biology (Basel). 11 (2), 172-184 (2022).
  19. Lu, H., et al. Treadmill running initiation times and bone-tendon interface repair in a murine rotator cuff repair model. J Orthop Res. 39 (9), 2017-2027 (2021).
  20. Schwarz, D. S., Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: Structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 73 (1), 79-94 (2016).
  21. Oakes, S. A., Papa, F. R. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 10, 173-194 (2015).
  22. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S., Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res. 89, 101198(2023).
  23. Almanza, A., et al. Endoplasmic reticulum stress signaling - from basic mechanisms to clinical applications. FEBS J. 286 (2), 241-278 (2019).
  24. Huang, J., et al. Endoplasmic reticulum stress associates with the development of intervertebral disc degeneration. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1094394(2023).
  25. Murata, N., et al. Insulin reduces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by decreasing mitochondrial hyperpolarization and caspase-12 in INS-1 pancreatic β-cells. Physiol Rep. 12 (12), e16106(2024).
  26. Chen, Y., et al. Single-cell integration analysis of heterotopic ossification and fibrocartilage developmental lineage: Endoplasmic Reticulum Stress Effector Xbp1 transcriptionally regulates the notch signaling pathway to mediate fibrocartilage differentiation. Oxid Med Cell Longev. 2021, 7663366(2021).
  27. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin inhibits peritendinous adhesion via the endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis. Front Pharmacol. 10, 967(2019).
  28. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin prevents fibrotic pathways in fibroblasts in vitro. IUBMB Life. 71 (5), 653-662 (2019).
  29. Li, J., et al. Extracellular vesicles from hydroxycamptothecin primed umbilical cord stem cells enhance anti-adhesion potential for treatment of tendon injury. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 500(2020).
  30. Liu, Y. C., et al. Alda-1, an activator of ALDH2, ameliorates Achilles tendinopathy in cellular and mouse models. Biochem Pharmacol. 175, 113919(2020).
  31. Liu, C., et al. Tendon microstructural disruption promotes tendon-derived stem cells to express chondrogenic genes by activating endoplasmic reticulum stress. J Orthop Res. 41 (2), 290-299 (2023).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Estr s del ret culo endopl smicomodelo de ratatinci n de hematoxilina y eosinamicroscop a electr nicainmunohistoqu micaultraestructura de los condrocitoscambios en las fibras de col geno

Artículos relacionados