Explorando la aplicación de la biodetección basada en dispersión Raman mejorada en superficies de sEVs individuales en el diagnóstico y terapias de enfermedades

Summary

Aquí presentamos un protocolo para analizar pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) individuales utilizando espectroscopía Raman mejorada en superficie sin etiquetar (SERS), permitiendo diagnósticos y evaluaciones mínimamente invasivas de las enfermedades como vehículos terapéuticos de administración.

Abstract

Este protocolo describe una plataforma integral y libre de etiquetas que integra espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS) con aprendizaje automático (ML) para detectar y perfilar molecularmente pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) individuales para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. El método comienza con el aislamiento de sEV utilizando cromatografía de exclusión de tamaño o ultracentrifugación. Las vesículas aisladas se analizan luego sobre sustratos de nanopirámides plasmónicas de oro 2D diseñados con sensibilidad a una sola vesícula. Aprovechando huellas bioquímicas intrínsecas Raman, el protocolo permite la detección de alta especificidad sin etiquetas externas. Tras la adquisición espectral, los datos se preprocesan y se analizan utilizando algoritmos de aprendizaje automático entrenados (por ejemplo, LDA, SVC) para clasificar estados patológicos, distinguiendo con éxito el cáncer gástrico de los controles sanos usando sEVs de tejido, plasma y saliva con precisiones de clasificación respectivas del 90,1%, 70,9% y 60,7%. Además, su aplicación terapéutica se demuestra cuantificando la carga de doxorubicina en sEVs individuales, una medición mejorada mediante el uso de sustratos recubiertos de grafeno como estándar interno. Este enfoque permite un análisis de alto rendimiento que captura la heterogeneidad poblacional esencial para la detección temprana de la enfermedad y la comprensión de la eficiencia de carga de fármacos a nivel de vesícula única.

Introduction

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV), que suelen medir entre 30 y 200 nm de diámetro, son secretadas de forma natural por las células en fluidos biológicos y transportan proteínas, lípidos y ácidos nucleicos indicativos de su célula^{de origen 1,2,3}. Como biomarcadores no invasivos presentes en la saliva, orina y otros fluidos^corporales, presentan potencial para el diagnóstico temprano de la enfermedad, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, especialmente en^oncología

Protocol

La recogida de especímenes humanos se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCLA. Todos los donantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio.

NOTA: En este estudio se utilizaron un total de 4 líneas celulares, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), todas adquiridas a un proveedor comercial. Estas líneas celulares se cultivaron y pasaron estrictamente según las instrucciones y reactivos del fabricante. Los medios acondicionados se recogían y almace....

Results

La implementación exitosa del protocolo SERS de una sola vesícula produce espectros Raman distintos respecto a los sEVs individuales, permitiendo la clasificación diagnóstica posterior y el monitoreo de la carga terapéutica de fármacos. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo del estudio diagnóstico para el cáncer gástrico y la aplicación de monitorización de sEVs cargada con fármacos utilizando nuestro protocolo aquí reportado, respectivamente.

Discussion

Un aspecto fundamental de este protocolo es la preparación del sustrato y la purificación del sEV. El rendimiento de los SERS sin etiqueta depende en gran medida de producir sustratos plasmónicos uniformes y de alto nivel conformal con un "punto caliente" de realzamiento fuerte. Del mismo modo, el aislamiento de sEV de alta pureza mediante cromatografía de exclusión de tamaño es esencial para obtener espectros SERS fiables y reproducibles. Impurezas como agregados proteicos o li.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fisher Scientific	J61196. AP
Rejilla de cobre de 300 mallas	Ciencias de la Microscopía Electrónica	EMS200-Cu
Solución de paraformaldehído al 4%	Sigma Aldrich	1004960700
4 y Prime; Si wafers	MSE Suministros	WA0810	(100) orientado
Línea celular A549	ATCC	CCL-185
Línea celular de AGS	ATCC	CRL-1739
Rotor de centrífuga F-35-6-30, 5430	Eppendorf	22654306
CHA Mark 40	CHA Mark 40	https://chaindustries.com/mark-40-system/	Evaporación de haz de energía
Solución de cr grabador	Sigma Aldrich	651826-500ML
Doxorubicina  D-4000	Laboratorios LC	D-4000_3g
Sistema ExoView R100 y ExoView Human Tetraspanin Kit	NanoView Biosciences	https://www.nowmedicalstudios. com/portfolio/nanoview- biosciences-3d-product-illustrations
Solución FeCl3	Sigma Aldrich	451649
Solución HF	Sigma Aldrich	695068-500ML
Hs 738.St/Int línea celular	ATCC	CRL-7869
en Microscopio Raman confocal	Renishaw	https://www.renishaw.com/en/ invia-confocal-raman-microscopie --6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0 GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Solución KOH	Sigma Aldrich	417661
Shakers de mesa MaxQ 4000 para incubar/refrigerar	Termo Científica	SHKA4000 (4320)
Incubadora MCO-19AIC	SANYO	8380-30-0035
Filtro Millex-GP	MilliporeSigma	SLGPM33RS	0,22 & micro; m
Microscopio NanoSEM 230	FEI	SEM-FEI-014
Nanosight NS300	Malvern Panalytical	https://www.malvernpanalytical .com/en/support/producto-soporte /nanosight-rango/nanosight-ns300
Línea celular NCI-N87	ATCC	CRL-5822
Optima TLX Ultracentrífuga	Beckman Coulter	8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 Plus	Oxford Plasmalab	https://plasma.oxinst.com/ Productos/RIE/Plasmapro-800-RIE
Esferas de poliestireno	Alfa Aesar	AA42711AB	500 nm
qEVoriginal/35 nm	Izon	ICO-35
Grafeno de capa única	MSE Suministros	ME0408
Matraz T-75	VWR	156800
TF20 EM de alta resolución	FEI	https://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Solución de acetato de uranilo	Ciencias de la Microscopía Electrónica	22400-1