Las reconstrucciones vasculares en los receptores, incluida la vena cava inferior suprahepática (SHIVC), la vena porta y la vena cava inferior infrahepática (IHIVC), son los procedimientos clave para el éxito del trasplante hepático ortotópico en ratones. En este documento proporcionamos técnicas de sutura y consejos para la reconstrucción de SHIVC e IHIVC en el modelo de trasplante de hígado de ratón.
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Artículo de método
Técnicas de sutura para la reconstrucción vascular en el trasplante hepático ortotópico de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La investigación traslacional utilizando modelos animales es esencial para abordar los problemas clínicos en los trasplantes de órganos. Aunque el trasplante hepático ortotópico (LT) en ratones es una herramienta útil para investigar los mecanismos de regeneración hepática, lesión por isquemia-reperfusión y respuestas inmunes después de LT, los desafíos técnicos en este procedimiento restringen su viabilidad. Los aspectos clave para el éxito de la LT ortotópica en ratones son la reconstrucción vascular en los receptores, incluida la vena cava inferior suprahepática (SHIVC), la vena porta (PV) y la vena cava inferior infrahepática (IHIVC). Además de las dificultades técnicas en la reconstrucción de estos vasos, la limitación de tiempo de la fase anhepática a 20 minutos hace que este procedimiento sea más desafiante. Aunque se puede utilizar una técnica de manguito para la reconstrucción PV, se requiere una técnica de sutura segura y rápida para reconstruir el SHIVC durante la fase anhepática. Para la reconstrucción IHIVC, si bien las técnicas de manguito y sutura son aplicables, la técnica de sutura conduce a un tiempo de operación más corto en la cirugía del donante y la preparación de la mesa posterior y puede mantener una luz vascular más grande que la técnica del manguito. En este documento proporcionamos pautas para la reconstrucción de SHIVC e IHIVC utilizando una técnica de sutura para facilitar la LT ortotópica de ratón.
Introducción
Con los avances en las técnicas quirúrgicas, los medicamentos inmunosupresores y la medicina de cuidados intensivos, el trasplante de órganos se ha establecido como una terapia estándar para las enfermedades orgánicas en etapa terminal. El trasplante hepático (TH) es actualmente el único tratamiento curativo para la enfermedad hepática terminal y ciertas neoplasias hepáticas. La investigación traslacional utilizando modelos animales es esencial para abordar los problemas clínicos en el LT. Como hay varios animales modificados genéticamente disponibles en modelos de ratón, la LT ortotópica de ratón es una herramienta importante para explorar conocimientos mecanicistas sobre la regeneración hepática, la lesión por isquemia-reperfusión y las respuestas inmunitarias después de la LT1. Sin embargo, como los desafíos técnicos de este procedimiento restringen su viabilidad, los grupos de investigación que trabajan en este modelo son limitados 2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La LT ortotópica de ratón fue descrita por primera vez por Qian et al. en 19912. El procedimiento quirúrgico, desarrollado mediante la aplicación de técnicas ortotópicas de TH en ratas, consta de tres etapas: cirugía del donante, preparación del injerto hepático en la mesa posterior y operación del receptor6. Las partes técnicamente desafiantes del LT de ratón son la reconstrucción biliar y vascular en los receptores, incluida la vena cava inferior suprahepática (SHIVC), la vena porta (PV) y la vena cava inferior infrahepática (IHIVC). Además de las técnicas quirúrgicas, la fase anhepática desde el pinzamiento hasta la liberación del flujo PV debe estar dentro de los 20 minutos para el éxito de la LT ortotópica de ratón 2,6,11. Además, en nuestra experiencia, el tiempo total de reperfusión desde el pinzamiento de PV hasta la liberación de IHIVC debe estar dentro de los 30 minutos para lograr una supervivencia a largo plazo en el LT de ratón. Esto es consistente con el informe anterior para LT en ratas que describe el tiempo preferible de estado hemodinámico sistémico inestable en aproximadamente 30 min12. Por lo tanto, las dificultades técnicas y las limitaciones de tiempo en el ratón LT hacen que este procedimiento sea más desafiante.
Aunque la técnica del manguito se puede utilizar para la reconstrucción PV, se requiere una técnica de sutura para reconstruir el SHIVC durante la fase anhepática. Por lo tanto, una técnica de sutura segura y rápida es esencial para la anastomosis SHIVC. Si bien las técnicas de manguito y sutura son aplicables para la reconstrucción de IHIVC, la mayoría de los estudios anteriores han empleado una técnica de manguito 5,6,7,11,13. Sin embargo, el uso de una técnica de manguito en la reconstrucción de IHIVC conduce a un mayor tiempo de operación en las operaciones de donantes y de mesa trasera. Además, la inserción de un manguito puede ser más difícil que la sutura para los principiantes debido al margen corto de la vena cava inferior (VCI) receptora13.
En este documento proporcionamos pautas para una reconstrucción exitosa de SHIVC e IHIVC utilizando una técnica de sutura en LT ortotópico de ratón.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Universidad de Kioto y realizados de acuerdo con las Pautas de Protección Animal de la Universidad de Kioto. Las cirugías de ratón se realizaron bajo anestesia general utilizando inhalación de isoflurano. El vaporizador se ajustó al 3% de isoflurano con 1 L / min de oxígeno para inducir la anestesia. Después de la laparotomía, el isoflurano se redujo al 1% para mantener la anestesia. Las herramientas microquirúrgicas utilizadas en este protocolo, incluidas las utilizadas en nuestro protocolo de reconstrucción vascular13 publicado anteriormente, se enumeran en la Tabla de Materiales. Se requirió un microscopio para realizar el ortotópico de ratón LT13. Se utilizó una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del ratón13.
1. Animales
- Use un mouse que pese 25-30 g.
NOTA: Aunque se pueden usar ratones que pesen 20-35 g, aproximadamente 25 g son adecuados tanto para donantes como para receptores. Dado que la edad y la esteatosis hepática afectan los resultados de LT, se deben seleccionar ratones apropiados para cada propósito de los experimentos.
2. Disección de la IHIVC en el hígado del donante
- Aísle el IHIVC del tejido circundante. Selle las venas lumbares con un electrocauterio si es necesario.
- Retire la grasa de IHIVC para exponer la pared del vaso.
- Diseccionar el IHIVC por encima de la arteria y vena renal derecha (Figura 1).
NOTA: Si se utiliza la técnica de sutura para la reconstrucción IHIVC, no es necesaria la disección de la vena renal derecha en el sitio donante. La cirugía de donantes suele durar menos de 30 minutos cuando se aplica la técnica de sutura para la reconstrucción IHIVC.
3. Disección del SHIVC en el hígado del donante
- Después de la perfusión de la solución de almacenamiento de la PV, corte las paredes anterior y posterior del SHIVC (Figura 1).
NOTA: El aislamiento de la pared posterior SHIVC del crus del diafragma es crucial para obtener un margen suficiente para la reconstrucción.
4. Preparación de la mesa trasera del injerto hepático
- Coloque un brazalete en el PV, como se describió anteriormente13.
- Coloque un clip de sujeción en el IHIVC.
- Dé la vuelta al hígado y exponga el muñón de SHIVC.
- Coloque una sutura de estancia con nailon 10-0 en ambos bordes del SHIVC y sujételos con pinzas para bulldog.
NOTA: La preparación de la mesa trasera toma aproximadamente 10 minutos sin un accesorio de manguito a IHIVC.
5. Reconstrucción del SHIVC en el receptor
- Rodea el SHIVC con seda 4-0 para retraer el hígado hacia abajo.
- Reducir la concentración de isoflurano al 0,3-0,5% antes de la fase anhepática.
- Pinzar el IHIVC por encima de la vena renal derecha con una microserrefina.
- Sujete el PV con una pinza Pean13.
- Sujete el SHIVC con el diafragma con una pinza bulldog mientras retrae el hígado hacia abajo.
- Corte la pared anterior del SHIVC y luego corte la pared posterior (Figura 1).
NOTA: El aislamiento de la pared posterior del SHIVC del crus del diafragma en el receptor y los donantes es crucial para obtener un margen suficiente para la reconstrucción. - Después de diseccionar PV e IHIVC cerca del hígado del receptor, retire el hígado del receptor (Figura 1).
- Coloque el injerto de hígado preparado en la cavidad abdominal del receptor y coloque el hígado de manera adecuada.
- Coloque y lime una sutura de permanencia en el extremo derecho del SHIVC y sujétela con una pinza bulldog para tirar de la sutura hacia el lado ventral del receptor (Figura 2A).
NOTA: El lado derecho del SHIVC se encuentra en lo profundo de la cavidad abdominal. Saque el lado derecho del SHIVC para que la pared posterior quede colocada al frente. - Coloque y ligue una sutura de permanencia en el extremo izquierdo del SHIVC.
- Iniciar sutura continua con un método intraluminal en la pared posterior del SHIVC desde el lado izquierdo (Figura 2A).
- Al llegar al extremo derecho de la pared posterior del SHIVC, gire la mesa de operaciones 90° en sentido contrario a las agujas del reloj.
NOTA: Gire la mesa de operaciones 90° en el sentido de las agujas del reloj para los cirujanos zurdos. Alternativamente, los cirujanos pueden suturar la pared anterior desde el frente hacia la parte posterior sin rotación. - Continúe la sutura con una sutura por encima y por encima en la pared anterior del SHIVC desde el lado derecho (Figura 2A).
NOTA: Se requieren aproximadamente de seis a ocho puntos para la pared posterior y de ocho a diez puntos para la pared anterior. La sutura en el extremo izquierdo de la pared anterior es importante para prevenir el sangrado. - Después de enjuagar el aire en el SHIVC, lime la sutura continua con la sutura de estancia en el lado izquierdo del SHIVC.
- Gire la mesa de operaciones 90° en el sentido de las agujas del reloj para restaurar la posición del receptor a la posición original.
- Después de la reconstrucción y reperfusión de la PV, despinzar el SHIVC.
NOTA: La reconstrucción SHIVC tarda entre 10 y 15 minutos. Como el tiempo de sujeción de PV puede afectar los resultados de LT, el tiempo anhepático (desde el pinzamiento de PV hasta el desbloqueo de PV) debe fijarse durante un máximo de 20 minutos según la habilidad del cirujano. Después de la reperfusión PV, el isoflurano se restablece al 1% para mantener la anestesia.
6. Reconstrucción del IHIVC en el receptor
- Coloque y ligue las suturas de estancia con nailon 10-0 en ambos extremos del IHIVC.
- Sostenga las suturas de la estancia con pinzas de bulldog para tirar hacia ambos lados, de modo que el muñón IHIVC se vuelva ancho y recto.
- Iniciar la sutura continua con un método intraluminal en el lado izquierdo de la pared posterior (Figura 2B).
- Después de llegar al lado derecho, continúe suturando una y otra vez en la pared anterior desde el lado derecho del receptor (Figura 2B).
NOTA: No se requiere rotación de la mesa de operaciones para la reconstrucción de IHIVC. Aproximadamente de seis a ocho puntos de sutura para cada pared posterior y anterior son suficientes. - Enjuague el aire en el IHIVC.
- Suelte las pinzas IHIVC del lado del injerto y luego del lado receptor.
NOTA: No es necesaria la ligadura de la sutura continua con la sutura de estancia en el lado izquierdo del IHIVC. La reconstrucción de IHIVC tarda entre 8 y 10 minutos. El tiempo total de reperfusión desde la sujeción fotovoltaica hasta la liberación de IHIVC debe estar dentro de los 30 min.
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Resultados
Un receptor de ratón se recuperó de la anestesia en 30 minutos cuando se realizó una reconstrucción vascular exitosa utilizando un injerto hepático normal sin un tiempo isquémico frío prolongado. Una tasa de éxito del >90% puede considerarse experta para este procedimiento. Examinamos las curvas de aprendizaje en un cirujano para las tasas de recuperación post-LT (recuperación de la anestesia), el tiempo anhepático (desde el pinzamiento hasta la liberación del flujo PV) y el tiempo total de reperfusión (desde el pinza...
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Discusión
Este artículo documentó las técnicas detalladas para la reconstrucción del SHIVC y el IHIVC con una técnica de sutura en el TH ortotópico de ratón. La reconstrucción vascular, especialmente la anastomosis del SHIVC, que requiere una técnica de sutura durante la fase anhepática, es una habilidad crucial para el éxito del TH en ratón. Además de la técnica de sutura segura y protegida, es necesaria una sutura rápida para mantener la fase anhepática dentro de los 20 minutos para obtener resu...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (Número de subvención: 24K19356).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10-0 Micro sutura | AROScorporación de instrumentos quirúrgicos | T4A10N07 | |
| Catéter intravenoso de 16 G | TERUMO | SR-FF2032 | Manguito IHIVC |
| Catéter intravenoso de 20 G | TERUMO | SR-FF1651 | Manguito fotovoltaico |
| 8-0 seda trenzada | Natsume Seisakusho | CR9-80B2 | 8-0 seda |
| Solución de almacenamiento en frío Belzer UW | Astellas | Líquido de preservación de órganos | |
| Pinza Bulldog | B BRAUN | FB329R | Pinza Bulldog |
| Pinzas Bulldog | Natsume Seisakusho | C-42-S-2 | Para sujeción SHIVC |
| Ratones C57BL/6 | Servicio Bio Oriental | ||
| Fórceps | Herramientas de ciencia fina | 11231-30 | |
| Solución de inhalación de isoflurano | Viatris | Anestésico | |
| Puntas micro romas 0,1 mm x 0,06 mm | Herramientas de ciencia fina | 11253-20 | Micropinzas rectas |
| Micro tijeras | Instrumentos médicos Muranaka | 451-609-13 | |
| Micro serrefina | Herramientas de ciencia fina | 18055-03 | Para sujeción IHIVC |
| Micro serrefina | Herramientas de ciencia fina | 18055-04 | Para sujeción fotovoltaica |
| Aplicador de abrazadera Micro Serrefine con bloqueo | Herramientas de ciencia fina | 18056-14 | Aplicador de clip para vasos |
| Micro Serrefines | Herramientas de ciencia fina | 18055-4 | Clip de recipiente |
| Micro sutura feepos | Aesculap | FD281R | |
| Aplicador de pinza Micro-serrefine | Herramientas de ciencia fina | 18056-14 | |
| Portaagujas | Aesculap | FD231R | |
| No.11 Cuchillas de repuesto | Maquinilla de afeitar de seguridad FEATHER | 11 | Cuchillas |
| Tijera oftálmica, mango redondo | B BRAUN | FD103R | Microtijera |
| Contenedor de plástico de forma rectangular | Daiso | 10 cm de largo, 15 cm de ancho y 6 cm de alto | |
| Consejos SuperGrip | Herramientas de ciencia fina | 00649-11 | Micropinzas curvas |
| SZX7 | Olimpo | SZX7 | Microscopio |
| Tijeras Vannas | Instrumentos de precisión del mundo | 501232 | |
| Clip vascular | Corporación médica BEAR | TKF-1-30 | Para pinzamiento IHIVC en el injerto hepático |
Referencias
- Yokota, S., Yoshida, O., Ono, Y., Geller, D. A., Thomson, A. W. Liver transplantation in the mouse: Insights into liver immunobiology, tissue injury, and allograft tolerance. Liver Transpl. 22 (4), 536-546 (2016).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Tian, Y., Rudiger, H. A., Jochum, W., Clavien, P. A. Comparison of arterialized and nonarterialized orthotopic liver transplantation in mice: Prowess or relevant model. Transplantation. 74 (9), 1242-1246 (2002).
- Steger, U., Sawitzki, B., Gassel, A. M., Gassel, H. J., Wood, K. J. Impact of hepatic rearterialization on reperfusion injury and outcome after mouse liver transplantation. Transplantation. 76 (2), 327-332 (2003).
- Klein, I., Gassel, H. J., Thiede, A., Crispe, I. N., Steger, U. A microsurgical approach to hepatic and extrahepatic antigen presentation and its effects on the migration pattern of activated CD8(+) T cells. Microsurgery. 27 (4), 289-294 (2007).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nat Protoc. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Li, T., Hu, Z., Wang, L., Lv, G. Y. Details determining the success in establishing a mouse orthotopic liver transplantation model. World J Gastroenterol. 26 (27), 3889-3898 (2020).
- Kageyama, S., et al. Ischemia-reperfusion injury in allogeneic liver transplantation: A role of CD4 T cells in early allograft injury. Transplantation. 105 (9), 1989-1997 (2021).
- Kojima, H., et al. T cell CEACAM1-TIM-3 crosstalk alleviates liver transplant injury in mice and humans. Gastroenterology. 165 (5), 1233-1248.e9 (2023).
- Tanaka, K., et al. Recipient toll-like receptor 4 determines the outcome of ischemia-reperfusion injury in steatotic liver transplantation in mice. Am J Transplant. 25 (6), 1168-1179 (2025).
- Chen, J., et al. A review of various techniques of mouse liver transplantation. Transplant Proc. 45 (6), 2517-2521 (2013).
- Hori, T., et al. Comprehensive and innovative techniques for liver transplantation in rats: A surgical guide. World J Gastroenterol. 16 (25), 3120-3132 (2010).
- Tanaka, K., et al. Vascular reconstruction with the cuff technique in mouse orthotopic liver transplantation. J Vis Exp. (202), e66215(2023).
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