La detección automatizada del espacio articular mejora la precisión de la segmentación ósea

Summary

El desarrollo de un flujo de trabajo automatizado de detección de espacio articular permitió la segmentación de alto rendimiento de huesos distintos de la pata trasera murina con una precisión del >98% en animales salvajes. Se logró una aplicación flexible a las patas delanteras y patas con artritis inflamatoria-erosiva, pero con un rendimiento obsoleto que justifica una mayor optimización en futuros estudios utilizando datos públicos.

Abstract

La descripción cuantitativa de estructuras anatómicas complejas sigue siendo un reto debido a la experiencia necesaria para la segmentación manual, el trabajo y la variabilidad entre observadores. Para superar esto, la detección automatizada de puntos de referencia específicos puede realizarse mediante técnicas de análisis digital de imágenes, incluyendo modelos de aprendizaje profundo (DL). Para ello, realizamos un análisis automatizado supervisado de conjuntos de datos de microtomografía computarizada (micro-CT) de las patas traseras y delanteras murinas. Avanzando más allá de los algoritmos de cuenca semiautomatizados (SA) basados en marcadores previamente publicados, añadimos mejora estructural, votación tensorial y dilatación de salida para identificar espacios articulares. La segmentación se mejoró utilizando un modelo de predicción de espacio conjunto DL (arquitectura 3D U-Net, backbone ResNet-18) usando etiquetas de tipo salvaje (WT) como verdad de base. La predicción se extendió a las patas traseras y delanteras de ratones transgénicos con WT y factor de necrosis tumoral (TNF-Tg) con artritis inflamatoria-erosiva de ambos sexos a lo largo de la edad. La precisión de la segmentación mejoró drásticamente usando la metodología DL. La precisión disminuyó con el aumento de la gravedad y edad de la enfermedad en ratones TNF-Tg. Las pruebas posteriores en las patas delanteras también mostraron una reducción progresiva de la precisión con el aumento de la severidad artrítica. En conjunto, este modelo automatizado supervisado supera a los enfoques recientes de SA en articulaciones sanas para mejorar la investigación de la anatomía ósea compleja. Aunque la aplicación flexible a conjuntos de datos novedosos y modificados por enfermedad demuestra un rendimiento obsoleto, su utilización puede, sin embargo, catalizar el desarrollo de modelos segmentados específicos para estructura.

Introduction

El análisis de imágenes de alta calidad no solo mejora los esfuerzos de investigación, sino que también tiene el potencial de ayudar a los radiólogos clínicos en su búsqueda de detectar y cuantificar cambios patológicos, una tarea fundamental para la atención al paciente. El análisis de imágenes es una secuencia detallada de procedimientos, que incluye la extracción de características, la traducción de una imagen genérica en etiquetas significativas y la derivación de métricas^{cuantitativas 1}. Gran parte de este proceso está impulsado por conocimientos previos, como estructuras de umbral basadas en densidad o color, y luego aplicar algoritmos de procesamiento de imágenes aguas abajo (es decir, dilatación, erosión, suavizado, separación) para lograr la segmentación deseada. Una vez optimizadas, las imágenes segmentadas pueden proporcionar entradas para aprendizaje automático^{supervisado 2}, incluyendo aprendizaje profundo (DL) que codifica y decodifica características complejas usando redes neuronales,2,3 lo que resulta en una mayor precisión y rendimiento de segmentación de imágenes.

De hecho, la implementación de diversas redes neuronales convolucionales 3D (CNNs) ha proporcionado avances críticos en algoritmos automatizados de segmentación ósea para el análisis de imágenes esqueléticas, donde algunos modelos superan a la segmentación^{humana 4}. Aunque las CNN de segmentación 3D funcionan mediante arquitecturas distintas (es decir, AlexNet, ResNet, UNet), sus salidas son fundamentalmente las mismas, una máscara de imagen que indica el volumen positivo del hueso desde el fondo. Estos modelos de aprendizaje profundo en análisis de imágenes musculoesqueléticas han estado en rápido desarrollo, y el campo ha pasado rápidamente de resolver problemas simples de detección de fracturas^{2D 5} a problemas complejos de múltiples^{articulaciones 6} con la capacidad de manejar ruido artactualmente o características anómalas en conjuntos de datos. Por ejemplo, Woo et al observaron que anomalías estructurales (es decir, lesiones de médula ósea, quistes óseos) en la resonancia magnética estaban degradando sus predicciones de segmentación para el cartílago articular en las articulaciones de la rodilla. Así, desarrollaron un modelo de segmentación consciente de anomalías para identificar primero estructuras anómalas no relacionadas, lo que mejoró drásticamente la segmentación del hueso y^{el cartílago 7}. He et al entrenaron 14 modelos separados, cada uno con un ROI de articulaciones clave de la mano, para estimar la edad esquelética y luego integraron sus resultados para mejorar las predicciones a partir de rayos X de mano, en lugar de usar toda la estructura^{de la mano 8}. De manera similar, incluir contexto en los modelos, como características de segmentación regional y relaciones anatómicas globales, ha demostrado mejorar las predicciones. El uso de CNN multirregión para proporcionar contexto sobre las características de segmentación esperadas también mejora la evaluación de la madurez esquelética en radiografías manuales al restringir el problema de clasificación a ubicaciones anatómicamente^{apropiadas 9}. Avances adicionales incluyen SVTNet con segmentación ósea basada en CNN, seguido de un procesamiento adicional mediante modelos de transformadores de visión para capturar información global sobre la relación espacial entre regiones segmentadas de interés y así estimar resultados cuantitativos como la edad^{ósea de 10} años.

Como demuestran estos enfoques de segmentación, la investigación de la artritis se centra en articular superficies entre dos o más huesos, donde los métodos de separación ósea son fundamentales para la evaluación exitosa de procesos patológicos diferenciales en articulaciones complejas. Los avances en los algoritmos de procesamiento de imágenes han demostrado una utilidad notable para aumentar el rendimiento analítico de huesos carpianos o tarsales muy^{adyacentes 11,12}. Sin embargo, la adopción limitada debido a imprecisiones que requieren intervención del usuario y dificultades en la traducción a estructuras distintas pone de manifiesto la necesidad de implementar flujos de trabajo optimizados. Estos procesos de varios pasos pueden beneficiarse enormemente de herramientas discretas para la mejora de imagen (es decir, detección de bordes^{óseos 13}). Más allá de las operaciones estrictamente morfológicas, otros estudios han implementado técnicas basadas en registro aprovechando la fiabilidad y consistencia típicas en anatomía para la identificación^{de estructuras 14,15,16,17}. La alternativa de entradas manuales para generar etiquetas de verdad en el terreno es costosa y tediosa, pero puede ser igualmente exitosa, donde su utilización puede ser esencial en huesos complicados y estrechamente entrelazados con límites menos discretos (es decir, el^{cráneo 18}). De manera similar, enfoques de imagen alternativos con variabilidad multicolor y de matiz incluso dentro de una estructura discreta, como la resonancia magnética (MRI 19,20,21) o la histología^{tisular 22}, también presentan complejidad que puede beneficiarse de una segmentación manual inicial para guiar procesos automatizados. En conjunto, estos métodos pueden ofrecer beneficios adicionales al impulsar una mayor automatización, donde los resultados sirven como conjuntos de datos de entrenamiento para implementar enfoques DL. Los beneficios de la automatización de segmentación son numerosos, pero especialmente estos métodos permiten métricas cuantitativas detalladas y espacialmente relevantes, incluyendo cambios de volumen erosivo regional/específico^{de hueso} 23,24,25,26, así como la identificación de áreas con alta susceptibilidad al ^{daño 27}.

Aquí, nos basamos en los métodos establecidos de segmentación semi-automatizada (SA) de la pata posterior^{murina 12} con mejoras en los algoritmos de procesamiento de imágenes combinadas con segmentaciones de huesos de la verdad terrestre²⁸ para entrenar modelos DL para la detección del espacio articular. Esta novedosa estrategia analítica demostró una precisión significativamente mejorada en la segmentación ósea individual de las patas traseras, lo que redujo los esfuerzos manuales para corregir errores de^{segmentación 12} y acelerar el procesamiento de métricas cuantitativas posteriores. También demostramos el potencial para la implementación de estos avances técnicos en estructuras novedosas, incluyendo patas delanteras y traseras con artritis erosiva severa. Como la segmentación manual requiere mucho tiempo y altos niveles de experiencia^, estrategias similares para utilizar secuencialmente segmentación semiautomatizada y automatizada para producir filtros de entrada mejorados pueden reducir la barrera para desarrollar CNN de alta calidad para aplicaciones específicas. Los métodos asociados desarrollados en el software Amira (Archivo Suplementario 1) y los conjuntos de datos relevantes se proporcionan públicamente para apoyar la adopción y colaboración en futuros esfuerzos^{de investigación 28,29}.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a los protocolos de IACUC aprobados por el Comité Universitario de Recursos Animales del Centro Médico de la Universidad de Rochester.

Modelos animales
Los ratones fueron alojados en un vivario acreditado por AAALAC. Se utilizaron un total de 19 ratones para los experimentos descritos, incluyendo 4 machos de tipo salvaje (WT), 4 hembras de WT, 4 machos transgénicos de TNF (TNF-Tg) y 7 hembras de TNF-Tg, con evaluaciones mensuales longitudinales. Los ratones TNF-Tg (línea 3647, C57BL/6 fondo^{genético 30}) fueron obtenidos inicialmente del Dr. George Kollias con mantenimiento continuado en la Universidad de Rochester. Los ratones TNF-Tg fueron criados como heterocigotos, con ratones WT como controles de camada como hermano de hierba. La genotipificación del transgen TNF se realizó utilizando las siguientes secuencias cebadoras: TNF-Tg Forward: 5-TAC-CCC-CTC-CTT-CAG-ACA-CC-3; Reversa TNF-Tg: 5-GCC-CTT-CAT-AAT-ATC-CCC-CA-3.

Los ratones TNF-Tg desarrollan artritis inflamatoria-erosiva crónica,^{progresiva y espontánea, con} un inicio más rápido de manifestaciones articulares y extraarticulares en hembras, lo que conduce a una mortalidad temprana aproximadamente entre los 5 y 6 meses³². Así, se asignaron ratones adicionales a la cohorte de hembras TNF-Tg. Según las descripciones anteriores de esta cohorte^{de estudio, 23}, n=2 mujeres TNF-Tg murieron antes de completar el estudio, n=1 antes de los 4 meses y n=1 antes de los 5 meses. Como los ratones TNF-Tg presentan una progresión asimétrica bien establecida de la enfermedad en las patas^{traseras 33,34}, se consideró la unidad de medida de las extremidades individuales (2 patas delanteras y 2 patas traseras por animal).

Colección de imágenes Micro-CT
Se recopilaron conjuntos de datos de Micro-CT como se describió^{anteriormente 12,23}. Brevemente, los ratones se colocaron en un tubo acrílico de plástico y transparente Derlin con anestesia isoflurana al 1%-3% para imagen con micro-TC usando los siguientes parámetros: 55 kV, 145 μA, tiempo de integración de 300 ms, 2048 x 2048 píxeles, 1000 proyecciones sobre 180°, resolución vóxeles isotrópicos de 17,5 μm. Por seguridad al usar isoflurano, se utilizó un equipo de protección individual adecuado (guantes de nitrilo, bata o bata de laboratorio, gafas de seguridad), y el vaporizador de isoflurano se mantenía dentro de una campana extractora utilizando un filtro de carbón para capturar los residuos gaseosos con tubos bien sellados y mantener la continuidad del sistema de administración. El isoflurano vaporizado se utilizó para la inducción de anestesia en una cámara sellada, y luego la anestesia se mantuvo mediante flujo continuo de isoflurano hacia un cono nasal murino en la máquina micro-TC. Tanto las patas traseras como las delanteras se pegaron para estabilización durante las sesiones de imagen. Cada conjunto de datos se recopiló en aproximadamente 30-45 minutos (60-90 minutos en total) con datos de la pata trasera y la pata delantera derivados de los mismos animales y momentos temporales. Los ratones fueron evaluados a intervalos mensuales desde los 2 meses hasta los 5 meses (hembras, TNF-Tg con mortalidad temprana³²) o 8 meses (machos). Partes de los datos del hindpaw utilizados para este estudio ya se publicaron previamente (WT:^12,35; WT y TNF-Tg:²³) y están disponibles^{públicamente 28}. Los datos de la pata delantera se hicieron públicos para los fines de este^{estudio 29}.

Algoritmo de segmentación conjunta del espacio con facilitación de aprendizaje profundo
Anteriormente se desarrolló un algoritmo de procesamiento de imágenes SA de alto rendimiento para segmentar los huesos individuales del complejo pata trasera en ratones (30-31 huesos)¹², que proporcionó un marco para investigar biomarcadores individuales de la progresión de la artritis inflamatoria-erosiva utilizando el software^{Amira 23}. Este método de segmentación de SA base utilizaba un algoritmo de cuenca^{hidrográfica basado en marcadores 36} para la separación en los límites óseos. El algoritmo de cuenca hidrográfica basado en marcadores separa diferentes objetos en una imagen tratando los valores de los píxeles como topografía local basada en marcadores definidos por el usuario. Estos marcadores específicos de huesos se generaron de forma SA mediante diversos pasos de procesamiento de imagen, incluyendo black top-hat (BTH), con el fin de resaltar regiones locales con grandes cambios de densidad, como bordes óseos y articulaciones. En conjunto, este enfoque creó una versión erosionada de cada hueso individual, que luego se expandió hasta los bordes óseos mediante la aplicación de una máscara binaria de frontera. Aunque el método de cuenca mejoró respecto a la utilización previa del contorno manual, la precisión (huesos segmentados correctamente / huesos totales) fue aproximadamente del 80% por conjunto de datos debido al ruido de bajo contraste que provocaba puentes en las regiones articulares (sobreconectando huesos; 2+ huesos como un solo material) o errores de identificación de bordes (exceso de división de huesos; 1 hueso como 2+ materiales). Así, la generación de marcadores de Sudáfrica para el enfoque de cuenca requirió procedimientos manuales de corrección consistentes^{y frecuentes 12} para desarrollar un recurso de etiquetas de referencia^23,28.

El desarrollo del modelo DL para la predicción de la articulación ósea se basó en la arquitectura de una U-Net 3D con una columna vertebral ResNet-18. La función de pérdida de entrenamiento era Dice, la métrica de validación era la intersección sobre unión (IoU), el descenso en gradiente usaba optimización Adam con una tasa de aprendizaje inicial de 0,0001, y los pesos se inicializaban aleatoriamente. El modelo fue entrenado utilizando 20 conjuntos de datos WT (40 patas traseras) con distribución igual por sexo y edad (de 2 a 6 meses), cada uno dividido en 6 subvolúmenes (3 por pata trasera) de 200 x 200 x 200 vóxeles con un conjunto de validación aleatoria del 25% de subvolúmenes (30 de validación, 120 en total) para evitar el sobreajuste. Estas losetas 3D estaban posicionadas uniformemente en los tarsos, falanges distales y regiones de fondo. El tamaño del parche de entrenamiento se estableció en 96 x 96 x 96 vóxeles (Figura suplementaria 1). El modelo se entrenó durante 500 épocas, tardando aproximadamente 6 horas. Las regiones de unión de la verdad de tierra se obtenían mediante una receta automática de etiquetas de verdad de suelo, que ampliaban las interfaces de etiqueta con un tamaño de dilatación 3D de 5 tanto para grosor como para extensión.

En conjunto con la predicción de DL en el espacio articular, se implementaron varios pasos de procesamiento de imágenes para aumentar la identificación en el espacio articular y la segmentación ósea. Estas estrategias incluyeron la utilización del método BTH combinado con mejora de estructura³⁷, realce de membranas y voto^{tensorial 38} para reforzar la continuidad del espacio articular limitando los huecos de membrana. En conjunto, estos enfoques fortalecen los espacios articulares para la separación ósea y limitar la fuga de segmentación entre huesos adyacentes, lo que genera errores de sobreconexión a medida que el algoritmo de cuenca hidrográfica se propaga a través de múltiples huesos. El resultado final separa y segmenta los conjuntos de datos originales de micro-CT en etiquetas específicas para cada hueso.

A continuación se ofrece un protocolo detallado paso a paso del método de segmentación facilitada por DL.

Paso 1: Abre el software de Amira (requiere licencia personal o institucional). Paso 2: Abre la pestaña de Python, selecciona Crear un nuevo entorno Python Con el nombre del entorno: Deep-learning-Environment-2022_2. Comprobar Instalar paquetes de aprendizaje profundo. Paso 3: Reiniciar el software, abrir la pestaña de Python, seleccionar entorno de usuario entorno de aprendizaje profundo-2022_2. Paso 4: Datos abiertos - Las pilas DICOM pueden cargarse seleccionando todos los archivos DICOM individuales o abriendo archivos .am que contengan pilas DICOM integradas, si están disponibles. Paso 5: Aplicar el módulo de Predicción de Aprendizaje Profundo al objeto de datos importado con los siguientes detalles:
Datos: Objeto de datos importado
Arquitectura: .json archivo (Archivo Suplementario 2)
Pesos: archivo .hdf5 (Archivo Suplementario 3)
Mosaico: manual - optimización posible reduciendo el tamaño de los píxeles de mosaico y aumentando la superposición en mosaicos según sea posible, dependiendo del hardware computacional. El módulo fallará si los requisitos de procesamiento son insuficientes. Asegúrate de que en Edición, Preferencias, Datos grandes se maximice la asignación de memoria para el software tanto como sea posible.
Ancho, altura, profundidad de mosaico: 352 píxeles
Solapamiento en mosaico: 0 píxeles
Paso 6: Aplicar el reproductor de recetas de imagen, haz clic derecho en el Área del Proyecto Sin dirigirse a un objeto de datos específico. Aportar/evaluar lo siguiente:
Receta abierta: archivo .hxisp (Archivo Suplementario 4)
Datos: Objeto de datos importado
Articulaciones de entrada: Resultado del Paso 5 (Predicción de Aprendizaje Profundo)
Rango de intensidad del paso 3: 2500 - 20000
Paso 7: Evalúa el objeto de datos procesado resultante que contiene la segmentación final; asegúrate de ajustar Colormap a Labels256 para apreciar el total de segmentaciones individuales resultantes (por defecto solo 8 colores). Para 2D: aplicar Ortho Slice y para 3D: aplicar Volume Rendering. Detalles sobre la receta incrustada (BTH+DL+SEF+MEF_D2.hxisp) aplicados en el paso del Reproductor de Receta de Imágenes que se proporciona a continuación (Archivo Suplementario 5). Ten en cuenta que en Image Recipe Designer, los pasos individuales pueden visualizarse y exportarse según sea necesario para evaluar los pasos de optimización en conjuntos de datos concretos. En el protocolo, se destacan pasos particulares que necesitarán ajuste para cualquier aplicación única, ya que dependen de las salidas de imagen (es decir, densidad) y/o del tamaño de los objetos (es decir, huesos):
Paso 1: Aplicar filtro mediano con datos: Objeto de datos importado; Interpretación: 3D; Barrio: 26; Iteraciones: 3; Tipo: Iterativo.
Paso 2: Aplicar umbral - este paso requerirá optimización dependiendo de los conjuntos de datos y del umbral particular que apunta al objeto de interés, en este caso, el hueso con datos: Resultado del Paso 1 (Filtro Median); Rango de intensidad: 2500 - 20000.
Paso 3: Aplicar Cierre - este paso requerirá optimización dependiendo del tamaño de los espacios articulares entre huesos con Datos: Resultado del Paso 1 (Filtro Mediano); Tipo: Cubo; Interpretación: 3D; Barrio: 26; Tamaño de píxel: 3.
Paso 4: Aplicar la aritmética de la imagen con entrada A: resultado del paso 3 (cierre); Entrada B: resultado del paso 1 (filtro mediano); Canales de resultados: como la entrada A; Expresión: A-B.
Paso 5: Aplicar umbral con datos: resultado del paso 4 (Aritmética de imágenes); Rango de intensidad: 750 - 20000.
Paso 6: Aplicar aritmética de imagen con entrada A: resultado del paso 2 (umbral); Entrada B: Resultado del paso 5: (umbral); Canales de resultados: como la entrada A; Expresión: A-(B>0)
Paso 7: Aplicar el filtro de mejora de estructura con imagen de entrada: objeto de datos importado; Interpretación: 3D; Tipo tensorial: Arpillera; Desviación estándar min/max: 1 - 3 píxeles; Paso de desviación estándar: 1 píxel; Contraste: Oscuro; Tipo de estructura: Plano.
Paso 8: Aplicar umbral automático con imagen de entrada: resultado del paso 7 (filtro de mejora estructural); Tipo: Umbral Automático Alto; Interpretación: 3D; Modo: Min-max; Criterio: Factorización.
Paso 9: Aplicar el filtro de mejora de membrana con datos: Objeto de datos importado; Selección de salida: Votación por tensor de planidad; Escala de votación tensorial: 3 píxeles; Escala de densificación: 3 píxeles; Tipo: Cresta
Contraste: Oscuro; Escala: 1 píxel.
Paso 10: Aplicar umbral automático con imagen de entrada: resultado del paso 9 (filtro de mejora de membrana); Tipo: Umbral Automático Alto; Interpretación: 3D; Modo: Min-max; Criterio: Factorización.
Paso 11: Aplicar dilatación - este paso requerirá optimización dependiendo del tamaño de los espacios de articulación - con Imagen de entrada: Resultado del Paso 10 (Umbral automático); Tipo: Balón; Interpretación: 3D; Tamaño: 1 píxel; Precisión: Más rápido.
Paso 12: Aplicar aritmética de imagen con entrada A: resultado del paso 11 (dilatación); Entrada B: resultado del paso 8 (umbral automático); Entrada C: Resultado de la predicción de aprendizaje profundo; Canales de resultados: como la entrada A; Expresión: A||B||C.
Paso 13: Aplicar Eliminar pequeñas manchas con la imagen de entrada: Resultado del paso 12 (Aritmética de la imagen); Interpretación: 3D; Tamaño: 500 píxeles.
Paso 14: Aplicar aritmética de imagen con entrada A: resultado del paso 13 (eliminar pequeñas manchas); Entrada B: resultado del paso 6 (aritmética de imágenes); Canales de resultados: como la entrada A; ¡Expresión:! A*B.
Paso 15: Aplicar Eliminar pequeñas manchas con imagen de entrada: resultado del paso 14 (Aritmética de imagen); Interpretación: 3D; Tamaño: 500 píxeles.
Paso 16: Aplicar etiquetado con imagen de entrada: Resultado del paso 15 (Eliminar pequeñas manchas); Interpretación: 3D; Barrio: 26.
Paso 17: Aplicar Convertir el tipo de imagen con datos: resultado del paso 1 (filtro mediano); Tipo de salida: 16 bits sin signo; Modo de normalización: Escalado; Escalado: Escala 3, Offset 2000.
Paso 18: Aplicar la cuenca hidrográfica basada en marcadores con la máscara de datos: resultado del paso 17 (convertir el tipo de imagen); Marcadores: Resultado del Paso 16 (Etiquetado); Máscara binaria: resultado del paso 6 (aritmética de imágenes); Tipo dividido: Baja intensidad.

Pruebas y cuantificación del método de segmentación
El método de segmentación se probó mediante la generación de una receta que incorporaba la predicción conjunta DL con la receta de procesamiento de imágenes aguas abajo en un rango de intensidad de 2500 - 20000 unidades de Hounsfield. La generación de recetas permitía el procesamiento por lotes (Aplicar una receta sobre un lote de archivos) de los conjuntos de datos originales de micro-CT (formato de archivo .am como pila de imágenes guardada tras importar los archivos iniciales de .dcm en Amira). El hardware informático incluía 16 núcleos de una unidad central de procesamiento (CPU) Intel Xeon Gold 5218 a 2,30 GHz, 128 GB de código de corrección de errores de cuarta generación (DDR4) de doble velocidad de datos (DDR4), memoria RAM de acceso aleatorio (RAM) a 2666 megatransferencias (MT)/s, y 24 GB de unidad de procesamiento gráfico virtual (vGPU/VRAM) en un sistema operativo de 64 bits con Windows 10 (versión del sistema operativo: 19044.4780). Cada conjunto de datos de hindpaw (2 hindpaws) se segmentó en aproximadamente 32,7 ± 8,42 min (media ± desviación estándar) sin intervención del usuario. Esto se compara con el modelo anterior de SA, donde el tiempo de segmentación dependía de la experiencia del usuario, con usuarios novatos en 40,5 ± 9,06 minutos por conjunto de datos y usuarios experimentados en 19,3 ± 5,34 minutos por conjunto de datos (solo en conjuntos de datos WT, incluyendo corrección de errores de segmentación⁾¹². Tanto los métodos DL como SA muestran mejoras notables respecto al contorneado manual estándar de oro para segmentación en 190,6 ± 30,4 minutos por conjunto de datos realizado por un usuario experimentado (realizado mediante análisis Scanco convencional)¹². Los conjuntos de datos de las patas delanteras (2 patas delanteras) se segmentaron en aproximadamente 53,4 ± 23,6 minutos sin intervención del usuario, donde el aumento del tiempo de segmentación puede atribuirse a estructuras adicionales dentro de los conjuntos de datos de imagen originales (es decir, columna y costillas), que no están presentes en las patas traseras más distalmente aisladas e inflan el tiempo de segmentación en ausencia de pasos previos de edición de volumen.

La cuantificación de la precisión se realizó mediante inspección visual (HMK) para identificar la segmentación correcta o el tipo de error basado en la anatomía ósea esperada (Hindpaw:^12,39; Pata delantera: ⁴⁰). La precisión se calculaba en porcentaje mediante:

donde los verdaderos positivos eran huesos correctamente segmentados, los verdaderos negativos equivalían a 0 (no hay circunstancias en las que faltaran huesos, y el fondo no era relevante para la cuantificación), los falsos positivos eran huesos sobredivididos y los falsos negativos eran huesos sobreconectados. Se determinó que la precisión era una métrica cuantitativa adecuada dado el problema de una sola clase (es decir, identificar espacios articulares), y los verdaderos negativos (es decir, antecedentes) no contribuyeron en los cálculos de precisión, reduciendo así el riesgo de sobreestimar el rendimiento. El método de segmentación automatizada no incluye la denominación de huesos; los nombres de los huesos se asocian posteriormente manualmente con materiales segmentados por el usuario.

La evaluación de las patas traseras implicadas en este estudio ha confirmado la fusión fija en los tarsos del cuneiforme navicular y lateral (NAVLAT) en ratones C57BL/6⁴¹, y además ha determinado que el cuneiforme intermedio adyacente (INT) también puede estar fusionado de forma variable con la estructura NAVLAT (NAVLATINT^)12,39. Se apreció una fusión variable similar en la región carpiano de las patas delanteras, donde los huesos trapezoides (ZOID; multiangulares menores) y central (CENT) pueden presentarse como una sola estructura fusionada (CENTZOID) o subdivididos en sus huesos individuales, especialmente en las patas delanteras. Huesos carpianos adicionales investigados para la precisión de segmentación incluyeron el trapecio (ZIUM; mayor multiangular), capitado (CAP), hamato (HAM), triquetrum (TRI; triangular), pisiforme (PIS), escafoides (navicular)/lunado (SCAPHATE; fusión fija) y falciforme (FALC). Los metacarpianos de la pata delantera (MET-F; 1-5), falanges proximales (PP-F; 1-5), falanges distales (DP-F; 2-5) y sesamoides (S-F; 1-10) están numerados de lateral a medial, a diferencia de los equivalentes de la pata trasera (metatarsianos (MET-H), PP-H, DP-H y S-H), que se numeran de^{medial a lateral 12}. Junto con NAVLATINT, se evaluaron huesos tarsianos adicionales para las patas traseras, como se describió^{anteriormente 12,23}, incluyendo el calcáneo (CALC), cuboides (CUB), cuneiforme medial (MED), talus (TAL) y tibial (TIB). Obsérvese que la precisión global de la cohorte varía ligeramente al comparar la evaluación de la precisión media por conjunto de datos con un número variable de huesos debidos a fusiones anatómicas frente a la precisión calculada en función del total de huesos individuales analizados.

Análisis estadístico
El análisis estadístico, incluyendo análisis de efectos mixtos de tres o dos vías con efectos de interacción o las comparaciones múltiples de Sidak y la prueba exacta de Fisher, se realizó según corresponda en GraphPad Prism (v10.2.0; San Diego, CA, EE. UU.). Se analizaron por separado a machos (2-8 meses) y mujeres (2-5 meses), con distintos plazos de evaluación basados en la mortalidad femenina temprana^{de TNF-Tg 32}. Los tamaños de muestra de las patas traseras WT utilizadas para entrenamiento/validación y pruebas metodológicas se proporcionan en la Tabla Suplementaria 1, junto con detalles de tamaño de muestra para las patas traseras y delanteras WT y TNF-Tg probadas en la Tabla Suplementaria 2, Tabla Suplementaria 3 y Tabla Suplementaria 4. Como ciertos momentos para la prueba de pata trasera WT incorporaron una evaluación de precisión para <3 patas traseras, se informaron efectos de interacción sin comparaciones múltiples post hoc en análisis que incluyeron traseras WT. Se omitió toda o partes de la pata trasera del análisis si había errores de imagen con captura incompleta de la pata, un artefacto de movimiento considerable que hacía que los escaneos fueran ininterpretables y/o si el animal fallecía antes de una sesión programada de imagen, ya que todos los datos se recogieron in vivo.

Results

La implementación de la identificación automatizada del espacio articular mejora la precisión de segmentación ósea
Dada la heterogeneidad de la forma y arquitectura ósea en estructuras complejas como la pata trasera murina, construimos sobre nuestro algoritmo sistemático de procesamiento de imágenes¹² a través de predicciones de entrenamiento DL (azul) junto con pasos de procesamiento de imágenes para una identificación robusta de espacios articulares interóseos en conjuntos de datos micro-CT (Figura 1A-B; proceso descrito más abajo y mostrado en la Figura Suplementaria 1). La identificación de espacios entre huesos permitió una separación precisa y segmentación ósea de los huesos individuales de la pata trasera (colores separados; Figura 1C). Para el componente DL, los conjuntos de datos de entrenamiento y validación (WT) consistían en edades iguales (2-6 meses de edad, n=8 patas traseras por edad) y sexo (n=20 patas traseras por sexo). El resto de las patas traseras WT (n=44, de 2 a 8 meses de edad, excluyendo 6 meses ya que todos se usaron para entrenamiento y validación) sirvieron como conjuntos de datos de prueba para cuantificar la precisión de la segmentación ósea (Figura 1D). Había 2 machos de pata trasera WT a los 2 meses y 2 hembras de pata trasera WT a los 3 meses que se omitieran debido a errores de imagen (Tabla suplementaria 1).

Junto con la implementación en patas traseras WT, también probamos el enfoque automatizado de segmentación en patas traseras de ratones TNF-Tg (n=56 patas traseras machos, n=48 hembras patas traseras) con artritis espontánea inflamatoria-erosiva. Hubo 4 hembras de TNF-Tg en las patas traseras tanto a los 4 como a los 5 meses que se omitieron debido a errores de imagen o muerte prematura antes del desenlace a los 5 meses (Tabla suplementaria 2). El novedoso algoritmo de segmentación detectó automáticamente los espacios articulares (azul, izquierdo) para la separación ósea individual (colores, derecha) entre ambos sexos y genotipos (Figura 2A-D). En cuanto a la precisión de segmentación de huesos individuales mostrada en la Tabla Suplementaria 5 y la Tabla Suplementaria 6, la WT superó a los conjuntos de datos de TNF-Tg tanto para hombres (WT 98,4% frente a TNF-Tg 93,1%, p<0,0001) como para mujeres (WT 98,7% frente a TNF-Tg 92,1%, p<0,0001). La fuente del error se demostró visualmente como cierre incompleto de espacios articulares (flechas en un recuadro blanco discontinuo), lo que inadvertidamente sobreconectó dos huesos distintos en una sola segmentación (Figura 2C-D). Estos errores sobreconectados demostrados en las patas traseras del TNF-Tg pueden ser secuelas de daños crónicos que conducen a la fusión articular, donde el espacio entre los huesos ya no existe. De hecho, la diferencia de precisión entre los conjuntos de datos WT y TNF-Tg se hace más pronunciada con el tiempo a medida que aumenta la severidad artrítica (Figura 2E-F), especialmente en los huesos tarsianos (Figura 2G-H, amarillo = mayor precisión, verde = disminución de la precisión), que suelen servir como biomarcadores fiables para la progresión de la erosión^{ósea 23}. Sin embargo, en comparación con nuestro enfoque anterior de segmentación SA, hubo una mejora notable en la precisión general del conjunto de datos (Figuras 2E-F; Hombre en WT: SA 79,39% ± 5,73% frente a DL 98,16% ± 1,47%, p<0,0001; WT femenina: SA 79,16% ± 4,84% frente a DL 99,19% ± 1,63%, p<0,0001), demostrando los sólidos avances metodológicos tanto en automaticidad como en fiabilidad. Así, nuestro novedoso modelo estratégico para la segmentación del hueso de la pata trasera utilizando identificación facilitada por DL en el espacio articular proporciona una precisión significativamente mayor en segmentación en conjuntos de datos de WT (>98%) en comparación con métodos anteriores de SA (~79%), pero con un rendimiento ligeramente degradado cuando se aplica a patas traseras con artritis inflamatoria-erosiva (92%-93%).

La aplicación flexible del método de segmentación a las patas delanteras pone de relieve una deficiencia articular pronunciada y las fusiones óseas en ratones TNF-Tg, con una rápida reducción en la precisión de segmentación
Ampliamos aún más la aplicación del novedoso método de segmentación a las patas delanteras murinas (n=55 patas delanteras masculinas WT, n=29 patas delanteras femeninas WT, n=54 patas delanteras masculinas con TNF-Tg y n=50 patas delanteras femeninas TNF-Tg) con tamaño óseo y anatomía únicos. Hubo 1 pata delantera a los 4 meses del macho WT, 1 pata delantera a los 4 meses y 2 delanteras a los 5 meses para la hembra WT, 2 patas delanteras a los 3 meses para el macho TNF-Tg, y 2 patas delanteras a los 4 meses y 4 patas delanteras a 5 meses para la hembra TNF-Tg, que se omitieron por error de imagen o muerte prematura antes del desenlace. Además, hubo un error parcial de imagen en una pata delantera a los 3 meses en la hembra WT con la omisión de DP-F3, PP-F3, DP-F4 y PP-F4 (Tabla Suplementaria 3 y Tabla Suplementaria 4). Para orientar, proporcionamos un modelo de pata delantera WT con cada hueso individual separado por color y nomenclatura específica del hueso, indicada desde diferentes puntos de vista (Figura 3). Las investigaciones previas en ratones TNF-Tg se han centrado principalmente en la pata trasera, mientras que aquí demostramos la arquitectura de las patas delanteras murinas tanto en ratones WT como en ratones TNF-Tg. Destacamos especialmente los carpianos (círculo discontinuo amarillo) y los sesamoides (círculo discontinuo azul) que presentan una enfermedad erosiva visualmente profunda, especialmente en mujeres con TNF-Tg (Figura 4A-D). Por ello, la comparación de la precisión de segmentación de la pata trasera y la delantera mostró una reducción marcada en las patas delanteras (efecto tipo de pata p<0,0001), impulsada principalmente por el fuerte descenso de la integridad ósea con el aumento de la edad y gravedad de la enfermedad en conjuntos de datos de TNF-Tg (Figura 4E-F; efecto genotipo pata-pata p=0,0083; patas delanteras machos: WT 87,29% ± 2,07% frente a TNF-Tg 72,65% ± 11,70%, p<0,0001). Al igual que en las patas traseras, la disminución de la precisión de segmentación del TNF-Tg con el envejecimiento y la gravedad de la enfermedad es más pronunciada en los carpales, junto con los sesamoides (Figura 4G-H, Tabla Suplementaria 7 y Tabla Suplementaria 8). Esta patología ósea regional puede estar impulsada por una actividad erosiva aumentada en la articulación adyacente de la articulación MET-F y PP-F (articulación metacarpopalángica). La evaluación del tipo de error reveló que las patas delanteras de TNF-Tg tienden a mostrar una mayor proporción de huesos completamente erosionados en comparación con las traseras (Figura suplementaria 2, rojo como ausente). Aunque ciertamente representativa de la severidad progresiva de la artritis, la ausencia de huesos en las patas delanteras del TNF-Tg también podría poner de manifiesto una limitación en la resolución de imagen. Las graves erosiones en las patas delanteras de TNF-Tg se demuestran aún más mediante imágenes representativas a lo largo del tiempo que resaltan la región carpiana (flechas blancas) y la dislocación progresiva y completa de la pata respecto al antebrazo (flechas amarillas), especialmente notable en hembras de TNF-Tg (Figura suplementaria 3). Así, la aplicación flexible del método automatizado de segmentación ósea a estructuras únicas de la pata delantera mostró un rendimiento notable en conjuntos de datos de WT (~87%) con una reducción similar en la precisión en patas delanteras TNF-Tg con artritis inflamatoria-erosiva (67%-72%).

Disponibilidad de datos:
Como se describe en la sección de recogida de imágenes micro-CT, los datos de Hindpaw se publicaron^{previamente en 12, 23, 35} y están disponibles públicamente a^{https://doi.org/10.5281/zenodo.11191782 28}. Los datos para la cuantificación de precisión en el método de segmentación SA para los conjuntos de datos WT¹² y^{TNF-Tg 23} se reutilizaron para su comparación directa con el novedoso modelo DL descrito aquí. No se reutilizaron datos específicos del estudio previo adicional^{en 35}, pero también se utilizaron los mismos conjuntos de datos de hindpaw que están disponibles^{públicamente en 28}. A continuación se proporcionan detalles adicionales sobre licencias y reutilización de datos. Para los fines del estudio descrito, los datos correspondientes de la pata delantera también se han hecho públicos en el repositorio Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.14865639)²⁹.

Los datos de precisión para los conjuntos de datos WT 12 del método de segmentación^{SA se} reutilizaron en la Figura 2. La reutilización de este material está protegida por la Licencia Internacional Creative Commons Atribución-NoComercial-NoDerivados 4.0 https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode. Como autores de la obra referenciada, conservamos el derecho de preparar otras obras derivadas a través de los Derechos de Autor de Elsevier https://beta.elsevier.com/about/policies-and-standards/copyright. Los puntos de datos han sido revisualizados para comparar con precisión a lo largo del tiempo con sus homólogos TNF-Tg y directamente con el novedoso método DL descrito aquí.

Los datos de precisión para los conjuntos de datos WT y TNF-Tg 23 del método de segmentación^{SA se} reutilizaron para la Figura 2, y los conjuntos de datos WT y TNF-Tg de Hindpaw se evaluaron posteriormente para mediciones volumétricas^{previamente 23}. La reutilización del material está protegida por la Licencia de Atribución Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite al autor original y a la fuente. Los puntos de datos han sido revisualizados para evaluar la precisión a lo largo del tiempo y comparados directamente con el novedoso método DL descrito aquí.

Los mismos conjuntos de datos de postpaw WT y TNF-Tg,^{disponibles públicamente, 28} , se utilizaron además para mediciones volumétricas óseas previamente para comparaciones novedosas con cohortes de corredores^{de ruedas 35}. La reutilización del material está protegida por la Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se dé el crédito adecuado al autor original y a la fuente, se proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se han realizado modificaciones. Los mismos conjuntos de datos disponibles^{públicamente 28} se han utilizado en el trabajo actual, pero sin ninguna utilización o modificación específica de puntos de datos previamente publicados.

Figura 1: Detección automatizada del espacio articular mediante procesamiento estratégico de imágenes y predicciones de aprendizaje profundo para la segmentación ósea. Se procesaron conjuntos de datos de micro-CT de Murine con visualización de (A) las superficies dorsal (superior) y plantar (inferior) para (B) posterior identificación automatizada de espacios articulares (azul) utilizando un modelo DL (descrito en la Figura Suplementaria 1) desarrollado a partir de segmentaciones óseas estándar^{de oro 12,23}. (C) La separación ósea final exitosa (colores específicos de cada hueso) se logró mediante una combinación adicional de pasos de procesamiento de imagen, incluyendo un top^{hat negro 12}, mejora estructural³⁷ y mejora de membrana con votación tensorial³⁸ para una identificación robusta del espacio articular para etiquetar huesos individuales. (D) El entrenamiento y validación (n=40 patas traseras) del componente DL se realizaron con patas traseras murinas WT de la misma edad (de 2 a 6 meses, n=8 patas traseras en cada momento temporal) y distribución sexual (n=20 patas traseras macho/hembra), con un 25% aleatorizado de subvolúmenes usados para validación (3 subvolúmenes por pata trasera, total 120 subvolúmenes). Las patas traseras WT restantes (n=44) fueron evaluadas como casos de prueba para análisis posteriores. La combinación del modelo DL y los algoritmos de procesamiento de imágenes fue evaluada utilizando conjuntos de datos previamente publicados y disponibles^{públicamente 23,28}. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: La implementación de la identificación automatizada del espacio articular con facilitación de aprendizaje profundo mejora la precisión de segmentación ósea. (A-B) Tras el desarrollo de la detección automática del espacio articular, aplicamos el modelo DL (izquierda: espacios articulares azules; derecha: colores segmentados específicos del hueso) a los casos de prueba restantes para hombres y mujeres WT. (C-D) También evaluamos el rendimiento en cohortes de edad emparejadas (hombres: 2-8 meses; hembras: 2-5 meses) de ratones TNF-Tg con artritis inflamatoria-erosiva progresiva asociada a mortalidad de inicio temprano en^{mujeres de 32} años. Las imágenes insertadas muestran errores de segmentación de alta magnificación (cajas discontinuadas) donde las desconexiones en los espacios articulares previstos (flechas blancas) provocan una fuga en la separación ósea, provocando errores de segmentación ósea sobreconectada. (E-F) Cabe señalar que se omitió el periodo masculino de 6 meses, ya que todos los conjuntos de datos de WT se utilizaron para entrenamiento y validación, por lo que no se incluyeron en la cohorte de pruebas DL. En comparación con nuestros algoritmos anteriores de segmentación^{SA 12,23}, la precisión de segmentación (huesos correctamente segmentados / huesos totales) mejoró notablemente tanto para conjuntos de datos WT como TNF-Tg con el enfoque DL, independientemente del sexo (líneas de precisión medias: negro sólido = DL WT, negro discontinuo = DL TNF-Tg, gris sólido = SA WT, gris discontinuo = SA TNF-Tg). Sin embargo, la precisión de las segmentaciones TNF-Tg disminuyó notablemente con el tiempo y el daño progresivo asociado a las articulaciones en comparación con WT, aunque continuó superando al método SA. (G-H) Los mapas de calor con precisión especificados a compartimentos óseos (T = tarsos, MT = metatarsos, PP = falanges proximales, DP = falanges distales, S = sesamoides) demuestran el aumento de la tasa de error en ratones TNF-Tg principalmente localizados en la región tarsal (claro (amarillo) = alto (100%), oscuro (morado) = baja (20%) precisión). Como se ha mencionado, las imágenes insertadas (C-D) resaltan la fuente de error con espacios articulares desconectados (flechas, imagen izquierda) que conducen a huesos sobreconectados (colores, imagen derecha). De hecho, los errores eran predominantemente sobreconectados (2+ huesos segmentados como 1 material; señalados en la Figura Suplementaria 2), lo que puede representar el proceso patológico de fusiones articulares con creciente severidad artrítica. Estadísticas: análisis de efectos mixtos a tres vías (SA frente a DL; método x genotipo x tiempo; E-F), análisis de efectos mixtos bidireccionales (WT vs TNF; genotipo x tiempo; E-H); p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05 (efectos de interacción); Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Tamaños de muestra: n=34 patas traseras WT macho (n=2 a los 2 meses, n=4 a los 3 meses, n=6 a los 4-5 meses, n=0 a los 6 meses [todos los datos usados para pruebas], n=8 a los 7-8 meses), n=10 patas traseras WT hembra (n=4 a los 2 meses, n=2 a los 3-5 meses), n=56 patas traseras TNF-Tg macho (n=8 a los 2-8 meses), y n=48 patas traseras TNF-Tg hembra (n=14 a los 2-3 meses y n=10 a los 4-5 meses). Los datos utilizados en esta figura han sido modificados respecto a estudios^{previos 12,23}. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: La aplicación flexible de segmentación de aprendizaje profundo en espacio articular a otras estructuras complejas destaca la anatomía ósea de la pata delantera murina. A continuación, evaluamos el potencial del modelo DL de segmentación del espacio articular para separar automáticamente huesos en estructuras complejas adicionales más allá de la pata trasera. El método de segmentación se implementó en los correspondientes conjuntos de datos micro-CT de la pata delantera, visualizados desde las superficies (A) dorsal, (B) plantal, (C) lateral y (D) medial, con colores que representan huesos segmentados individuales. Identificamos el potencial para una segmentación precisa de los huesos de la pata delantera, incluyendo carpales distintos, metacarpos (#, MET-F), falanges proximales (^, PP-F), falanges distales (~, DP-F), sesamoides (círculos discontinuos, S-F) y garras (*) con etiquetado específico para cada hueso correspondiente a la anatomía^{conocida de la pata delantera.} Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Los ratones TNF-Tg presentan una marcada destrucción de las articulaciones de la pata delantera y fusiones óseas con una rápida reducción en la precisión de segmentación. (A-B) Dada la complejidad y pequeña arquitectura de las patas delanteras murinas, destacada por la visualización dorsal (izquierda) y plantar (derecha) de imágenes micro-CT de ratones machos y hembras WT, (C-D) la anatomía y la artritis asociada en ratones TNF-Tg no se habían evaluado previamente. La aplicación de nuestro novedoso enfoque DL de espacio articular proporcionó una oportunidad inicial para evaluar estas estructuras complejas reduciendo los desafíos analíticos con un >85% de precisión de las patas delanteras WT, aunque con menor precisión en comparación con las traseras (líneas medias de precisión: azul sólido = pata trasera WT, azul discontinuo = trasera TNF-Tg, rojo sólido = pata delantera WT, rojo discontinuo = pata delantera TNF-Tg). (E-F) Además, las patas delanteras del TNF-Tg mostraron un rápido y dramático descenso en la precisión de segmentación debido a errores localizados en los carpos (círculos amarillos punteados en A-D) y en los sesamoides (círculos azules punteados en A-D) con el tiempo. (G-H) Las reducciones regionales disminuidas en la precisión de segmentación se muestran mediante mapas de calor (claro (amarillo) = alto (100%), oscuro (morado) = baja precisión (20%) de los compartimentos óseos (C = carpales, MC = metacarpos, PP = falanges proximales, DP = falanges distales, S = sesamoides). Cabe señalar que el punto temporal masculino de 6 meses se omitió en (E), ya que todos los conjuntos de datos de WT Hindpaw se utilizaron para entrenamiento y validación, por lo que no se incluyeron en la cohorte de pruebas DL. Estadísticas: análisis de efectos mixtos a tres bandas (pata trasera vs pata, WT vs TNF; genotipo tipo x pata x tiempo, efectos de interacción reportados; E-F), análisis de efectos mixtos bidireccionales con comparaciones múltiples de Sidak (WT vs TNF; genotipo x tiempo; G-H); p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05; Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Tamaños de muestra: n=55 patas delanteras WT macho (n=8 a los 2-3 y 5-8 meses, n=7 a los 4 meses), n=29 patas delanteras WT hembra (n=8 a los 2-3 meses, n=7 a los 4 meses, n=6 a los 5 meses), n=54 patas delanteras TNF-Tg macho (n=8 a los 2 y 4-8 meses, n=6 a los 3 meses), y n=50 patas delanteras (n=14 a los 2-3 meses, n=12 a los 4 meses y n=10 a los 5 meses). Datos de la pata trasera DL (E-F) reproducidos de la Figura 2E-F para comparación adicional con los datos de la pata delantera DL. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Desarrollo y entrenamiento del modelo de aprendizaje profundo de detección conjunta. (A) Las regiones articulares de la verdad de suelo se obtuvieron a partir de segmentaciones iniciales de huesos de verdad de suelo mediante una receta automática usando Amira, que combina expansión de etiquetas, extracción de interfaces de etiquetas, enmascaramiento y dilatación. (B) Para cada uno de los 20 conjuntos de datos micro-CT de entrenamiento (40 patas traseras), se extrajeron manualmente 6 subvolúmenes de 200 x 200 vóxeles de los tarsos, falanges distales y regiones de fondo, repartidas equitativamente entre las patas izquierda y derecha (3 parches por pata trasera). Los 120 subvolúmenes resultantes se utilizaron entonces como entrada para un módulo de entrenamiento Amira de segmentación 3D junto con las correspondientes regiones articulares etiquetadas como objetivo de precisión en el terreno. Se utilizó un subconjunto aleatorio de parches al 25% para validar y controlar el sobreajuste del modelo durante el entrenamiento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Distribución distinta de los tipos de error entre las patas traseras y las delanteras. Similar al algoritmo de segmentación SA desarrollado^{previamente en 12,23}, el modelo DL en espacio articular produjo la mayor proporción de errores al sobreconectar huesos (verdes, 2+ huesos segmentados como 1 material), especialmente en las patas traseras (A-D) o (E-F) patas delanteras WT. Como se indica en la Figura 2, los errores de sobreconexión ocurrirán si hay un hueco en el espacio articular detectado que puede darse por diversas razones, incluyendo mayor proximidad ósea que resolución de imagen, artefactos de movimiento que difuminan el espacio articular o remodelación ósea en el contexto de la artritis, lo que puede provocar fusiones articulares. (G-H) Curiosamente, las patas delanteras de TNF-Tg presentan una proporción notablemente mayor de huesos ausentes (rojo), lo que significa que el hueso estaba completamente ausente de la segmentación. Estos errores probablemente se atribuyen a una combinación de graves erosiones y deficiencias en la resolución de imagen, dado el tamaño relativamente menor de los huesos de las patas delanteras, especialmente los carpianos y los sesamoides, como fuente predominante de error (Figura 4), en comparación con los de las patas traseras. Tipos adicionales de errores incluyen sobre-división (azul, 1 hueso segmentado como 2+ materiales) o tanto sobre-conectado como sobre-dividido (naranja). Los gráficos circulares representan proporciones de errores totales atribuidos a subtipos específicos de error. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Evaluación de la artritis progresiva de TNF-Tg en la pata delantera con erosiones óseas severas y luxaciones articulares. Para visualizar los cambios estructurales en las patas delanteras a lo largo del tiempo, proporcionamos imágenes representativas de la superficie dorsal de (A) macho WT, (B) macho TNF-Tg, (C) hembra WT y (D) hembra TNF-Tg hembra a lo largo del tiempo entre los 2 y 5 meses (de izquierda a derecha) para resaltar especialmente la región carpiana (flechas blancas). Observa las graves erosiones óseas y remodelaciones que ocurren aproximadamente a los 4 meses en las mujeres y a los 5 meses en los machos. Estos periodos son anteriores al inicio típico de graves erosiones óseas en las patas traseras, aproximadamente a los 5 meses en las hembras y entre 7 y 8 meses en^{machos de 23} años. (E) Una vista lateral de las patas delanteras de las hembras de TNF-Tg también muestra la dislocación progresiva de toda la pata desde el antebrazo (flechas amarillas) asociada a la destrucción articular. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Tamaños de muestra de patas traseras WT para entrenamiento, validación y pruebas metodológicas de DL. Los tamaños de muestra en el número de patas traseras se proporcionan según la edad (meses 2-8) y se organizan por conjuntos de datos utilizados para entrenamiento/validación de DL, pruebas metodológicas totales o aquellos omitidos ya sea por error de imagen, artefacto de movimiento severo o muerte antes de la micro-TC programada. Los glóbulos negros de los meses 6-8 en las mujeres indican la finalización prevista de los escaneos tras 5 meses debido a la mortalidad temprana de los equivalentes experimentales con TNF-Tg. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Tamaños de muestra de las patas traseras de TNF-Tg para pruebas metodológicas. Los tamaños de muestra en el número de patas traseras se proporcionan según la edad (meses 2-8) y se organizan por conjuntos de datos utilizados para pruebas metodológicas totales o por aquellos omitidos debido a errores de imagen, artefactos de movimiento severo y/o fallecimiento antes de la micro-TC programada. Los glóbulos negros de los meses 6-8 en las hembras indican la finalización prevista de las exploraciones tras 5 meses debido a la mortalidad temprana de las hembras de ratones con TNF-Tg. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 3: Tamaños de muestra de patas delanteras WT para pruebas metodológicas. Los tamaños de muestra en el número de patas delanteras se proporcionan según la edad (meses 2-8) y se organizan por conjuntos de datos utilizados para pruebas metodológicas totales o por aquellos omitidos debido a errores de imagen, artefactos de movimiento severo y/o fallecimiento antes de la micro-TC programada. Los glóbulos negros de los meses 6-8 en las mujeres indican la finalización prevista de los escaneos tras 5 meses debido a la mortalidad temprana de los equivalentes experimentales con TNF-Tg. *A los 3 meses en las hembras WT, n=1 pata delantera había omitido DP-F3, PP-F3, DP-F4 y PP-F4 debido a errores de imagen, aunque se evaluó el resto de la pata delantera. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 4: Tamaños de muestra de las patas delanteras TNF-Tg para pruebas metodológicas. Los tamaños de muestra en el número de patas delanteras se proporcionan según la edad (meses 2-8) y se organizan por conjuntos de datos utilizados para pruebas metodológicas totales o por aquellos omitidos debido a errores de imagen, artefactos de movimiento severo y/o fallecimiento antes de la micro-TC programada. Los glóbulos negros de los meses 6-8 en las hembras indican la finalización prevista de las exploraciones tras 5 meses debido a la mortalidad temprana de las hembras de ratones con TNF-Tg. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 5: Precisión ósea individual de las patas traseras masculinas. Para identificar los huesos concretos que reducen la precisión de segmentación en las patas traseras de TNF-Tg frente a WT, se proporcionan detalles sobre el número de huesos segmentados correctamente, incorrectamente y el porcentaje de correcta en relación con el total de huesos evaluados en ratones machos. En la región tarsal donde se producen los déficits primarios (Figura 2), el calcano (CALC), el cuneiforme intermedio (no fusionado, INT) y el cuneiforme navicular/lateral (sin fusionar) mostraron la disminución más destacada en la precisión para las patas traseras del TNF-Tg. Estadísticas: prueba exacta de Fisher; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 6: Precisión ósea individual de las patas traseras de las hembras. Para identificar los huesos particulares que reducen la precisión de segmentación en las patas traseras de TNF-Tg frente a WT, se proporcionan detalles sobre el número de huesos segmentados correctamente, incorrectamente y el porcentaje correcto en relación con el total de huesos evaluados en ratones hembras. Dada la utilización de conjuntos de datos para el entrenamiento y validación de DL, junto con la reducción del plazo a 5 meses para comparar con ratones TNF-Tg que presentan mortalidad^{temprana 32}, el número total de patas traseras asignadas para pruebas de DL en hembras WT limita la capacidad de comparaciones óseas individuales para explicar la disminución global de la precisión en los conjuntos de datos TNF-Tg. Estadísticas: prueba exacta de Fisher; p<0.0001. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 7: Precisión ósea individual de las patas delanteras masculinas. Para identificar los huesos concretos que reducen la precisión de segmentación en las patas delanteras de TNF-Tg frente a WT, se proporcionan detalles sobre el número de huesos segmentados correctamente, incorrectamente y el porcentaje de corrección relativo al total de huesos evaluados en ratones machos. En las regiones carpiano y sesamoide, donde se presentan los déficits primarios (Figura 4), el capitado (CAP), triquetrum (TRI), central (no fusionado, CENT), escafoides/lunado (SCAPHATE), trapecio (ZOID) y sesamoides 2-10 mostraron la disminución más destacada en la precisión de las patas delanteras TNF-Tg. Cabe destacar que la precisión de los sesamoides 1 y 2 es deficiente tanto para los conjuntos de datos WT como TNF-Tg. Curiosamente, el metacarpo 1 mostró mejoras en la precisión de segmentación en ratones TNF-Tg, posiblemente debido a articulaciones cercanas con huesos adyacentes que provocan errores sobreconectados que se mitigan con erosiones artríticas. Estadísticas: prueba exacta de Fisher; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 8: Precisión ósea individual de las patas delanteras de las hembras. Para identificar los huesos concretos que reducen la precisión de segmentación en las patas delanteras de TNF-Tg frente a WT, se proporcionan detalles sobre el número de huesos segmentados correctamente, incorrectamente y el porcentaje de corrección en relación con el total de huesos evaluados en ratones hembras. En las regiones carpiano y sesamoide, donde se presentan los déficits primarios (Figura 4), el capitado (CAP), el hamato (HAM), el triquetrum (TRI) y los sesamoides 1-10 mostraron la disminución más destacada en la precisión de las patas delanteras del TNF-Tg. Cabe destacar que la precisión de los sesamoides 1 y 2 es deficiente tanto para los conjuntos de datos WT como TNF-Tg. Estadísticas: prueba exacta de Fisher; *p<0,05, ***p<0,001, ****p<0,0001. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Receta conjunta de segmentación para el entrenamiento de modelos de aprendizaje profundo. Serie de pasos incrustados para extraer espacios articulares segmentados de patas traseras micro-CT presegmentadas de estándar de oro que se usaron para entrenar el modelo DL para la identificación del espacio articular. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Receta de segmentación ósea usando procesamiento de imágenes con facilitación de aprendizaje profundo. Serie de pasos integrados para transformar datos originales de micro-TC en segmentaciones de huesos individuales utilizando pasos de procesamiento de imagen combinados con la salida de la identificación del espacio articular DL para guiar la separación ósea. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3: Pesas de predicción de aprendizaje profundo. Archivo utilizado como entrada para pesos durante la predicción de aprendizaje profundo de segmentación del espacio conjunto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 4: Arquitectura de predicción de aprendizaje profundo. Archivo utilizado como entrada para la arquitectura durante la predicción de aprendizaje profundo de segmentación conjunta del espacio. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5: Script de aprendizaje profundo en python. Archivo utilizado como script en Python para predicción de aprendizaje profundo de segmentación en espacio conjunto. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Hasta el final de análisis totalmente automatizados de volúmenes óseos en ratones, generamos mejoras adicionales en la segmentación de datos de micro-TC en estructuras complejas, especialmente en las patas traseras murinas. La estrategia consistía en trabajar los espacios articulados de las articulaciones para crear límites para la separación ósea, donde centrarse en el espacio negativo entre huesos permitía una implementación flexible en estructuras alternativas como la pata delantera, ya que el enfoque no era particular de la forma y anatomía de los huesos distintos de la pata trasera. Aunque la precisión de segmentación disminuyó al realizarse en patas delanteras, los conjuntos de datos WT aún demostraron una precisión ósea del >85%. Procesos correctivos bien descritos¹² podrían aplicarse para crear conjuntos de datos pre-anotados de modelos de pata delantera para el entrenamiento de DL, reduciendo drásticamente las barreras para la creación de algoritmos específicos de la estructura. Este enfoque novedoso también permitió su aplicación en patas de TNF-Tg con artritis inflamatoria-erosiva severa y progresiva. En las patas de TNF-Tg, el descenso en la precisión de segmentación fue notable con el tiempo, correspondiente al aumento progresivo de las erosiones óseas y eventuales fusiones patológicas hueso-hueso por la remodelación de superficies erosionadas con el aumento de la edad. Así, la aplicación notablemente exitosa de un modelo de segmentación automatizado y altamente preciso en estructuras de WT tiene el potencial de guiar futuras aplicaciones en modelos de enfermedades u otras articulaciones complejas. Investigaciones adicionales se centrarán en optimizar la segmentación de las articulaciones artríticas que puedan cuantificar los efectos patológicos de las erosiones y fusiones óseas para identificar biomarcadores de enfermedades, como se describió^{anteriormente 23}.

A pesar del uso exitoso de la micro-TC para monitorizar la erosión de huesos pequeños en modelos preclínicos de artritis 12,23,25,35,42, la aplicación de las modalidades de TC en la evaluación clínica ha sido limitada. En particular, para la artritis reumatoide, los sistemas de puntuación se implementan principalmente para la resonancia^{magnética 43}, la ecografía^44,45 y/o la radiografía^{convencional 46}, para generar medidas semicuantitativas y dependientes del usuario de la gravedad de la enfermedad, a menudo en conjunto con métricas^{clínicas 47}. Como la TC se considera la referencia de referencia de oro para la evaluación de la integridad^{ósea 48,49}, una optimización adicional de los enfoques analíticos clínicamente traducibles promete aportar un beneficio tremendo para una evaluación cuantitativa fiable y longitudinal de los volúmenes óseos, tanto para informar las medidas de gravedad de la enfermedad como para evaluar la respuesta al tratamiento. Aunque modalidades de imagen como la resonancia magnética proporcionan una mayor variedad de información, incluyendo regiones inflamadas, cambios en la médula ósea y patología de tejidos blandos, los novedosos enfoques de TC con múltiples insumos^energéticos ofrecen potencial para extender la utilización de la TC más allá de la arquitectura ósea. A pesar de estos beneficios propuestos, también reconocemos los enormes desafíos en la traducción clínica de herramientas analíticas preclínicas desarrolladas, considerando la aplicación a imágenes clínicas de TC de baja resolución y su implementación en anatomía humana distinta. De forma similar a nuestra reciente identificación de biomarcadores específicos para huesos en modelos preclínicos de^{artritis 23}, un esfuerzo clínico detallado que investigue métricas puramente cuantitativas de la erosión ósea supondría un avance importante en el monitoreo de enfermedades.

Aunque nuestro trabajo actual proporciona una base para la implementación clínica, dado el potencial de aplicación flexible a estructuras novedosas al dirigirse a espacios articulares, una limitación principal es la dependencia de un software preclínico bien documentado y orientado a la investigación en Amira, no destinado al diagnóstico clínico. Sin embargo, los algoritmos subyacentes y el diseño estratégico pueden implementarse fácilmente en entornos de software alternativos mediante la metodología detallada proporcionada. Independientemente del software de investigación utilizado, su incorporación al uso clínico (en lugar de la investigación) requiere esfuerzos traslacionales que cumplan con los requisitos regulatorios para la introducción a la práctica clínica. Para la aplicación de la novedosa estrategia de segmentación, también es importante considerar las posibles limitaciones en la resolución diferencial de imagen, donde ya hemos descrito que la resolución de imagen (es decir, el tamaño del vóxel/estructura) es un determinante clave de la precisión de la segmentación utilizando únicamente algoritmos de procesamiento^{de imagen 12}. De hecho, esto posiblemente esté relacionado con la ligera reducción en la precisión de segmentación de las patas delanteras, donde la disminución del tamaño de las estructuras de las patas delanteras produciría inherentemente una calidad de imagen relativamente menor en comparación con las traseras. También es importante reconocer la discrepancia en el rango de edad de los conjuntos de datos de entrenamiento (2-6 meses) y de pruebas (incluyendo 7-8 meses), que puede afectar la aplicación y precisión con cambios relacionados con la edad, incluyendo el crecimiento ósea continuo o el inicio posterior de patologías articulares. Nuestros hallazgos apoyan la precisión mantenida para las patas traseras WT en el análisis de DL más allá de los 6 meses de edad (Figura 2E), lo que sugiere que la disminución en el rendimiento de segmentación en homólogos TNF-Tg probablemente esté más relacionada con la progresión inflamatoria-erosiva independientemente de la edad en sí. Sin embargo, se necesitan más estudios con ratones salvajes mayores y ancianos para garantizar una precisión consistente, independiente del rango de edad particular de la cohorte de entrenamiento de DL. Por último, ampliar los métodos descritos más allá de un enfoque de separación ósea de clase única hacia una herramienta analítica multiclase más robusta que incluya nombres óseos predichos basados en la arquitectura estructural o la ubicación de coordenadas en anatomía fija (es decir, similar a un árbol de atlas) sin duda proporcionará mejoras esenciales y probablemente mejorará la adopción de métodos.

En conclusión, hemos diseñado una novedosa estrategia de segmentación micro-CT facilitada por procesamiento de imágenes y DL para aislar huesos individuales dentro de estructuras complejas. Esta innovación demuestra una mejora notable tanto en la automatización como en la precisión de segmentación en comparación con nuestro flujo de trabajo^{SA 12} recientemente creado, que aquí sirvió como base para la producción de numerosas segmentaciones de referencia para entrenar modelos DL y optimizar las mejoras actuales. Aunque la traducción de los métodos de segmentación en patas delanteras y patas con artritis inflamatoria-erosiva mostró un rendimiento obsoleto, la implementación de este enfoque de segmentación DL podría reducir los esfuerzos manuales necesarios para generar conjuntos de datos completamente anotados que permitan modelos de entrenamiento DL específicos de patología o estructura. La utilización de este método DL en futuros estudios podría permitir optimizar la segmentación ósea entre diferentes especies y modelos de enfermedades en la investigación preclínica, para permitir un análisis cuantitativo detallado aguas abajo. Además, instamos a incorporar estas estrategias en la investigación clínica, ya que prometen beneficios futuros para la atención al paciente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema informático	Detalles proporcionados en la sección de Protocolo	Detalles proporcionados en la sección de Protocolo
Software de visualización de imágenes	ThermoFisher Scientific	v2022.2 o posterior	Amira
Isoflurano	VetOne	13985-528-60	Fluriso, 1-3% para anestesia
Ratones	Centro Médico de la Universidad de Rochester	N/A	C57BL/6, TNF-transgénico
Micro-CT	Scanco Medical	N/A	VivaCT 40
Software estadístico	GraphPad Software, Inc	v10.2.0 o posterior	GraphPad Prism
Cinta	N/A	N/A	Asegurar las patas de los animales para la imagen
Tubería	N/A	N/A	Plástico Derlin y acrílico transparente para estabilización animal