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Artículo de método

Explorando la aplicación de la biodetección basada en dispersión Raman mejorada en superficies de sEVs individuales en el diagnóstico y terapias de enfermedades

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DOI:

10.3791/69258

⸱

13 de marzo de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, University of California Los Angeles, 2Cornea Division, Stein Eye Institute, University of California Los Angeles

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para analizar pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) individuales utilizando espectroscopía Raman mejorada en superficie sin etiquetar (SERS), permitiendo diagnósticos y evaluaciones mínimamente invasivas de las enfermedades como vehículos terapéuticos de administración.

Resumen

Este protocolo describe una plataforma integral y libre de etiquetas que integra espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS) con aprendizaje automático (ML) para detectar y perfilar molecularmente pequeñas vesículas extracelulares (sEVs) individuales para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. El método comienza con el aislamiento de sEV utilizando cromatografía de exclusión de tamaño o ultracentrifugación. Las vesículas aisladas se analizan luego sobre sustratos de nanopirámides plasmónicas de oro 2D diseñados con sensibilidad a una sola vesícula. Aprovechando huellas bioquímicas intrínsecas Raman, el protocolo permite la detección de alta especificidad sin etiquetas externas. Tras la adquisición espectral, los datos se preprocesan y se analizan utilizando algoritmos de aprendizaje automático entrenados (por ejemplo, LDA, SVC) para clasificar estados patológicos, distinguiendo con éxito el cáncer gástrico de los controles sanos usando sEVs de tejido, plasma y saliva con precisiones de clasificación respectivas del 90,1%, 70,9% y 60,7%. Además, su aplicación terapéutica se demuestra cuantificando la carga de doxorubicina en sEVs individuales, una medición mejorada mediante el uso de sustratos recubiertos de grafeno como estándar interno. Este enfoque permite un análisis de alto rendimiento que captura la heterogeneidad poblacional esencial para la detección temprana de la enfermedad y la comprensión de la eficiencia de carga de fármacos a nivel de vesícula única.

Introducción

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV), que suelen medir entre 30 y 200 nm de diámetro, son secretadas de forma natural por las células en fluidos biológicos y transportan proteínas, lípidos y ácidos nucleicos indicativos de su célulade origen 1,2,3. Como biomarcadores no invasivos presentes en la saliva, orina y otros fluidoscorporales, presentan potencial para el diagnóstico temprano de la enfermedad, el pronóstico y el seguimiento terapéutico, especialmente enoncología 5,6,7. Sin embargo, su traducción clínica se ve dificultada por su alta heterogeneidad y baja abundancia en matrices biológicascomplejas 8. Para superar estos desafíos, este protocolo aprovecha la espectroscopía Raman mejorada en superficie (SERS), un potente método analítico capaz de amplificar la dispersión Raman hasta 10-1011 veces mediante sustratosplasmónicos 9,10,11. SERS captura espectros moleculares intrínsecos de "huellas" de sEVs individuales en cuestión de segundos, permitiendo un análisis ultrasensible de vesícula única y evitando tiempos de ensayo largos.

Nuestro método combina de forma sinérgica SERS basados en etiquetas para lograr una caracterización rápida y ultrasensible de los sEVsindividuales 12,13,14,15,16. El SERS sin etiqueta captura firmas bioquímicas intrínsecas y, cuando se combina con modelos de aprendizaje automático como LDA y SVC, ha demostrado distinguir los sEVs derivados de células sanas frente a células enfermas con altaespecificidad 13. Para mejorar aún más la reproducibilidad y la capacidad cuantitativa de nuestra plataforma, nuestro método es totalmente compatible con sustratos Raman cubiertos degrafeno 16. El grafeno de una sola capa ofrece una superficie químicamente uniforme que estabiliza los puntos calientes plasmónicos y mejora la adsorciónmolecular 17,18, y lo más importante aún, el grafeno de una sola capa sirve como el medidor "incorporado" de las señalesSERS 12,19, lo que permite la capacidad de cuantificación de las moléculas detectadas. A pesar de que el diámetro del haz láser Raman (~ 1 μm) es mayor que el típico sEV, nuestra plataforma logra una resolución efectiva de una sola vesícula gracias a la interacción única entre los mecanismos físicos y estadísticos. El sustrato cuasi-periódico de nanopirámides de oro genera "puntos calientes" plasmónicos altamente localizados de tamaños menores a 100 nm que amplifican las señales Raman de forma superlineal 12. Como resultado, la señal del sEV estocásticamente más cercano al punto caliente más intenso dentro del haz domina el espectro. Además, la imagen SEM confirma que los sEVs están bien separados (> 1 μm), minimizando la superposición espectral, mientras que los mapas de intensidad Raman revelan una localización de señal que coincide con el tamaño de las vesículasindividuales 13,14. En conjunto, estas características aseguran que cada espectro recogido corresponda predominantemente a un único sEV, permitiendo un análisis estadísticamente robusto y sin etiqueta de una sola vesícula. En comparación con los enfoques convencionales, como western blot, espectrometría de masas o dispersión Raman regular, que requieren grandes volúmenes de muestra y no pueden resolver 20 vesículasindividuales, nuestra plataforma SERS de vesícula única ofrece una sensibilidad, rendimiento y resolución molecular superiores. Este flujo de trabajo es adecuado para investigadores que buscan desarrollar herramientas diagnósticas mínimamente invasivas y de alta resolución o explorar la heterogeneidad del sEV y la eficiencia de carga de fármacos en estudios terapéuticos individualizados. En este protocolo, demostramos cómo nuestra plataforma SERS utiliza sEVs individuales para permitir la detección de enfermedades y aplicaciones terapéuticas, especialmente en cáncer, incluyendo todo el flujo de trabajo de aislamiento de vesículas, preparación de sustratos plasmónicos, adquisición de Raman y análisis de datos con aprendizaje automático.

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Protocolo

La recogida de especímenes humanos se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCLA. Todos los donantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio.

NOTA: En este estudio se utilizaron un total de 4 líneas celulares, AGS (CRL-1739), A549 (CCL-185), NCI-N87 (CRL-5822), Hs 738.St/Int (CRL-7869), todas adquiridas a un proveedor comercial. Estas líneas celulares se cultivaron y pasaron estrictamente según las instrucciones y reactivos del fabricante. Los medios acondicionados se recogían y almacenaban a -20 °C antes de ser procesados. En el Samsung Medical Center de Corea, los donantes contribuyeron voluntariamente con muestras de tejido, plasma y saliva. Durante la resección quirúrgica se obtuvo tejido de cáncer gástrico, mientras que se recogieron biopsias de controles no oncogénicos mediante endoscopia. El plasma se recogía en tubos EDTA según protocolos clínicos estándar. Se recogieron unos 5 mL de saliva entera sin estimular de cada sujeto, y luego centrifugados a 2.600 × g durante 15 minutos a 4 °C. Para preservar el ARN extracelular, el sobrenadante fue suplementado con inhibidor de SUPERasa-In RNasa a 20 U/mL. Todos los ejemplares se mantuvieron a -80 °C hasta un procesamiento adicional. Los sEVs se aislaron de medios acondicionados y muestras clínicas siguiendo los protocolosestablecidos 21.

1. aislamiento y caracterización de sEV

  1. Preparar muestras de sEV
    1. Descongela completamente el sobrenadante de cultivo celular eliminado a temperatura ambiente.
    2. Pasa el sobrenadante por un filtro de jeringuilla estéril de 0,22 μm para eliminar residuos y contaminantes mayores.
    3. Equilibrar una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) de 35 nm con una solución PBS de 1×.
    4. Aplicar 500 μL de la muestra filtrada a la columna.
    5. Eluye la muestra con 1x PBS según las instrucciones del fabricante.
    6. Recoge las fracciones enriquecidas con EV y guárdalas en viales limpios a −20 °C.
  2. Determinar la concentración y el tamaño de las partículas
    1. Diluir muestras de sEVs en DPBS estéril hasta una concentración final de partículas de 107-10 9 partículas/mL.
    2. Utilizando un instrumento de seguimiento de nanopartículas, graba cinco vídeos de 60 s por muestra. Usa un nivel de cámara de 14 y un caudal constante de 25.
    3. Analiza los vídeos con el software del instrumento, aplicando el factor de dilución para determinar la concentración final de partículas (partículas/mL) y el diámetro medio (nm).
  3. Caracterizar la expresión de tetraspanina
    1. Chips de tetraspanina humana pre-escaneo (1 cm × 1 cm, pre-recubiertos con anti-CD9, anti-CD63 y anti-CD81) para establecer una señal de referencia.
    2. Carga muestras diluidas de sEV en los chips en una placa sellada de 24 pozos e incuba durante la noche a temperatura ambiente.
    3. Añadir 35 μL de anticuerpos de detección (anti-CD9 CF488, anti-CD63 CF647, anti-CD81 CF555) e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente.
    4. Lava las patatas fritas según el protocolo del fabricante.
    5. Mide la expresión vesicular de tetraspanina utilizando un lector de caracterización de biomarcadores y su software de escaneo asociado.
  4. Confirmar la morfología del sEV con TEM
    1. Fija los sEVs de ~100 μL con ~100 μL de paraformaldehído al 4% durante 30 minutos.
    2. Carga aproximadamente 100 μL de sEVs fijos en rejillas de cobre de 300 mallas e incuba durante 5 minutos.
    3. Enjuaga las rejillas con agua desionizada.
    4. Tiñe las rejillas con una solución al 1% de acetato de uranilo (~ 20 μL) en agua destilada.
    5. Realiza un último enjuague con agua y deja que las rejillas se sequen completamente al aire.
    6. Obtener imágenes de las muestras mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para confirmar el tamaño y la morfología del sEV.

2. Fabricación de sustratos plasmónicos SERS 12,18,19

  1. Crear una monocapa de nanosfera
    1. Extienda esferas de poliestireno de 500 nm de diámetro sobre una superficie de agua dentro de una vaguada Langmuir-Blodgett.
    2. Comprime suavemente las esferas para formar una monocapa hexagonal compacta.
    3. Transfiere la monocapa de esfera a una oblea de Si de 4 pulgadas (con ~50 nm de SiOtérmico 2) sumergiendo la oblea en la canaleta y tirando lentamente hacia arriba.
  2. Matriz de nanosferas de grabado
    1. Reducir el diámetro de la esfera de 500 nm a ~250 nm usando un sistema de grabado por iones reactivos con plasma de oxígeno (flujo de gasO2 a 100 sccm, 50 s, 200 W de potencia). Para más detalles sobre el proceso de fabricación, consulte la publicación de nuestro trabajoanterior 12,18,19.
    2. Depositar una capa de 50 nm de Cr sobre la matriz de esferas reducidas mediante evaporación por haz de electrones a 1,5 Å por s.
    3. Levanta las esferas de poliestireno usando acetona para dejar una máscara de Cr perforada en la superficie deSiO 2 .
    4. Graba la capa deSiO 2 expuesta en las aberturas de Cr usando una mezcla de 25 sccm Ar, 25 sccm CHF3, con potencia RIE a 200W durante 2 minutos.
  3. Fabricar pirámides invertidas
    1. Sumerge la oblea en un KOH al 60% en peso a 60 °C durante 2 minutos para grabar fosas piramidales invertidas en el silicio.
    2. Quita la máscara de Cr usando un grabador de Cr durante 5 minutos.
    3. Retira la capa deSiO 2 con un grabador de óxido tamponado 6:1 hasta que se limpie completamente.
    4. Depositar una película de Au de 200 nm de forma conforme sobre las pirámides invertidas usando evaporación por haz de electrones.
  4. Finalizar el sustrato plasmónico
    1. Aplica epoxi de curado rápido (~1 mL) sobre un sustrato separado deSiO 2/Si. Presiona la oblea recubierta de oro sobre la resina epoxi para formar una estructura sándwich con la capa dorada en el centro.
    2. Despega la resina epoxi del molde de silicio para formar un sustrato plasmónico de Au independiente una vez que la epoxi se haya curado completamente.

3. Transferencia de grafeno a sustrato plasmónico

  1. Prepara la película de grafeno
    1. Preparar una solución deFeCl 3 de 1 M (se preparó una solución de 1 M de cloruro férrico anhidro disolviendo 81 g deFeCl 3 en agua desionizada y diluyéndola hasta un volumen final de 500 mL) para grabar el sustrato de cobre a partir de una lámina de grafeno monocapa recubierta con PMMA.
    2. Colocar la lámina de cobre recubierta de grafeno boca abajo sobre la superficie de la solución de FeCl3 hasta que el cobre esté completamente disuelto.
  2. Enjuague película de grafeno
    1. Usando una lámina de vidrio limpia, transfiere cuidadosamente la película de grafeno flotante a un baño maria desionizado para enjuagar los residuos de grabado.
    2. Repite este paso de enjuague tres veces.
  3. Transferir grafeno al sustrato
    1. Haz flotar el sustrato plasmónico SERS bajo la película de grafeno en el baño de agua DI final.
    2. Levanta suavemente el sustrato para que el grafeno se asiente uniformemente sobre su superficie.
    3. Seca al aire el sustrato recubierto de grafeno a temperatura ambiente durante 1 h.
    4. Transfiera a una cámara de vacío y seque bajo presión reducida a 180 °C durante 1 hora.
  4. Limpiar el sustrato final
    1. Sumerge el sustrato seco en un baño de acetona a 50 °C durante 1 hora para disolver el PMMA.
    2. Enjuaga el sustrato tres veces con alcohol isopropílico.
    3. Seque el sustrato plasmónico transferido con grafeno y limpiado en un desecador antes de su uso.

4. Preparación de muestras de SERS y adquisición de espectros

  1. Preparar la muestra sobre el sustrato
    1. Pipetear aproximadamente 5 μL de la muestra de sEV sobre el sustrato plasmónico adecuado.
      NOTA: Para cuantificar los sEVs cargados con fármacos, aplicar vesículas al sustrato de oro-grafeno. Para todos los demás experimentos, utiliza un sustrato plasmónico dorado simple.
    2. Coloca el sustrato en un desecador y deja que la gota se seque completamente (~15 min).
  2. Calibrar sistema Raman
    1. Transfiere el sustrato a un microscopio Raman confocal.
    2. Inicia la recogida de datos utilizando el software del instrumento (WiRE versión 4.4).
    3. Ajusta el láser de excitación a 785 nm a 5 mW.
    4. Calibra el sistema alineando el pico de referencia de silicio a 520 cm-1.
  3. Obtener espectros de sustrato dorado (diagnóstico)
    1. Realizar un escaneo de exploración en un área de 300 μm × 300 μm para localizar vesículas individuales usando modo estático con los siguientes ajustes: 50% de potencia, exposición de 0,1 s, paso de 10 μm.
    2. Después de localizar los sEVs, realiza un mapeo de alta resolución en modo estático dentro de una cuadrícula de 5 × 5 usando los siguientes ajustes: paso de 1 μm, 50% de potencia, 0,2 s de exposición por punto.
  4. Obtener espectros de sustrato de grafeno (terapéuticos)
    1. Realizar un escaneo de exploración en un área de 300 μm × 300 μm para localizar vesículas individuales usando modo estático con los siguientes ajustes: 50% de potencia láser, exposición de 0,1 s, tamaño de paso de 10 μm.
    2. Realizar mapeo de alta resolución en modo extendido con una cuadrícula de 2 × 2 usando los siguientes ajustes: tamaño de paso de 1 μm, potencia láser del 1%, exposición de 10 s.

5. Preprocesamiento de datos

  1. Realizar control espectral de calidad
    1. Filtrar los espectros iniciales en bruto para excluir señales muy ruidosas o espectros con formas anormales.
    2. Eliminar picos aislados de rayos cósmicos mediante detección basada en umbral o filtrado por desviación local.
  2. Filtrar y normalizar espectros
    1. Aplica un filtro Savitzky-Golay a cada espectro para reducir el fondo de fluorescencia y suavizar los datos.
    2. Calcula la relación señal-ruido (SNR) de cada espectro, normalmente utilizando el método de la relación pico-línea base o el método de desviación estándar. Para explicar mejor, normalmente la SNR para cada espectro se calculaba como la relación entre la intensidad máxima (tras la resta de la línea base) en una banda Raman representativa y la desviación estándar del ruido. El ruido se estimó a partir del espectro residual obtenido restando una versión suavizada por Savitzky-Golay del espectro (tamaño de ventana = 11, orden polinómico = 3) del espectro original, aislando así las fluctuaciones de alta frecuencia. Para determinar empíricamente un umbral adecuado de SNR, todos los espectros se clasificaron en orden ascendente de SNR, y se evaluó la persistencia de picos bioquímicos característicos —específicamente la banda de fenilalanina (~1002 cm-1 , aminoácido), la banda de amida I (~1650 cm-1 , proteína) y la banda de deformaciónCH2 (~1440 cm-1 , lípido) a lo largo de los espectros clasificados. El umbral se estableció en el punto en que cualquiera de estos picos diagnósticos desaparecía consistentemente en el ruido base. Para nuestro sustrato SERS de nanopirámide de oro y parámetros de adquisición (excitación de 785 nm, potencia láser de 5 mW, integración de 0,2 s), esto correspondió empíricamente a un umbral de SNR de 28.
    3. Excluye cualquier espectro que esté por debajo del umbral SNR según lo decidido según el 5.2.2 arriba. En nuestro flujo de trabajo, los espectros con un SNR inferior a 28 fueron excluidos del conjunto de datos de entrenamiento, ya que establecer el umbral a este nivel garantiza que solo se conserven espectros de alta calidad para el análisis posterior y la mejora de la robustez del modelo.
    4. Normaliza cada espectro a la intensidad máxima o al área total bajo la curva.

6. Análisis espectral con aprendizaje automático

  1. Entrena el modelo
    1. Asigna una etiqueta a cada medición espectral correspondiente a su origen (por ejemplo, paciente con cáncer gástrico vs. control sano).
    2. Introduce los datos espectrales en un Clasificador de Vectores de Soporte (SVC) con un núcleo lineal.
    3. Usa una división estratificada de mezcla para la validación cruzada en 5 ocasiones.
    4. Promedia las métricas de precisión de cada pliegue para evaluar el rendimiento del modelo.
  2. Reducir la dimensionalidad y clasificar
    1. Utiliza el Análisis Discriminante Lineal (LDA) para visualizar datos SERS de alta dimensión en dimensiones reducidas.
    2. Utiliza el modelo LDA para la clasificación directa entre grupos muestrales.
  3. Evaluar el modelo
    1. Evalúa los modelos entrenados en un conjunto de muestras cegadas de pacientes para simular un escenario diagnóstico real. Para más información, por favor consulte estas publicaciones de nuestro grupo13, 15 y 22.
      NOTA: Realiza todos los pasos con herramientas limpias en un entorno libre de polvo. El grafeno monocapa se cultivaba o se obtenía sobre un sustrato de cobre y se recubría con una capa de PMMA para protegerlo durante la transferencia.

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Resultados

La implementación exitosa del protocolo SERS de una sola vesícula produce espectros Raman distintos respecto a los sEVs individuales, permitiendo la clasificación diagnóstica posterior y el monitoreo de la carga terapéutica de fármacos. La Figura 1 muestra el flujo de trabajo del estudio diagnóstico para el cáncer gástrico y la aplicación de monitorización de sEVs cargada con fármacos utilizando nuestro protocolo aquí reportado, respectivamente.

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Discusión

Un aspecto fundamental de este protocolo es la preparación del sustrato y la purificación del sEV. El rendimiento de los SERS sin etiqueta depende en gran medida de producir sustratos plasmónicos uniformes y de alto nivel conformal con un "punto caliente" de realzamiento fuerte. Del mismo modo, el aislamiento de sEV de alta pureza mediante cromatografía de exclusión de tamaño es esencial para obtener espectros SERS fiables y reproducibles. Impurezas como agregados proteicos o li...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de interés relacionados con esta obra.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio 4UH3TR002978-03 y 1U18TR003778-01, y por una subvención del Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (Número de subvención TRAN1-14649).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBSThermo Fisher ScientificJ61196. AP
Rejilla de cobre de 300 mallasCiencias de la Microscopía ElectrónicaEMS200-Cu
Solución de paraformaldehído al 4%Sigma Aldrich1004960700
4 y Prime; Si wafers MSE SuministrosWA0810(100) orientado 
Línea celular A549ATCCCCL-185 
Línea celular de AGSATCCCRL-1739
Rotor de centrífuga F-35-6-30, 5430Eppendorf22654306
CHA Mark 40CHA Mark 40https://chaindustries.com/mark-40-system/Evaporación de haz de energía
Solución de cr grabadorSigma Aldrich651826-500ML
Doxorubicina  D-4000Laboratorios LCD-4000_3g
Sistema ExoView R100 y ExoView Human Tetraspanin KitNanoView Bioscienceshttps://www.nowmedicalstudios.
com/portfolio/nanoview-
biosciences-3d-product-illustrations
Solución FeCl3Sigma Aldrich451649
Solución HFSigma Aldrich695068-500ML
Hs 738.St/Int línea celularATCCCRL-7869
en Microscopio Raman confocalRenishawhttps://www.renishaw.com/en/
invia-confocal-raman-microscopie
--6260?srsltid=AfmBOoqbZlyW
qv2KDdcXV0UZnp8tdLNgYZ0
GbZvGOWI6z1OKi48rg5-b
Solución KOHSigma Aldrich417661
Shakers de mesa MaxQ 4000 para incubar/refrigerarTermo CientíficaSHKA4000 (4320)
Incubadora MCO-19AICSANYO8380-30-0035
Filtro Millex-GPMilliporeSigmaSLGPM33RS  0,22 & micro; m
Microscopio NanoSEM 230FEISEM-FEI-014 
Nanosight NS300Malvern Panalyticalhttps://www.malvernpanalytical
.com/en/support/producto-soporte
/nanosight-rango/nanosight-ns300
Línea celular NCI-N87ATCCCRL-5822
Optima TLX UltracentrífugaBeckman Coulter8043-30-1197
Oxford Plasmalab 80 PlusOxford Plasmalabhttps://plasma.oxinst.com/
Productos/RIE/Plasmapro-800-RIE
Esferas de poliestirenoAlfa AesarAA42711AB500 nm
qEVoriginal/35 nmIzonICO-35
Grafeno de capa únicaMSE SuministrosME0408
Matraz T-75VWR156800
TF20 EM de alta resoluciónFEIhttps://eicn.cnsi.ucla.edu/project/fei-tf20-tem/
Solución de acetato de uraniloCiencias de la Microscopía Electrónica22400-1

Referencias

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