Disección de los músculos de vuelo indirecto de Drosophila melanogaster para enfoques de microscopía

Summary

Drosophila es un modelo poderoso para comprender los mecanismos fundamentales de la miogénesis. Este protocolo para la disección y preparación de hemisecciones de tórax permite el análisis microscópico del músculo de vuelo indirecto tanto de la etapa de pupa como de la adulta. Este protocolo permite obtener imágenes confocales de la morfología celular, la localización de proteínas, la estructura muscular y muchos otros aspectos de la miogénesis.

Abstract

Los músculos de vuelo indirecto (IFM) de Drosophila melanogaster son un poderoso modelo genético para explorar los principios fundamentales de la miogénesis. El mecanismo contráctil y muchos componentes del sarcómero se conservan desde moscas hasta vertebrados, lo que permite el estudio de los procesos celulares desde la regulación transcripcional y el procesamiento del ARN hasta el metabolismo y la mecanobiología que dirigen y afinan el desarrollo muscular. Muchas de estas vías celulares están alteradas en las miopatías humanas, y los estudios de IFM proporcionan información relevante sobre la etiología molecular de la enfermedad muscular. En particular, las moscas son adecuadas para la microscopía para analizar la morfología y función de las miofibras y los sarcómeros en todo el proceso de miogénesis de la MFI, desde la especificación de los mioblastos hasta la formación, maduración y mantenimiento de las miofibrillas. Aquí, se presenta un protocolo para la disección de IFM de D. melanogaster en puntos de tiempo de pupa y adulto para enfoques de microscopía. Se proporcionan protocolos ilustrados para la disección del hemitórax de las IFM tardías de pupas y adultos, así como para la disección a libro abierto de las IFM de las pupas tempranas. Se describen los procedimientos de fijación, tinción y montaje de muestras y los artefactos de disección comunes, con datos representativos que demuestran la compatibilidad de la disección de IFM con diferentes reactivos de fijación. Estos protocolos se aplican para estudiar el alelo hipomórfico Smn^E33 de la neurona motora de supervivencia de la proteína de unión al ARN (Smn) a las 26 h después de la formación del pupario (APF), 72 h APF y en IFM adultos, proporcionando una nueva visión de un modelo de atrofia motora espinal (SMA) e ilustrando la utilidad general de este protocolo. Este protocolo detallado facilita el acceso al sistema modelo IFM y la adquisición de datos de microscopía de alta calidad para investigar los principios de la miogénesis.

Introduction

Los animales tienen cientos de músculos que controlan diferentes movimientos, desde permitir la deambulación hasta facilitar el habla y agarrar una herramienta. Para apoyar una gama tan amplia de funciones, los músculos difieren en tamaño, inserción, capacidad contráctil, metabolismo^{y expresión génica}. Un enfoque importante dentro del campo de la biología muscular es comprender cómo estas diferencias estructurales y funcionales surgen durante el desarrollo y se alteran en la enfermedad muscular². La contracción muscular es impulsada por sarcómeros construidos con filamentos delgados que contienen actina anclados en el disco Z que se interdigitan con filamentos gruesos bipolares que contienen miosina anclados en la línea M³. Los sarcómeros se organizan de extremo a extremo en miofibrillas, y esta disposición regular en el músculo estriado aparece como bandas alternas claras y oscuras bajo un microscopio⁴, proporcionando un método visual práctico para monitorear los cambios en el ensamblaje y la organización de los sarcómeros. En combinación con la genética y los enfoques bioquímicos, la microscopía ha proporcionado información importante sobre los procesos celulares, como la regulación transcripcional, el procesamiento del ARN, el metabolismo y la mecanotransducción ^5,6,7 que instruyen y ajustan el desarrollo y la función muscular. Muchos de estos procesos celulares se interrumpen en las miopatías humanas y los trastornos neuromusculares ^8,9, lo que subraya la importancia de comprender el desarrollo muscular para obtener información sobre la etiología de la enfermedad muscular. Los avances en ingeniería genética, que permiten la manipulación de células individuales y el etiquetado endógeno de proteínas^10,11 junto con los avances tecnológicos en la adquisición y resolución de imágenes^12,13 aseguran la importancia continua de la microscopía para la investigación muscular. Por lo tanto, los sistemas modelo con protocolos claros y fáciles de implementar para la disección muscular y la preparación de muestras son valiosos en el campo muscular.

Los músculos de vuelo indirecto (IFM) de D. melanogaster son un modelo poderoso y bien caracterizado para estudiar los principios básicos de la miogénesis⁸. Los IFM consisten en seis músculos dorsal-longitudinales (DLM) por hemitórax que se forman en plantillas musculares larvarias y siete fibras musculares dorsal-ventrales (DVM) que se construyen de novo durante el desarrollo de la pupa¹⁴. Debido a su accesibilidad cerca de la línea media, muchos estudios de IFM se centran en los DLM, el músculo más grande de las moscas adultas que abarca toda la longitud de 1 mm del tórax¹⁵. Al inicio de la pupación, los mioblastos IFM migran desde su nicho en la bisagra del disco del ala hasta el tórax, donde se fusionan para formar miotubos sincitiales¹⁶. Después de la unión del tendón alrededor de 24 h APF a 27 ° C, las miofibras IFM organizan progresivamente su citoplasma y citoesqueleto, compactan e inician la miofibrilogénesis a partir de 30-32 h APF¹⁷. Se agregan nuevos sarcómeros a las miofibrillas y las miofibras crecen para llenar el tórax hasta alrededor de 48 h APF. Los IFM luego se someten a un proceso de maduración concordante con cambios tanto en la transcripción como en el empalme que promueve la adquisición de propiedades metabólicas y contráctiles adultas y la activación del estiramiento¹⁸. Las moscas adultas se acercan a la caja de pupa entre 90 h y 100 h APF a 27 ° C, y aproximadamente a 100 h APF (hembras a aproximadamente 98 h APF y machos a aproximadamente 102 h APF) a 25 ° C¹⁹. Los IFM son un sistema modelo versátil y relevante. Pueden ser monitoreados en todas las etapas de la miogénesis, son morfológica y funcionalmente distintos de otros tipos de miofibras en la mosca y se benefician de una amplia variedad de herramientas genéticas accesibles y enfoques de manipulación ^8,20. El mecanismo contráctil, la morfología básica del sarcómero y muchos componentes estructurales se conservan de las moscas a los vertebrados⁵, lo que permite la traducción de los principios miogénicos de las moscas a los humanos. De hecho, los modelos de mosca de enfermedades neuromusculares como la distrofia miotónica, la atrofia motora espinal (AME), las miopatías miofibrilares y las actinopatías han proporcionado información etiológica y terapéutica^21,22. En particular, las moscas son adecuadas para la microscopía para analizar la morfología de las fibras y los sarcómeros a lo largo de la miogénesis, desde la especificación de los mioblastos hasta la miofibrilogénesis, la maduración y el mantenimiento de los sarcómeros.

Los IFM de Drosophila se han utilizado para aplicaciones de microscopía durante más de cuatro décadas, lo que contribuye en gran medida a la comprensión del crecimiento y desarrollo muscular⁸. Durante este tiempo, los protocolos de disección de IFM se han adaptado continuamente a medida que avanzaba la tecnología, lo que ha llevado a una amplia gama de protocolos presentados en niveles variables de detalle que son óptimos para algunas y subóptimas para otras técnicas de imagen. Por ejemplo, los protocolos desarrollados para microscopía electrónica implican condiciones de fijación fuertes, cortes ultrafinos y tinción de contraste con metales pesados 3,23,24,25, pero no son óptimos para microscopía óptica. Los protocolos desarrollados para diseccionar rápidamente los IFM del tórax para su uso en ensayos bioquímicos o análisis moleculares ^26,27 pierden el contexto tisular y pueden alterar la estructura de la miofibrilla y, por lo tanto, no son óptimos para los enfoques de microscopía. Los enfoques de disección se desarrollaron para el análisis del músculo larvario o del músculo abdominal adulto^20,28, pero no son óptimos para el aislamiento de IFM intactos. Los enfoques de imágenes en vivo requieren disecciones mínimamente invasivas o medios especiales para mantener vivo el tejido IFM durante el proceso de imagen^29,30, y no implican los pasos de fijación necesarios para preservar los músculos para la inmunohistoquímica. Existen múltiples protocolos para la inclusión en parafina o la criosección de tejidos IFM y son compatibles con la histoquímica o la tinción de anticuerpos 27,31,32, pero estos enfoques generalmente implican congelación y deshidratación tisular que pueden alterar la ultraestructura muscular y limitar el reconocimiento de ciertos antígenos por parte de los anticuerpos primarios. Los protocolos que fijan directamente los IFM preservan la morfología muscular y limitan los cambios en la conformación del antígeno y son deseables para muchos experimentos de inmunohistoquímica²⁴. Sin embargo, estos protocolos también están dirigidos a aplicaciones específicas, por ejemplo, protocolos que disocian IFM que permiten el análisis de miofibrillas únicas mediante fluorescencia, crioEM o microscopía de superresolución 20,33,34. Otros ejemplos incluyen protocolos para diseccionar fibras IFM intactas del tórax^32,35 o para generar preparaciones de montaje completo o hemitórax 20,32,36 que permiten el análisis tanto de miofibras como de sarcómeros en un contexto intacto. Puede ser un desafío para un nuevo usuario clasificar la gran cantidad de protocolos existentes, la mayoría de los cuales están basados en texto. Los aprendices y los investigadores de pregrado se beneficiarían de un protocolo detallado de disección de IFM aplicado a aplicaciones de inmunohistoquímica estándar.

Este artículo incluye una serie de protocolos para la disección y preparación de IFM de D. melanogaster en etapas de pupa y adulto para enfoques de microscopía inmunohistoquímica. Este enfoque se ha utilizado en publicaciones recientes que rastrean las funciones de desarrollo de las proteínas de unión al ARN Bruno1³⁷ y Rbfox1³⁸ a lo largo de la miogénesis IFM. El protocolo incluye ilustraciones detalladas e imágenes paso a paso para guiar a los usuarios potenciales a través de la disección del hemitórax de IFM de IFM adultos y pupas tardías (48 h a 96 h APF), donde el tórax se divide a lo largo de la línea media, manteniendo intacta la estructura de las miofibras. Además, este protocolo cubre la disección a libro abierto de las etapas tempranas de la pupa (8 h a 48 h APF), donde la porción ventral del tórax se corta y se levanta, como si se abriera un libro, para exponer los IFM intactos unidos a la epidermis dorsal. Otros pasos del protocolo incluyen la fijación, la tinción y el montaje de muestras, y los datos representativos demuestran que este enfoque es compatible con diversos métodos de fijación para preparar tejidos para inmunohistoquímica y microscopía de fluorescencia. Se proporcionan ejemplos representativos para ayudar a los nuevos usuarios a identificar artefactos de disección comunes. El protocolo se aplica para analizar el fenotipo de IFM de desarrollo de Smn^E33, un alelo hipomórfico de la neurona motora de supervivencia (Smn) utilizado como modelo de mosca de la atrofia motora espinal (AME)^21,39, a las 26 h APF, 72 h APF y en IFM adultos. Los datos presentados aquí proporcionan información sobre la función específica del músculo de Smn y destacan la aplicabilidad de este protocolo de disección para estudiar el desarrollo muscular y la etiología de la enfermedad muscular.

Protocol

Declaración ética:
Todos los experimentos de este protocolo utilizan Drosophila melanogaster, un insecto holometábolo. Los invertebrados no están sujetos a las regulaciones de bienestar animal en los Estados Unidos de América y su uso no requiere aprobación ética. Todo el trabajo se llevó a cabo bajo las pautas estándar de bioseguridad institucional y seguridad de laboratorio, y fue aprobado por el Comité de Bioseguridad Institucional de Kansas City de la Universidad de Missouri bajo el número de protocolo 21940 (22-11).

1. Disección del hemitórax de la MFA adulta (Figura 1)

1. Reúna los suministros necesarios, incluidas dos pinzas Dumont # 5 con puntas biológicas, una pinza Dumont # 3, un par de tijeras de resorte Vannas, una pipeta de plástico, un pincel, una placa de 24 pocillos, toallitas sin pelusa, un portaobjetos de microscopio y hojas de criostato (consulte la Tabla de materiales). Prepare 1x PBS, PBS-T al 0,05% y soluciones de fijación (consulte el Archivo complementario 1). Se encuentra disponible una descripción general del diagrama de flujo de la siguiente disección de hemitórax en adultos (Figura complementaria 1).
2. Recolecte adultos del genotipo y la edad deseados (por ejemplo, recién cerrados, adultos de 1 día o adultos de 5 días). Anestesiar moscas de muestra en_CO2 o hielo.
   NOTA: Las moscas utilizadas en este protocolo se cultivaron en un ciclo de 12 horas al día: 12 horas a la noche en una incubadora con temperatura y humedad controladas. Drosophila se cultiva de forma estándar a 25 °C o 27 °C, y se puede cultivar a 18 °C, lo que extiende el ciclo de crecimiento de 10 días a aproximadamente 20 días.
3. Utilice una pipeta de plástico para transferir una gota de 1x PBS⁴⁰ a un portaobjetos de microscopio bajo un microscopio de disección estereoscópica.
4. Transfiera las moscas de muestra a la gota de PBS en pequeños grupos usando un pincel o fórceps (Figura 1A). Retire la cabeza (Figura 1B), las alas (Figura 1C - D) y el abdomen (Figura 1E) con unas tijeras de resorte Vannas. Deje las piernas unidas (Figura 1F).
5. Transfiera suavemente los toracos con un cepillo o pinzas a una solución de fijación de 500 μL en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Fije durante el período de tiempo deseado (generalmente 15-60 minutos) en un nutator / rockero.
   NOTA: Este protocolo es compatible con múltiples tampones de fijación, incluidos paraformaldehído, glutaraldehído, metanol, solución de glioxal y otros. Consulte Resultados representativos y Archivo complementario 1 para obtener detalles sobre la optimización de las condiciones de fijación. Los fijadores deben manipularse con guantes y equipo de protección personal (EPP) adecuado de acuerdo con las pautas de productos químicos peligrosos de su institución.
6. Retire el fijador con una pipeta de 200 μl y lave en 1 ml de PBS-T al 0,05 % en un agitador nutador/balancín durante 5 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Deseche el fijador siguiendo las pautas de productos químicos peligrosos de la institución. Para la mayoría de los antígenos, los tóracos fijos se pueden almacenar en 1 ml de PBS-T al 0,05% durante un máximo de 2 semanas a 4 °C antes del corte y la tinción. Las concentraciones más altas de Triton X-100 deben probarse antes de su uso, ya que las incubaciones prolongadas en detergente pueden degradar la estructura del sarcómero.
7. Retire el tampón con una pipeta de 200 μl y transfiera las tóraces con un cepillo o pinzas a una gota de PBS-T al 0,05 % en un portaobjetos de microscopio bajo un microscopio de disección estereoscópica.
8. Oriente el tórax con el escutelo apuntando hacia arriba y estabilizado entre un par de fórceps Dumont # 3 (Figura 1G-H).
9. Deslice una hoja de criostato a través del tórax para hacer una muesca en el escutelo (Figura 1H, J, L) y luego corte hacia abajo en un movimiento suave hacia abajo a lo largo de la línea media (Figura 1I, J, L - N) para generar la hemisección del tórax que expone los IFM (Figura 1K).
   NOTA: Es importante que la cutícula esté "dentada" o agrietada antes de cortar los IFM para evitar artefactos de estiramiento que dañen la estructura del sarcómero. No "aserre" la hoja hacia adelante y hacia atrás, ya que este movimiento daña mecánicamente los IFM, lo que resulta en miofibrillas deshilachadas. Demasiado amortiguador desestabiliza el tórax entre las pinzas y dificulta el corte. Los enfoques alternativos incluyen estabilizar los tóralos uno a la vez en cinta adhesiva doble para facilitar los cortes, así como cortar desde el lado ventral del tórax.
10. Mueva las dos mitades del tórax a una posición en el portaobjetos donde permanecerán cubiertas de amortiguador para evitar que se sequen, pero no estorben futuros cortes. Repita los pasos 1.8-1.10 hasta que se hayan cortado todos los tóraces.
11. Utilice unas pinzas para transferir hemisecciones de tórax del portaobjetos del microscopio a 500 μl de PBS-T al 0,05% en un pocillo de una placa de 24 pocillos y proceda con el bloqueo y la inmunotinción (ver sección 4 a continuación).

2. Disección del hemitórax de la IFM de pupa tardía (~48 h a 96 h APF) (Figura 2, Figura 3)

1. Estadificar las pupas del genotipo deseado y la edad hasta el punto seleccionado en el desarrollo de la pupa (Figura 2). Recoja las prepupas blancas masculinas o femeninas (Figura 2A, B) con un pincel húmedo e incube sobre papel de filtro humedecido en una placa de cultivo celular de 60 mm. La estadificación y la eliminación de la pupa del caso de la pupa se han descrito previamente^20,26.
   NOTA: Las pupas sufren múltiples cambios morfológicos a medida que envejecen, como la eversión de la cabeza y la pigmentación de la caja de la pupa, los ojos y las cerdas^19,41 (Figura 2C). Estas características morfológicas se pueden utilizar como una guía aproximada para identificar la edad de una pupa (Figura 2D-E) y para identificar las pupas que no se desarrollan normalmente (Figura 2F). Sin embargo, para garantizar una línea de tiempo de estadificación precisa, se recomienda recolectar prepupas blancas en ventanas de tiempo estrechas, por ejemplo, estadificando cada 30 minutos o cada 2 h. Se necesitan puntos de tiempo estrechamente estadificados para distinguir cambios importantes en la estructura del citoesqueleto y la longitud de las miofibras que ocurren de 24 h a 35 h APF, así como para distinguir diferencias en la estructura del sarcómero a las 35 h, 48 h, 60 h, 72 h, 80 h y 90 h APF^18,42.
2. Reúna los suministros necesarios, incluido un pincel, dos fórceps Dumont # 5 con puntas biológicas, un par de tijeras de resorte Vannas, cinta adhesiva doble, un portaobjetos de microscopio, una pipeta de plástico, una placa de 24 pocillos, toallitas Kimlipe y hojas de criostato (consulte la Tabla de materiales). Prepare 1x PBS, PBS-T al 0,05% y soluciones de fijación (consulte el Archivo complementario 1). Se encuentra disponible una descripción general del diagrama de flujo de la siguiente disección del hemitórax de la pupa (Figura complementaria 2).
3. En el momento deseado, use un pincel para transferir pupas del papel de filtro a una tira de cinta adhesiva doble adherida a un portaobjetos de microscopio bajo un microscopio de disección estéreo con un aumento de 10-20x (Figura 3A, B). Alinee las pupas en la cinta mirando en la misma dirección, con el lado ventral hacia abajo.
4. Use un par de fórceps # 5 para abrir la parte delantera de la caja de pupa de la primera pupa, retirando suavemente el opérculo (la región sobre la cabeza) (Figura 3C, D, I).
5. Use con cuidado una pinza # 5 para cortar a lo largo de la caja de la pupa justo dorsal al ala y retire la caja de la pupa de la pupa en incrementos de 1-2 mm. Fije la caja de pupa a la cinta de doble palo mientras se trabaja de anterior a posterior (Figura 3E - G, I). Evite pinchar la pupa en sí, más bien inserte la punta del fórceps entre la caja de la pupa y la membrana basal / saco de pupa que rodea la pupa.
6. Después de retirar el estuche, use un movimiento de cuchara con las pinzas para levantarlo (Figura 3H, I) y transfiera suavemente la pupa fuera del estuche a una gota de 1x PBS en un segundo portaobjetos de microscopio (Figura 3J, K) para evitar la deshidratación. Repita los pasos 2.4-2.6 (Figura 3I) hasta que se hayan eliminado todas las pupas de la caja de pupa.
7. Retire el abdomen de las pupas disecadas con unas tijeras de resorte Vannas (Figura 3L).
   NOTA: Se extirpa el abdomen para permitir una mejor penetración mediante fijador en el siguiente paso. Para evitar dañar el tórax, corte directamente en el abdomen, dejando hasta un 30% del abdomen unido al tórax.
8. Transfiera suavemente la cabeza de la pupa con el tórax (Figura 3M) con un cepillo o pinzas a 500 μL de solución de fijación en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Fije durante el período de tiempo deseado (generalmente 15-60 min) y lave en 1 ml de PBS-T al 0.05% como se describe en los pasos 1.5-1.6.
9. Retire el tampón con una pipeta de 200 μl y transfiera tóraces con un cepillo o pinzas a una gota de PBS-T al 0,05 % en un portaobjetos de microscopio bajo un microscopio de disección estereoscópica con un aumento de 10x.
10. Separe una muestra del resto y oriéntela con el lado ventral hacia abajo y estabilizada entre un par de pinzas Dumont # 3 (Figura 3N).
11. Deslice una cuchilla de criostato a través del tórax hasta que la membrana basal y la cutícula se abran, y luego corte en un movimiento suave hacia abajo a lo largo de la línea media (Figura 3O) para generar las hemisecciones del tórax que exponen los IFM (Figura 3P).
    NOTA: No "corte" la hoja hacia adelante y hacia atrás, ya que este movimiento daña mecánicamente los IFM y da como resultado miofibrillas deshilachadas. Demasiado amortiguador desestabiliza el tórax entre las pinzas y dificulta el corte. Los tócraces de pupa se pueden cortar con la cabeza unida y orientada hacia la izquierda o hacia la derecha.
12. Mueva las dos mitades del tórax a una posición en el portaobjetos donde permanecerán cubiertas de amortiguador para evitar que se sequen, pero no estorben futuros cortes. Repita los pasos 2.10-2.12 hasta que se hayan cortado todos los toracas.
13. Utilice una pinza para transferir hemisecciones de tórax del portaobjetos del microscopio a 500 μl de PBS-T al 0,05 % en un pocillo de una placa de 24 pocillos y proceda con el bloqueo y la inmunotinción (consulte el paso 4 a continuación).

3. Disección a libro abierto de IFM de pupas tempranas (~ 15 h a 48 h APF) (Figura 4)

1. Estadificar las pupas del genotipo deseado y la edad hasta el punto seleccionado en el desarrollo de la pupa (Figura 2) como se describió anteriormente (Paso 2.1).
   NOTA: Para disecciones a libro abierto, las pupas deben diseccionarse en grupos de no más de 8-10 moscas.
2. Reúna los suministros necesarios, incluido un pincel, dos fórceps Dumont # 5 con puntas biológicas, un par de tijeras de resorte Vannas, cinta adhesiva doble, un portaobjetos de microscopio, una pipeta de plástico, un plato de disección de silicona negra, un plato de tinción de vidrio negro, alfileres para insectos y toallitas sin pelusa (consulte la Tabla de materiales). Prepare 1x PBS, PBS-T al 0,05% y soluciones de fijación (consulte el Archivo complementario 1). Está disponible una descripción general del diagrama de flujo de la siguiente disección a libro abierto de pupas (Figura complementaria 3).
3. En el momento deseado, retire las pupas de la caja de pupa como se describe en los pasos 2.3-2.6. Transfiera las pupas a un plato de disección de silicona negra lleno de 1x PBS después de sacarlo de la caja de pupas (Figura 4A).
4. Después de que todas las pupas se liberen de la caja de pupas, use un fórceps Dumont # 5 para superar la tensión superficial y empuje suavemente las pupas disecadas hacia la superficie del silicio. Coloque las pupas en una línea cerca del centro del plato (Figura 4B).
5. Inserte dos agujas de insectos con un fórceps Dumont # 5 a través del abdomen de cada pupa para mantenerlo en su lugar (Figura 4C, D). Asegúrese de que las pupas estén orientadas con el lado ventral hacia arriba.
6. Use unas tijeras de resorte Vannas para abrir la membrana basal y la región anterior de la cabeza de cada pupa (Figura 4E).
7. Inserte las tijeras en la abertura y corte a lo largo de los lados derecho e izquierdo de cada pupa (Figura 4F, G, Q). Coloque las tijeras y corte justo debajo del notum en desarrollo hasta la unión entre el tórax y el abdomen para quitar las patas y las alas con la porción ventral. Asegúrese de que las tijeras estén insertadas horizontalmente y no entren en contacto con la porción dorsal del tórax (Figura 4Q).
8. Use un fórceps Dumont # 5 para agarrar y levantar la parte ventral de la pupa y retírela con unas tijeras de resorte Vannas (Figura 4H, I, Q).
9. Extirpe el cerebro, el cordón nervioso ventral (VNC), la tráquea y el intestino con un fórceps Dumont # 5 (Figura 4J, K, Q). Tenga cuidado de no perturbar los IFM en desarrollo, que están directamente debajo de la tráquea y VNC unidos a la epidermis en la porción dorsal del tórax.
10. Sujete la punta de una punta de pipeta de 200 μl para crear una abertura más amplia. Utilice una pipeta de 200 μL con la punta recortada para lavar suavemente 1x tampón PBS sobre el tórax para eliminar la mayoría de los cuerpos grasos restantes para exponer los IFM (Figura 4L, M). Sea cuidadoso para evitar desgarrar las uniones de los tendones que conectan las miofibras con la epidermis.
11. Use unas tijeras de resorte Vannas para cortar la línea media del tórax dorsal, creando dos "folíolos" que contienen IFM (Figura 4N).
12. Corte los folíolos del tórax dorsal lejos del abdomen con unas tijeras (Figura 4O, Q) y transfiera los folíolos a 300 μL de solución fijadora en un plato de vidrio negro con unas pinzas Dumont # 5 (Figura 4P). Sujete las valvas en la caja de la cabeza con las pinzas para evitar dañar las miofibras o tendones de IFM.
13. Fije durante el período de tiempo deseado (generalmente 15 minutos). Utilice una pipeta de 200 μl para retirar con cuidado el fijador y lave con 500 μl de PBS-T al 0,05 %. Proceda con el bloqueo y la inmunotinción (consulte el paso 4 a continuación).
    NOTA: No nutar ni frotar muestras en platos de vidrio negro. Las uniones músculo-tendinosas en las primeras etapas de la pupa son muy frágiles y se desgarrarán con la agitación constante del amortiguador, lo que resultará en la pérdida de IFM. Pipetea lenta y cuidadosamente alrededor de los bordes del tampón en la placa para evitar succionar muestras en la punta de la pipeta al cambiar las soluciones.

4. Inmunotinción e histoquímica de muestras fijas de IFM

1. Reúna los suministros necesarios, incluida una pipeta, puntas de pipeta y anticuerpos o tinciones necesarios. Prepare PBS-T al 0,05 %, solución bloqueante y mezclas de anticuerpos/tinciones (consulte el Archivo complementario 1).
2. Pipetear la solución de lavado (PBS-T al 0,05%) de las muestras y añadir la solución de bloqueo. Incube las muestras en una solución de bloqueo durante al menos 30 min a temperatura ambiente (con balanceo para los pasos 1-2, sin balanceo para el paso 3).
   NOTA: Las muestras pueden bloquearse alternativamente durante la noche a 4 °C. En este protocolo, las muestras se bloquearon en suero de cabra normal (NGS) al 5% en PBS-T al 0,05%. Se proporciona más información sobre las opciones de solución de bloqueo en el archivo complementario 1.
3. Retire la solución de bloqueo de los tóralos con una pipeta. Añadir la mezcla de anticuerpos primarios e incubar al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (con balanceo para los pasos 1-2, sin balanceo para el paso 3).
   NOTA: Este protocolo es compatible con la mayoría de los anticuerpos primarios. Los anticuerpos deben diluirse en una solución de bloqueo. Las diluciones de anticuerpos primarios probadas con este protocolo oscilan entre 1:10 y 1:2000 y se determinan experimentalmente para cada anticuerpo individual. Se proporcionan más detalles sobre la optimización de la tinción de anticuerpos primarios en el Archivo complementario 1.
4. Retire la mezcla de anticuerpos primarios con una pipeta y lave las muestras 3 veces durante 10 min cada una, en PBS-T al 0,05%.
5. Agregue un anticuerpo secundario o una mezcla de tinción a la muestra. Cubra la muestra con un trozo de papel de aluminio para minimizar el blanqueo. Incubar al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (con balanceo para el paso 1-2, sin balanceo para el paso 3).
   NOTA: La mayoría de los anticuerpos secundarios y las tinciones celulares fluorescentes se pueden usar con este protocolo. Muchos anticuerpos secundarios se utilizan en una dilución de 1:500. En los datos representativos a continuación (ver Resultados representativos), los núcleos se marcaron con DAPI (1 mg/ml de stock, diluido 1:1000 en PBS-T al 0,05%) y F-actina con faloidina de rodamina (300 unidades/mL de stock, diluido 1:500 en PBS-T al 0,05%).
6. Retire la mezcla secundaria/mancha con una pipeta y lave las muestras 4 veces durante 10 min cada una, en PBS-T al 0,05% a temperatura ambiente. Proceda al montaje (paso 5) directamente después del lavado.

5. Montaje de muestras teñidas en portaobjetos para análisis de microscopía (Figura 5)

1. Reúna los suministros necesarios, incluidos un pincel, fórceps, portaobjetos de microscopio esmerilado, cubreobjetos (grosor # 1), esmalte de uñas transparente, medio de montaje y toallitas sin pelusa (consulte la Tabla de materiales).
2. Etiquete el área de escritura esmerilada de un portaobjetos de microscopio con el número de muestra relevante o la información de identificación preferida (fecha, genotipo, anticuerpo, número de portaobjetos, etc.).
3. Agregue espaciadores de cubreobjetos (#1 cubreobjetos), dejando aproximadamente 1 cm entre los cubreobjetos para la colocación de la muestra (Figura 5A-C). Use una pequeña gota de glicerol al 50% para mantener los espaciadores en su lugar (Figura 5A, D).
   NOTA: Los espaciadores evitan la distorsión de la muestra al montar muestras gruesas. Los tóralos adultos generalmente requieren un espaciador grueso de 2 cubreobjetos, 48 h de tóralos APF un espaciador grueso de 1 cubreobjetos y folletos de libro abierto sin espaciador.
4. Agregue una gota de medio de montaje al pocillo entre los espaciadores del cubreobjetos, o al centro del portaobjetos del microscopio si monta muestras de pupas tempranas (Figura 5C-D). Coloque el portaobjetos bajo un microscopio de disección estéreo.
   NOTA: Hay varios tipos de medios de montaje disponibles. Si utiliza un medio autoendurecible, considere uno con un tiempo de curado de varias horas para permitir tiempo suficiente para orientar correctamente las muestras antes de que el medio se endurezca. Se ha demostrado que los medios de montaje influyen en las dimensiones^del sarcómero 43,44,45, por lo que se debe usar el mismo reactivo para todas las muestras en un experimento.
5. Utilice una pipeta para eliminar la mayor cantidad posible de tampón de lavado de las muestras. Transfiera inmediatamente las muestras con una pinza o un pincel a la gota de medio de montaje en el portaobjetos (Figura 5E).
6. Con las pinzas Dumont # 5, organice las muestras en filas y columnas, asegúrese de que las muestras no se superpongan y oriente los torácicos con los IFM hacia arriba (Figura 5F, J, Q, S). La orientación puede requerir voltear cuidadosamente las muestras donde las cerdas / cutícula están hacia arriba (Figura 5G, H, K, L, R). Tenga cuidado de no tocar los IFM, ya que el contacto dañará la estructura del sarcómero (consulte Resultados representativos).
7. Agregue con cuidado un cubreobjetos #1 (18 x 18 mm o 22 x 22 mm) sobre las muestras de tórax (Figura 5M). Si usa espaciadores, presione suavemente el cubreobjetos hasta que haga contacto con los espaciadores a ambos lados de las muestras (Figura 5N).
8. Utilice una punta de pipeta o un gotero para rellenar el área de la muestra con medio de montaje hasta que todos los tóracos estén encajados (Figura 5O). Evite crear burbujas de aire que interrumpan la adquisición de imágenes.
9. Use esmalte de uñas transparente para sellar el montaje húmedo. Recuerde sellar alrededor tanto del cubreobjetos de muestra como de los cubreobjetos espaciadores (Figura 5P, S).
   NOTA: Evite usar una capa superior o esmalte de uñas de secado rápido, ya que sellan mal y se formarán burbujas de aire a medida que se evapora el medio de montaje.
10. Seque los portaobjetos durante 10 min a temperatura ambiente. Conservar en un estuche deslizante a 4 °C. Las diapositivas se pueden fotografiar durante varios días o semanas.
11. Imágenes de muestras en un microscopio fluorescente, microscopio confocal u otro sistema de acuerdo con el diseño experimental. Los protocolos para la adquisición y el análisis de imágenes están disponibles en otros lugares 14,30,46,47,48.

Results

El protocolo de disección presentado anteriormente se puede utilizar para generar muestras de alta calidad para el análisis microscópico de la morfología de miofibras y sarcómeros IFM desde tan pronto como 8 h después de la formación del pupario (APF) utilizando el método de libro abierto (paso 3) hasta las etapas adultas utilizando el enfoque de disección de hemitórax (pasos 1 y 2). Estas disecciones se han aplicado para investigar la formación de músculo y sarcómero 18,42,49, la función del factor de transcripción ^50,51 y la regulación del ARN^37,38, entre otros. Los resultados representativos que se proporcionan a continuación demuestran la compatibilidad de este protocolo con diferentes métodos de fijación, detallan artefactos de disección comunes y utilizan el fenotipo mutante Smn^E33 para ilustrar la utilidad de este protocolo para abordar cuestiones morfológicas y biológicas celulares en el modelo IFM.

La disección IFM es compatible con múltiples métodos de fijación

Un aspecto crítico de la preparación de muestras para muestras de histoquímica o inmunofluorescencia es la preservación precisa de las estructuras celulares mediante la fijación. Los fijadores preservan la estructura y la morfología de los tejidos al prevenir la degradación y estabilizar las estructuras de proteínas y lípidos a través de la reticulación^52,53. Las diferentes clases de fijadores, por ejemplo, a base de aldehído frente a disolventes orgánicos, tienen diferentes eficiencias de penetración y reticulación e impactan diferencialmente en el reconocimiento de dianas de anticuerpos al dirigirse a distintos grupos funcionales^53,54. Las disecciones de IFM son compatibles con múltiples métodos de fijación, incluido el paraformaldehído (PFA) al 4%, el glioxal al 9% y la fijación con metanol (Figura 6), lo que enfatiza la utilidad general de este protocolo de disección.

Para comparar el tamaño y la morfología del sarcómero con la aplicación de diferentes métodos de fijación, se realizaron disecciones de hemitórax de 1 día de moscas adultas con¹¹¹⁸. Se comparó la fijación de PFA al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Figura 6A, E) o solución relajante (RS) (Figura 6B, F). La solución relajante contiene ATP y se recomienda su uso al cuantificar las dimensiones de los sarcómeros para preservar los sarcómeros en su estado relajado^20,55 (ver Archivo complementario 1). La fijación de PFA al 4% preserva eficazmente la morfología del sarcómero, pero se observó una diferencia significativa en el ancho del sarcómero entre la fijación de PFA al 4% en PBS frente a RS (Figura 6I, J). La fijación en metanol preservó la estructura de miofibras y sarcómeros (Figura 6C, G), pero los sarcómeros fueron significativamente más cortos y delgados que con la fijación de PFA al 4% (Figura 6I, J). Los IFM podrían conservarse eficazmente con una fijación de glioxal al 9% durante la noche (Figura 6D, H) (la fijación de glioxal al 3% fue ineficaz), lo que también alteró significativamente el ancho del sarcómero en comparación con la fijación de PFA al 4% (Figura 6I, J). En conclusión, los hemitóracicos IFM se pueden preservar eficazmente con múltiples fijadores. Sin embargo, como tanto el fijador como el tampón pueden influir en la medición de las dimensiones del sarcómero, los experimentos deben diseñarse con controles adecuados y un protocolo de fijación bien definido y consistente.

Artefactos comunes de disección y fijación en IFM

Un desafío con la microscopía, especialmente para los nuevos usuarios y aprendices, es distinguir los artefactos técnicos de los fenotipos de buena fe. Para ayudar con esta distinción en los IFM de Drosophila, se presentan datos representativos de los artefactos y fallas de disección observados con mayor frecuencia (Figura 6). Los protocolos de fijación requieren la optimización del tipo, la concentración y la duración de la fijación para evitar la fijación insuficiente o excesiva 52,53,54. Utilizando un curso de tiempo de fijación de w¹¹¹⁸ disecciones de hemitórax adulto de 1 día incubadas en PFA al 4% en solución relajante, se observó que mientras que el tiempo de fijación de 15 o 30 minutos preserva con precisión la morfología del sarcómero, una fijación de 7 minutos produce morfologías de sarcómero inconsistentes (Figura 6K-M). Además, el tejido es menos rígido con un tiempo de fijación más corto, lo que dificulta el corte y la bisección del tórax sin dañar los IFM. Pueden surgir artefactos adicionales tanto durante el proceso de corte como durante el montaje. La estructura de las miofibras IFM puede parecer irregular si la hoja está desafilada y provoca rasgaduras o deshilachados (Figura 6N) o si la hoja se desliza o el corte está en ángulo (Figura 6O). Si las pinzas entran en contacto directo con los IFM fijos durante la manipulación o el montaje, hacen una impresión que puede provocar hendiduras o estiramientos y pueden separar los sarcómeros (Figura 6P). El estiramiento o la deformación del tórax, ya sea durante el corte, la manipulación o el montaje, también separan los sarcómeros y provocan la pérdida de un disco Z claramente demarcado (Figura 6Q). Por último, el "aserrado" o "frotamiento" de los IFM con una pinza o cuchilla conduce a la abrasión y al desenredo, deshilachado y desorganización de las miofibrillas, especialmente en la superficie de la miofibra (Figura 6R). Los usuarios potenciales deben familiarizarse con estos artefactos técnicos y excluirlos del análisis fenotípico.

Progresión del desarrollo del fenotipo Smn^E33 en IFM

Las disecciones a libro abierto y hemitórax son particularmente útiles para rastrear la trayectoria de desarrollo de un fenotipo muscular y para identificar cuándo en el desarrollo actúa un gen de interés o surgen fenotipos de miofibrilla. El fenotipo de desarrollo IFM de Smn^E33, un alelo hipomórfico de la proteína de unión al ARN Survival motor neuron (Smn)³⁹ se presenta como datos representativos que ilustran la amplia utilidad de las disecciones a libro abierto y hemitórax.

Las pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP) que forman el espliceosoma, el complejo macromolecular que cataliza la reacción de empalme para generar ARNm⁷, son ensambladas por el complejo SMN. El complejo SMN, que consiste en las proteínas Survival motor neuron (Smn) y Gemin, es necesario para la viabilidad en todos los organismos⁵⁶. Los niveles reducidos de SMN en humanos conducen al trastorno neuromuscular hereditario grave Atrofia motora espinal (AME)²¹. Drosophila se ha utilizado como modelo para comprender la etiología de la AME y la función celular de Smn, incluido el desarrollo del alelo hipomórfico Smn^E33. Las moscas Smn^E33 son viables y fértiles, pero no pueden volar ni saltar³⁹. Si bien las moscas Smn^E33 tienen defectos de arborización de neuronas motoras, también muestran una estructura IFM desorganizada y una pérdida de expresión de Actin88F específica del músculo de vuelo^39,57. SMN se colocaliza con alfa-actinina en el disco Z en moscas y ratones³⁹, lo que sugiere que Smn puede tener una función específica del músculo.

Para comprender mejor cuándo se pierde la estructura de la miofibrilla y se requiere la función de Smn en el músculo en desarrollo, se realizó un análisis del curso temporal del desarrollo del fenotipo Smn^E33 en IFM a 26 h APF, 72 h APF y 1 a 5 días en adultos. Mientras que los IFM de control w¹¹¹⁸ tanto en APF de 72 h como en adultos tienen una fuerte señal de F-actina teñida con faloidina (Figura 7E, E', I, I') y una estructura de sarcómero regular (Figura 7G, G', K, K'), la señal de faloidina se reduce drásticamente (Figura 7F, F', J, J') y las estructuras de sarcómeros están ausentes (Figura 7H, H', L, L') en Smn^E33 IFM. En cambio, la F-actina se observa en estructuras en forma de red alrededor de los núcleos o en haces irregulares o estructuras de "estallido estelar" en el citoplasma (Figura 7H, H', L, L'), consistente con una pérdida de la expresión de Act88F^{18, 39} y una incapacidad para ensamblar filamentos delgados. Se realizaron disecciones a libro abierto para examinar el fenotipo Smn^E33 a las 26 h APF y revelaron que el desarrollo temprano de IFM procede normalmente en Smn^E33. Comparables a los IFM de control w¹¹¹⁸ (Figura 7A, A', C, C'), las moscas Smn^E33 tienen 6 fibras IFM longitudinales dorsales por hemitórax, forman cables organizados de F-actina en la periferia de la miofibra antes de la miofibrilogénesis (Figura 7B, B') y muestran una red de F-actina similar a una malla en toda la miofibra (Figura 7D, D'). Estos resultados indican que las etapas iniciales de la diferenciación de IFM proceden normalmente, mientras que Smn es necesario en etapas posteriores del desarrollo de IFM para mantener la expresión de Act88F y construir sarcómeros. Es importante destacar que estos resultados representativos ilustran el detalle fenotípico y la resolución que se puede lograr mediante disecciones a libro abierto y hemitórax.

Figura 1: Disección por hemisección de IFM adultos. (A) Coloque una mosca adulta en 1x PBS en un portaobjetos de microscopio. (B) Usando un fórceps (cian, punto) para estabilizar la mosca, retire la cabeza con unas tijeras (naranja). (C-E) Retire las alas izquierda (C) y derecha (D) y el abdomen (E). (F) Deseche la cabeza, el abdomen y las alas, y transfiera el tórax al fijador. (G, H) Oriente un tórax fijo en un portaobjetos en una gota de 1x PBS-T con la parte posterior (P) y el escutelo apuntando hacia arriba (G), usando una pinza para estabilizar la orientación (H). (I-K) Use una cuchilla de criostato para cortar el tórax por la mitad (I-J), para generar dos hemisecciones de tórax (K). (L) Diagrama de una hoja de criostato y un tórax, que ilustra la posición del corte sagital para producir hemisecciones. La hoja se desliza hacia la derecha para hacer una muesca en el escutelo del tórax y luego se mueve hacia abajo con un movimiento suave (flechas amarillas) para cortar el tórax (línea roja punteada). (M,N) Esquema de una vista coronal (M) y transversal (N) del tórax, que ilustra la posición de los principales grupos musculares y la posición del corte (entre los triángulos amarillos). Se indica la orientación del tórax (L, izquierda; R, a la derecha; V, ventral; D, dorsal; A, anterior; P, posterior). Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Estadificación de las pupas y características del desarrollo de las pupas. (A) Las pupas masculinas y (B) femeninas se pueden distinguir como prepupas blancas a las 0-2 h APF. Las pupas masculinas tienen estructuras pareadas, redondas y translúcidas (los testículos en desarrollo) hacia la parte posterior (flechas). (C) Tabla de características que sirven como sellos distintivos del desarrollo de las pupas. Las características incluyen la maduración de la caja de la pupa, la eversión de la cabeza y el desprendimiento de la pupa de la caja de la pupa, el desarrollo de la pigmentación de los ojos, la pigmentación de las cerdas, las alas, las patas, el epandrio y la cutícula, y la visibilidad de la mancha virgen (meconio). El color y la pigmentación de los ojos se oscurecen progresivamente. El momento y las etapas del desarrollo de la pupa etiquetados en la parte superior de cada columna de la tabla (puntos de tiempo indicados en texto negro, etapa correspondiente en el desarrollo de la pupa debajo en texto azul) fueron definidos previamente por Bainbridge y Bownes^19,41. (D-E) Curso temporal del desarrollo de la pupa a las 0-2 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h APF en una pupa intacta con ojos rojos (D; Mef2-Gal4, fln-GFP) y en una pupa con ojos anaranjados disecados fuera de la caja de la pupa (E; Fln-Gal4). Observe el oscurecimiento progresivo de los ojos y las cerdas de 48 h a 96 h APF. (F) Ejemplos de letalidad de pupa en puntos de tiempo tempranos, medios y tardíos del desarrollo. Las moscas letales de los faratos están completamente formadas, pero no se separan completamente de la caja de la pupa. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Disección por hemisección de IFM de pupa (>48 h APF). (A-H) Extracción de una pupa del caso de pupa. Fije las pupas a una tira de cinta adhesiva doble (A, B). Abra la cresta anterior (C) y retire el opérculo (D) con un par de fórceps Dumont # 5 (azul, la flecha denota la dirección del movimiento, el punto está estacionario). Use fórceps para abrir (E) y pelar (F) el estuche de pupa en tiras (G). Las tiras de la caja de pupa se adhieren a la cinta adhesiva doble. Después de exponer el abdomen, levante la pupa del estuche (H). (I) Esquema que ilustra el proceso de disección de una pupa fuera del caso de la pupa. Los paneles de figuras correspondientes a cada paso del esquema están etiquetados (abajo). La línea de puntos roja marca donde se pueden insertar las pinzas sin dañar la pupa para abrir la caja de la pupa. (J-L) Después de sacar la pupa del estuche (J) y transferirla a un portaobjetos de microscopio en una gota de 1x PBS (K), use unas tijeras para extirpar el abdomen (L). (M) Deseche el abdomen y transfiera el tórax al fijador. (N) Después de la fijación, transfiera los tóraces de pupa a un portaobjetos en una gota de 1x PBS-T. Oriente la pupa dorsal hacia arriba y estabilice con un fórceps. (O-P) Use una cuchilla de criostato (O) para cortar una hemisección de pupa (P). La colocación del corte es la misma que la de la Figura 1 M-N. Barras de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Disección a libro abierto de IFM de pupa (<48 h APF). (A) Después de retirar la pupa de la caja de pupa como se muestra en la Figura 3 A-I, transfiera la pupa a 1x PBS en un plato de disección de silicona negra. (D-C) Empuje suavemente la pupa hacia la superficie del plato de silicona con una pinza (B) y sujete con alfileres ventrales hacia arriba con dos alfileres de insectos (C, D). (E) Abra la membrana basal (bm) y la cutícula de la cabeza con unas tijeras (naranja). (F, G) Corta a lo largo del lado derecho (F) e izquierdo (G). La posición del corte se diagrama en (Q). (H, I) Levante la sección ventral con una pinza (H) y retírela con unas tijeras (I). (J, K) Use un fórceps para extirpar el cerebro (J), la tráquea del tronco lateral y el intestino (K). (L-M) Utilice un chorro suave de tampón de una pipeta para eliminar los cuerpos grasos y exponer los IFM. (N) Corta el tórax en dos folíolos. (O,P) Corta los folletos y transfiérelos al fijador. (Q) Esquema que resume los pasos en una disección a libro abierto. Los paneles de figuras correspondientes a cada paso están etiquetados (abajo). Las vistas superior y lateral se proporcionan para ilustrar la ubicación de los cortes (línea roja punteada) en el lado izquierdo y derecho de la pupa. Las alas, las patas y la probóscide (etiquetadas) se utilizan para distinguir los lados dorsal y ventral de la pupa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Montaje de muestras en portaobjetos de microscopio. (A-D) Los espaciadores de cubreobjetos se utilizan para montar muestras de hemisección de tórax grueso. El glicerol (A) se usa para fijar espaciadores (cubreobjetos # 1) a un portaobjetos etiquetado (B), y las muestras se montan en un medio de montaje en el espacio entre los espaciadores (C). Las pupas tardías y los torácicos adultos requieren dos espaciadores de cubreobjetos #1 (D). Los puntos de tiempo de la pupa media requieren un solo espaciador de cubreobjetos # 1, y las disecciones tempranas de la pupa se pueden montar sin espaciador. (E-H) Las muestras de hemitórax adulto se transfieren a un medio de montaje con una pinza o un pincel (E). Los tócraces están inicialmente orientados al azar (F) y es posible que deban voltearse con una pinza (G) para que los IFM estén orientados hacia el cubreobjetos (H). (I-L) Los folletos de las disecciones a libro abierto de pupas tempranas se transfieren para montarlos con fórceps (I). Los folíolos están orientados aleatoriamente (J) y se pueden voltear con una pinza (K) para que los IFM estén orientados hacia arriba hacia el cubreobjetos (L). (M-P) Después de que las muestras estén correctamente orientadas, coloque un cubreobjetos sobre las muestras (M) y golpéelo incluso contra los espaciadores (N). Rellene alrededor de las muestras con medio de montaje (O), teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas. Selle todos los bordes abiertos del cubreobjetos y los espaciadores con esmalte de uñas (P) para evitar la evaporación del medio de montaje. (Q-R) Imágenes de muestras de tórax adulto montadas correctamente (Q, aumento de 10x) orientadas con los IFM hacia arriba hacia el cubreobjetos (R, aumento de 20x). (S) Un esquema del portaobjetos completo, con muestras orientadas IFM hacia arriba entre espaciadores y esmalte de uñas sellando todos los bordes abiertos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Las disecciones de IFM son compatibles con diferentes fijadores. (A-H) Proyección z confocal de la estructura de miofibras (A-D) o imágenes de un solo plano de la estructura de miofibrillas y sarcómeros (E-H) de control w¹¹¹⁸ IFM adulto. La disección del hemitórax es compatible con múltiples métodos de fijación, incluido el paraformaldehído (PFA) al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (A, E) o solución relajante (RS) (B, F), metanol (C, G) o solución de glioxal al 9 % (D, H). DAPI (1:1000), azul; faloidina (1:500) teñida de F-actina, gris. (I, J) Cuantificación de la longitud (I) y la anchura (J) del sarcómero a partir de E-H. El método de fijación y el tampón pueden afectar significativamente la medición de la longitud y el ancho del sarcómero. Una longitud de sarcómero de 3,040 ± 0,2935 μm con fijación de metanol fue significativamente más corta que las longitudes medidas de 3,271 ± 0,2736 μm, 3,190 ± 0,2586 μm y 3,217 ± 0,2023 μm con fijación de PFA (PBS), PFA (RS) y glioxal al 9%, respectivamente (p < 0,001). El ancho del sarcómero fue significativamente diferente entre todos los métodos de fijación probados (PFA (PBS), 1,410 ± 0,1331 μm; PFA (RS), 1,284 ± 0,2514 μm; metanol, 1,280 ± 0,1538 μm; y fijación glioxal al 9%, 1,137 ± 0,2032 μm). Los diagramas de caja se muestran con bigotes de Tukey con puntos de datos atípicos marcados como puntos negros. La significación se determinó mediante ANOVA con una prueba de Tukey post hoc (**, p < 0,01; ***, p < 0,001). (K-M) Imágenes confocales de un solo plano de un curso de tiempo de fijación de adulto w¹¹¹⁸ en PFA al 4% en fijación RS, demostrando que los tiempos de fijación de 15 (L) o 30 (M) min, en comparación con 7 min (K), dan como resultado una estructura de sarcómero bien conservada y consistente. (N,O) Proyecciones de pila Z de IFM Act88F-Gal4 adultos fijadas en PFA al 4% que demuestran artefactos de disección en miofibras. Los artefactos comunes incluyen miofibras cortadas, deshilachadas o parciales de una hoja desafilada (N) o un corte en ángulo (O). (P-R) Imágenes confocales de un solo plano de muestras adultas w¹¹¹⁸ fijadas en PFA al 4% en PBS que demuestran artefactos de disección comunes en sarcómeros y miofibrillas. Los artefactos técnicos comunes incluyen el estiramiento irregular de los sarcómeros debido al contacto con las pinzas durante el montaje (P), la extracción de los discos Z fuera de registro al estirar las miofibras durante los cortes longitudinales (Q) y las miofibrillas deshilachadas, desorganizadas o rizadas debido a la abrasión o una cuchilla desafilada (R). DAPI (1:1000), azul; faloidina (1:500) teñida de F-actina, gris. Barra de escala = 100 μm (A-D, N-O), 5 μm (E-H, K-M, P-R). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Aplicación de disecciones para investigar el fenotipo IFM de desarrollo de Smn^E33. (A-D) Estructura muscular en pupas tempranas a las 26 h APF. Imagen confocal de un solo plano de la estructura de miofibras (A, A', B, B') y la estructura de miofibrillas y sarcómeros (C, C', D, D') en control (A, A', C, C') y Smn^E33(B, B', D, D'). Tanto el control como el Smn^E33 tienen seis miofibras IFM por hemitórax y forman cables de F-actina. (E-H) Estructura muscular en pupas tardías a 72 h APF. Imagen de proyección Z de la estructura de miofibras en control (E, E') y Smn^E33 (F, F'). Los IFM en Smn^E33 están presentes según la tinción DAPI, pero carecen de una fuerte señal de F-actina. Las imágenes confocales de un solo plano revelan que los IFM de control tienen una estructura de sarcómero altamente organizada (G, G'). Por el contrario, los IFM Smn^E33 (H, H') tienen estructuras anormales de actina F en forma de estrella (flechas amarillas) y carecen de la estructura de sarcómero organizada observada en los IFM de control. (I-L) Estructura muscular adulta en control (I, I', K, K') y Smn^E33 (J, J', L, L'). La proyección Z (I, J) y las imágenes confocales de un solo plano (K, L) revelan un contenido de F-actina muy reducido y estructuras de actina anormales (flechas amarillas) en los IFM Smn^E33. DAPI (1:1000), azul; faloidina (1:500) teñida de F-actina, magenta o gris. Barra de escala = 50 μm (A, B), 10 μm (C, D, G, H, K, L), 100 μm (E, F, I, J). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expediente complementario 1: Una descripción detallada de los métodos de fijación y tinción utilizados en el texto y, en particular, para generar los datos que se muestran en la Figura 6 y la Figura 7. Se incluye información adicional sobre la determinación de diluciones de anticuerpos primarios. También se proporciona una lista de componentes de búfer y recetas utilizadas en este protocolo. Estos datos motivan el protocolo de disección y demuestran su utilidad para la microscopía confocal y el análisis de fenotipos de IFM en desarrollo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 1: Diagrama de flujo de pasos en la disección del hemitórax de IFM adultos. Resumen textual de los pasos de la Figura 1 para preparar secciones de IFM de hemitórax. Después de la disección, la fijación y la bisección del tórax, las secciones se tiñen para el análisis de microscopía. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 2: Diagrama de flujo de pasos en la disección del hemitórax de IFM de pupas. Resumen textual de los pasos de la Figura 3 para preparar secciones de hemitórax de IFM de pupas. Después de retirarlas de la caja de la pupa, las pupas se fijan, se dividen en dos y se tiñen para microscopía. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria 3: Diagrama de flujo de pasos en la disección a libro abierto de IFM de pupas tempranas. Resumen textual de los pasos que se muestran en la Figura 4 para realizar la disección a libro abierto de IFM de pupas antes de las 48 h APF. Después de la disección y la fijación, las valvas epiteliales con IFM adheridas se tiñen para microscopía. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Discussion

Este protocolo presenta un procedimiento para la disección del hemitórax de D. melanogaster adulto (Figura 1) y pupa tardía (48 h - 96 h APF) (Figura 3), así como la disección a libro abierto de IFM en puntos de tiempo tempranos de pupa (8 h - 48 h APF) (Figura 4). Este protocolo es óptimo para aplicaciones de inmunohistoquímica y microscopía de fluorescencia. El protocolo se ilustra con diagramas esquemáticos y fotografías paso a paso del procedimiento de disección. Los diagramas generales hacen que el protocolo sea accesible para los científicos nuevos en el campo de Drosophila , así como para los investigadores de pregrado y los aprendices en etapa inicial. Se incluyen ejemplos representativos de artefactos de fijación y preparación de muestras deficientes para permitir a los usuarios del protocolo distinguir los artefactos de los fenotipos de sarcómeros de buena fe .

El paso más difícil en la disección del hemitórax de IFM es la bisección del tórax (Figura 1I, J, L y Figura 3O). Este paso requiere tiempo y práctica para dominarlo. Para mayor estabilidad durante el corte, se pueden colocar toraceas individuales en cinta adhesiva doble y cortar³⁶, pero se debe tener cuidado para evitar la desecación de los IFM. También es posible cortar desde el lado ventral del tórax, con el lado dorsal orientado hacia abajo, para que los nuevos usuarios puedan probar qué enfoque es más efectivo con su configuración. Los cortes deben realizarse con cuchillas nuevas y afiladas para evitar dañar los IFM, y se debe reemplazar una cuchilla cuando se desafila. Las cuchillas de micrótomo (criostato) se utilizan para cortar limpiamente el tórax en este protocolo, en comparación con otros protocolos que emplean una aguja, fórceps o una hoja de bisturí^{24, 32, 36}. Las hojas de afeitar son otra alternativa para dividir limpiamente el tórax. La fijación también es importante antes de la bisección, ya que el tejido ligeramente fijado, aunque se conserva de manera estable, puede ser "blando" y más difícil de cortar. Los tiempos de fijación de 30-60 min equilibran la disponibilidad de antígenos y la rigidez del tejido facilitando los cortes, y pueden acortarse a 15 min con la experiencia.

Una limitación de las preparaciones de hemitórax es la penetración de anticuerpos. Los hemitócicos son muestras gruesas³², y las micrografías confocales de mejor calidad se obtienen de los 10-20 μm superiores de los IFM^{42, 58}. Una concentración de detergente demasiado baja o un tiempo de permeabilización demasiado corto pueden provocar manchas débiles e inconsistentes. La penetración de anticuerpos también se puede mejorar mediante una incubación más larga (2-3 días) en anticuerpos primarios. Un sistema de dos fotones o un objetivo con una distancia de trabajo mayor también pueden aumentar la profundidad de la imagen⁵⁹. Si el experimentador necesita obtener imágenes del diámetro total de la miofibra IFM, se debe considerar un enfoque alternativo como el micrótomo^{24, 58} o la criosección²⁷ en el plano sagital.

Un aspecto importante que no se aborda en el protocolo principal es el análisis de datos de imágenes. Para el análisis de miofibras IFM en imágenes de 10x o 20x (Figura 6A-D, Figura 7A, B, E, F, I, J), el análisis estándar incluye determinar si las miofibras están unidas y si la morfología macroscópica de la miofibra está intacta^{37, 38}. Ejemplos de parámetros que se pueden cuantificar, según el experimento, incluyen la longitud, el ancho, el número, el número adjunto o el número de miofibras rasgadas^{37, 60}. Una ventaja importante de este protocolo es la compatibilidad con la microscopía de fluorescencia y la capacidad de analizar la morfología del sarcómero y la miofibrilla con aumentos más altos de 60x o 100x (Figura 6E-H, Figura 7C, D, G, H, K, L). La morfología de Sarcómero debe analizarse en muestras libres de artefactos técnicos (Figura 6K-P). Se han definido previamente varias categorías de posibles fenotipos de miofibrillas y sarcómeros⁶⁰. Más comúnmente, la longitud y el ancho del sarcómero se miden dibujando y midiendo una línea de disco Z a disco Z en el software de procesamiento de imágenes, o alternativamente utilizando una de varias herramientas automatizadas que están disponibles gratuitamente^{18, 45, 61}. La evaluación de la morfología del sarcómero se puede mejorar mediante la inclusión de marcadores que etiquetan el disco Z o la línea M, o los filamentos gruesos o delgados^{30, 34,58}. Estos datos se pueden utilizar para describir cuantitativamente los fenotipos de miofibra, miofibrilla y sarcómero entre una muestra de control y una muestra de prueba preparada con este protocolo de disección.

Los usuarios del protocolo deben ser conscientes de que, si bien la fijación preserva la morfología de las fibras y los sarcómeros, el fijador, así como los tampones y el medio de montaje, pueden causar contracción o hinchazón del tejido y pueden influir en la medición de los parámetros morfológicos⁴⁵. Se sabe que la fijación y deshidratación del glutaraldehído necesarias para la microscopía electrónica reducen el diámetro del sarcómero⁴³, mientras que se ha demostrado que el despellejamiento y la gliceración de la fibra aumentan el diámetro del sarcómero^44,45. Este fenómeno puede ser la base de las diferencias en los parámetros de los sarcómeros en la literatura y enfatiza la importancia de incluir muestras de control y prueba en cada experimento. Los IFM de control y prueba deben procesarse simultáneamente en los mismos tampones para una comparación precisa de los parámetros cuantitativos del sarcómero.

Este protocolo detallado tiene como objetivo hacer que la disección de IFM en adultos y pupas para inmunohistoquímica y microscopía fluorescente sea más accesible para los drosófilos principiantes y avanzados. Este protocolo se puede adaptar para su uso con otros insectos, así como para otras técnicas de imagen como la criomicroscopía electrónica (crio-EM), la hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) o la transcriptómica espacial. La combinación de potentes herramientas genéticas de Drosophila con microscopía de fluorescencia ofrece oportunidades únicas para investigar los principios conservados de la miogénesis y la función muscular. Dado que los IFM también son susceptibles de enfoques moleculares y bioquímicos^{26, 27}, los estudios futuros que vinculan los fenotipos moleculares con la morfología, la biología celular y la función muscular proporcionarán una comprensión más profunda de la miogénesis y la etiología de los trastornos musculares.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platos de cultivo de tejidos de 60 mm	Fisher Scientific	FB012921	60 mm, poliestireno
Ácido acético, glacial (Certificado ACS)	Fisher Scientific	A38S-212
Trifosfato de adenosina (ATP)	Millipore Sigma	A1852
Papel de aluminio, de alta resistencia	Amazon		12 pulgadas. x 1000 pies.
Platos de disección de silicio negro: polvo de carbón activado	Millipore Sigma	C9157	También disponible en la mayoría de las farmacias
Platos de disección de silicona negra: Sylgard 184	Millipore Sigma	761036	Para hacer platos de silicona para diseccionar, combina los componentes de Sylgard en una bolsa ziploc y mezcla bien. Añade carbón activado en polvo (~200 mg) a Sylgard (~50 g), mezcla bien, corta la esquina de la bolsa, llena platos de cultivo de 60 mm, elimina las burbujas con la punta de una pipeta y cura durante la noche.
Bandeja de diapositivas de cartón, Research Products International Corp	Fisher Scientific	50-136-7558
Microscopio confocal, confocal invertida Nikon AXR	Nikon		www.microscope.healthcare.nikon.com/
Microscopio confocal, Zeiss LSM 780 confocal invertido	Zeiss		www.zeiss.com
Cámara de Cría de Insectos Darwin (Incubadora)	Fisher Scientific/Cámaras de Darwin	IN034	Incubadora con control de luz, temperatura y humedad
plato de disección (vidrio negro)	Mikroskop Technik Diethelm	398011	Lymphbecken (cuencos para teñir/tanques linfáticos), vidrio negro, 4x4 cm, con cubierta de cristal transparente
Pinzas Dumont #3	Herramientas Científicas Fines	11231-30	Pinza Dumoxel con punta recta de 12 cm con punta de 0,17 x 0,1 mm;
Pinzas Dumont #5	Herramientas Científicas Fines	11252-20	Pinzas de punta recta Inox de 11 cm, grado biológico con punta de 0,05 x 0,02 mm y nbsp;
EGTA (Ácido Egtázico)	Millipore Sigma	324626
Etanol, absoluto (200 grados)	Fisher Scientific	BP28184	Grado de Biología Molecular
Vidrio de cubierta premium Fisherbrand (18 x 18 mm), cubiertas	Fisher Scientific	12548A	Vidrio cuadrado, grosor #1 (0,13 - 0,16 mm)
Vidrio de cubierta premium Fisherbrand (22 x 22 mm), cubiertas	Fisher Scientific	12548B	Vidrio cuadrado, grosor #1 (0,13 - 0,16 mm)
Placas de cultivo celular de fondo plano (24 pozos)	Fisher Scientific	7200740
cámara de microscopio fluorescente disecante, cámara Infinity8	Teledyne (Visual Dynamix)		6 megapíxeles, con poca luz, monocromático
Fly: Smn[E33]			Stock de mosca; donación de Gregorio Matera
Volar: w[1118]	Centro de Ganado de Bloomington	RRID:BDSC_3605	Material de mosca
glicerol	Fisher Scientific	BP229-1	Grado de Biología Molecular
Solución glioxal (40 % en peso en H2O)	Millipore Sigma	128465	Esta es una solución estándar al 40%
Software de procesamiento de imágenes, Affinity Designer 2	Afinidad		https://affinity.serif.com/en-us/
Software de procesamiento de imágenes, Image J (Fiyi)	ImageJ2		https://imagej.net/software/fiji/
Pins para insectos	Herramientas Científicas Fines	26002-10	Acero inoxidable, 0,1 mm de diámetro (pinos Minutien)
Cloruro de Magnesio (MgCl2)	Fisher Scientific	AA12315A1
Metanol (HPLC)	Fisher Chemical (Fisher Scientific)	A452-4	¿Relajarse a -20? Antes de su uso
Portaobjetos de microscopio, esmerilado	Fisher Scientific	12-550-400	Área de escritura, sin carga, 75 mm x 25 mm x 1 mm
Láminas de microscopio, vidrio liso	Fisher Scientific	12-544-4	Prelimpiada, 75 mm x 25 mm
Láminas microtome MX35 Ultra	epredia (Fisher Scientific)	3053835	Perfil bajo, 34 º ángulo de corte; Las cuchillas C35 feather de 80 mm funcionan bien
Esmalte de uñas, transparente (Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish)	Amazon		0,4 fl. oz.
Suero normal de cabra	Millipore Sigma	S26-LITROS
Nutator (Mini balancino nutante, benchmark)	Midwest Scientific	H3D1020	24 rpm, fija; 8 x 6 pulgadas. Plataforma con esterilla con hoyuelos
Pincel (Ronda nº 0)	Amazon		Pincel redondo nº 0 o similar de cualquier material artístico
Paraformaldehído (PFA)	Millipore Sigma	158127-500G
Solución salina tamponada con fosfato (PBS): KCl	Millipore Sigma	529552-250GM	Preparar PBS según el Protocolo de Cold Spring Harb; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Solución salina tamponada con fosfato (PBS): KH2PO4	Millipore Sigma	P0662-500G	Preparar PBS según el Protocolo de Cold Spring Harb; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Solución salina tamponada con fosfato (PBS): Na2HPO4	Millipore Sigma	S9763-500G	Preparar PBS según el Protocolo de Cold Spring Harb; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Solución salina tamponada con fosfato (PBS): NaCl	Fisher Chemical (Fisher Scientific)	S271-1	Preparar PBS según el Protocolo de Cold Spring Harb; 2006; doi:10.1101/pdb.rec8247
Puntas de pipeta PR1MA (10 y micro; L)	Midwest Scientific	PR10XLRK-NS	Universal 10 y micro; Puntas de la pipeta en L
Puntas de pipeta PR1MA (1000 y micro; L)	Midwest Scientific	PR-1000RK-FL	Universal 1000 & micro; Puntas de la pipeta en L
Puntas de pipeta PR1MA (200 y micro; L)	Midwest Scientific	PR-200RK-NS	Universal 200 y micro; Puntas de la pipeta en L
Rodamina-Faloidina	Invitrogen, Sondas Moleculares	R415
Cinta adhesiva escocesa de doble cara	Scotch/3M (Grapas)	649280	Ambos lados recubiertos con adhesivo, 0,5" x 7 yardas, disponibles en la mayoría de los manipuladores de material de oficina
Dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (NaH2PO4)	Fisher Scientific	AAA1131636
Software: GraphPad Prism	GraphPad Prism		www.graphpad.com
Software: Infinity Analysis 7	Teledyne (Visual Dynamix)		https://www.teledynevisionsolutions.com/products/infinity-analyze/
Software: Microscoft Excel	Microsoft		https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Limpiaparabrisas delicados de tarea Kimtech Science Kimwipes, 1 capa	Fisher Scientific	06-666	Toallitas de pañuelo estándar
Pipeta de transferencia	Fisher Scientific	13-711-9AMMD	Pipeta de plástico
Trition X-100	Millipore Sigma	T9284-100ML
Tijeras de muelle Vannas	Herramientas Científicas Fines	15000-00	Filo de corte de 3 mm, diámetro de punta 0,05 mm, longitud 8 cm
Vectashield con DAPI	Laboratorios Vector	H-2000
Vectashield sin DAPI	Laboratorios Vector	H-1900
Papel Whatman	Millipore Sigma	WHA1004070	Círculos de papel de filtro, grado 4, 70 mm
Microscopio estéreo fluorescente de disección Z10	Visual Dynamix (Midwest Scientific)		http://www.visualdynamix.net/
Microscopio ergonómico de disección con zoom estéreo Z850	Visual Dynamix (Midwest Scientific)		http://www.visualdynamix.net/