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Evaluación de la motilidad gastrointestinal en mutantes de Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 como herramienta para estudiar la enfermedad de Parkinson en los primeros años

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DOI:

10.3791/69278

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28 de noviembre de 2025

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1Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 2Danish Research Institute of Translational Neuroscience-DANDRITE, Nordic-EMBL Partnership for Molecular Medicine, Aarhus University, 3Group of Nanoparticles and Nanocomposites, Institut de Ciència de Materials de Barcelona (ICMAB-CSIC), 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institut de Neurociències, Faculty of Medicine, M2, Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), 5Faculty of Medicine, University of Vic-Central University of Catalonia (UVic-UCC), Institute for Research and Innovation in Life Sciences and Health in Central Catalonia (IRIS-CC)

En este artículo

Resumen

Este protocolo detalla un ensayo cuantitativo de defecación en el joven mutante RAC1/ CED-10 Caenorhabditis elegans, proporcionando un modelo sencillo para estudiar los estadios de la enfermedad prodrómica de Parkinson. Supera las limitaciones de otros modelos animales y facilita la prueba de estrategias terapéuticas dirigidas a la patología parkinsoniana temprana.

Resumen

La enfermedad de Parkinson (EP) es uno de los trastornos neurodegenerativos más prevalentes y se diagnostica en función de síntomas motores que aparecen tras una pérdida significativa de neuronas dopaminérgicas. Los síntomas no motores, como el estreñimiento, son los más comunes y suelen aparecer antes, indicando el inicio de la enfermedad. Se utilizan muchos modelos animales para estudiar enfermedades neurodegenerativas, aunque la mayoría se centra en las etapas avanzadas. Debido a que es difícil determinar el inicio exacto de la neurodegeneración, ningún modelo único representa completamente toda la progresión de la enfermedad. Los modelos de mamíferos son especialmente costosos y costosos debido a sus largos ciclos de vida. En cambio, Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo transparente de 1 mm con un ciclo vital y reproductivo corto (~3 semanas y 3 días), permite experimentos más rápidos y rentables gracias a su rápida renovación generacional. El programa motor de defecación en C. elegans consiste en ciclos rítmicos regulados por una compleja red genética en la que participan las GTPasas Rho/rac, y RAC1 (CED-10 en C. elegans) es uno de ellos. Hemos demostrado que los mutantes RAC1/CED-10 presentan morfología y función GABAérgica comprometidas, lo que provoca ciclos de defecación alterados. Aquí presentamos el protocolo experimental para medir el estreñimiento en RAC1/CED-10 C. elegans en las primeras fases. Además de servir como herramienta predictiva para investigar los síntomas tempranos de la EP antes de la neurodegeneración, este protocolo también podría emplearse como un punto final temprano para evaluar la eficacia de la intervención farmacológica. Como estos cambios no son específicos de cada enfermedad, creemos que este modelo proporciona una herramienta valiosa para investigar alteraciones que surgen temprano en otras enfermedades.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común y una de las principales causas de discapacidadneurológica 1,2. Sus características patológicas incluyen cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy, compuestos principalmente por α-sinucleína, junto con pérdida neuronal en la sustancia negra y otras regionescerebrales.

Clínicamente, la EP se clasifica como un trastorno del movimiento, pero también se caracteriza por un amplio espectro de síntomas no motores. Las alteraciones motoras surgen de la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y la disminución de dopamina estriatal. Sin embargo, los síntomas no motores —como el estreñimiento, la ansiedad y el trastorno conductual del sueñoREM— suelen aparecer años antes, durante la fase prodrómica, cuando la neurodegeneración afecta a estructuras extranigral (por ejemplo, tronco encefálico, sistema olfativo y vías autonómicas).

Un gran desafío en la investigación sobre la EP es el retraso clínico: los síntomas motores suelen aparecer solo después de que se pierdan entre el 60% y el 80% de las neuronas dopaminérgicas3, momento en el que la intervención terapéutica es menos eficaz. Los síntomas no motores tempranos (por ejemplo, disfunción autonómica) podrían servir como biomarcadores para la DPprodrómica 6, pero su no especificidad complica un diagnóstico definitivo. Dadas estas limitaciones, los modelos animales son esenciales para estudiar las etapas tempranas de la EP, estandarizar la caracterización de los síntomas y desarrollar terapias neuroprotectoras —actualmente inexistentes— que podrían ralentizar o prevenir la neurodegeneración.

RAC1/CED-10 Los mutantes de C. elegans recapitulan características clave de las etapas tempranas y avanzadasde la PD 6. Anteriormente demostramos que la actividad de RAC1 es fundamental para la supervivencia y función de las neuronas dopaminérgicas, protegiendo contra la toxicidad inducida porα-sinucleína 7. Además, los mutantes RAC1/CED-10 presentan alteraciones fenotípicas similares a las de Parkinson temprana, incluyendo desregulación del metabolismo lipídico y disfunción GABAérgica, esta última reflejada en ciclos de defecaciónalterados 6. Estos hallazgos establecen a los mutantes RAC1/CED-10 como un modelo manejable para estudiar la fisiopatología predegenerativa de la EP.

Aquí describimos un ensayo optimizado de defecación para mutantes RAC1/CED-10, que captura cuantitativamente la dismotilidad intestinal, permitiendo el estudio sistemático de las características gastrointestinales durante la fase prodrómica de la EP.

Protocolo

NOTA: Tipo salvaje: se usó el N2 Bristol. Modelo de los primeros PD RAC1/CED-10: La cepa BR3579 está genotipada ced-10(n3246) y se denomina RAC1/CED-10 aquí. Fue un generoso regalo del Dr. Ralf Baumeister (Universidad Albert-Ludwig, Friburgo/Brisgovia, Alemania). Esta variante de ced-10 (N3246) es un alelo fuerte. La mutación ced-10(n3246) es una transición de G a A que resulta en un cambio de glicina 60 de CED-10 a arginina (G60R), lo que da lugar a una función alteradano nula 8,9. La gravedad de este alelo es más fuerte en comparación con otros alelos CED-10. Se utilizaron hermafroditas durante todo el estudio.

1. Mantenimiento de gusanos

  1. Vierte 25 mL de medio de crecimiento de nematodos (NGM) en placas de Petri de 150 mm y deja que el agar se solidifique. Siembra cada placa con 500 μL de un cultivo OP50 de Escherichia coli , distribuyendo la suspensión de manera uniforme por la superficie del agar. Incuba las placas a 30 °C durante la noche para permitir el crecimiento bacteriano. Prepara los platos 24 horas antes de su uso.

2. Obtención sincronizada de gusanos en la cuarta etapa del desarrollo larvario (L4)

  1. Realizar mediciones de la motilidad intestinal con gusanos sincronizados en la etapa larvaria L4. Para obtener gusanos en esta etapa de desarrollo, sigue el protocolo de blanqueamiento descrito a continuación (adaptado del 11) con ligeras modificaciones relacionadas con el fenotipo11 de RAC1/CED-10.
  2. Añade 10 adultos grávidos a las placas NGM con Escherichia coli OP50, preparado como en el paso 1, para poner huevos y dejar que los gusanos crezcan durante 3 días. Alternativamente, transfiere un trozo de agar de una placa NGM que contiene una población mixta a una nueva placa NGM. En este caso, el control del ciclo de vida no es tan preciso como cuando se utilizan 10 adultos grávidos. Después de 80 h, se observó una población mixta de hermafroditas de C. elegans con adultos grávidos en el caso de tipos salvajes. Los mutantes RAC1/CED-10 mostraron 6 horasde desarrollo 6 retrasado, por lo que los adultos grávidos aparecieron a las 86 horas.
    NOTA: Los adultos grávidos se identifican porque tienen huevos en su interior.
  3. Lava placas con 10 mL de M9 para recuperar adultos grávidos en tubos de 15 mL (etiquetados con el genotipo correspondiente).
  4. Pelleta los gusanos centrifugándolos durante 2 minutos a 2000 x g (~1500 rpm en una centrífuga de mesa estándar) a temperatura ambiente, descarta el sobrenadante y añade 10 mL de tampón M9 fresco.
    NOTA: Aunque funciona a temperatura ambiente, observamos mejores resultados centrifugando a 10 °C.
  5. Realiza el paso 2.4 3 veces o hasta que el tampón parezca libre de bacterias (sobrenadante transparente). La presencia de bacterias puede inferirse por el hecho de que el sobrenadante aparece ligeramente amarillento y turbio.
  6. Añadir el buffer M9 a un volumen total de 3,5 mL.
    NOTA: En nuestra experiencia, se puede usar agua destilada estéril —o incluso agua del grifo— en esta fase sin introducir contaminación, ya que el proceso de blanqueo posterior elimina cualquier microbio. Sin embargo, recomendamos el agua amortiguadora M9 o estéril para garantizar la reproducibilidad en laboratorios.
  7. Mezcla 0,5 mL de NaOH 5M con 1 mL de lejía para preparar la solución blanqueadora. Prepara esta solución fresca justo antes de usarla. Añade 1,5 mL de la mezcla al tubo de la centrífuga que contiene lombrices.
  8. Agita vigorosamente los tubos durante el blanqueo mientras monitoriza la destrucción del tejido adulto bajo un microscopio disecante. Detén la reacción tan pronto como solo queden rastros de adultos.
    NOTA: El tratamiento blanqueador lisa gusanos adultos y larvas, mientras que los embriones permanecen viables porque su cáscara de huevo los protege del lejía. Este paso es fundamental para conseguir supervivientes. Un exceso de tiempo puede matar a todos los gusanos. Se recomienda encarecidamente usar un vórtice, pero luego revisar la destrucción de la cutícula cada 3 minutos. Los mutantes RAC1/CED-10 son más sensibles al lejía. Controla la desintegración del tejido adulto cada 2 minutos y nunca superes los 8 minutos.
  9. Detiene la reacción añadiendo buffer M9 para llenar el tubo (~15 mL). Centrifuga rápidamente (ya que el tratamiento puede seguir activo) durante 1 minuto a 2.000 x g y descarta el sobrenadante.
  10. Lava el pellet 3 veces llenando el tubo con buffer M9 y centrifugando como se ha descrito antes. Tras el lavado final, retirar cuidadosamente el sobrenadante hasta que queden aproximadamente 0,1 mL.
  11. Añade estos huevos a un tubo nuevo de 15 mL y añade M9 a 5 mL. Incuba a temperatura ambiente con una rotación suave. Se debe proporcionar una aireación adecuada.
    NOTA: Obtuvimos buenos resultados de sincronización usando agua del grifo en lugar de M9 en todos los pasos excepto en el paso 2.9.
  12. Después de 24 horas, detener la rotación y pelletar las lombrices centrifugando a 2.000 x g durante 1 minuto a 10 °C.
  13. Placa de 30-50 μL de gusanos en pellets de los genotipos correspondientes en placas NGM de 150 cm sembradas con OP50 y marcadas con el genotipo correspondiente. Varios gusanos RAC1/CED-10 parecían muertos, como propiedad intrínseca del genotipo RAC1/CED-10 (observación personal). En consecuencia, placar el doble volumen de estos mutantes y monitorizarlos al día siguiente.
    NOTA: El volumen de lombrices en placas depende del rendimiento del protocolo de blanqueo. Nunca superes el número de 250 gusanos por plato, ya que la comida se acabará más rápido y los gusanos podrían entrar en hambre. La diferencia en el tiempo de revelado podría aprovecharse sabiamente para registrar los primeros ciclos de defecación de gusanos salvajes y luego RAC1/CED-10 (véase la siguiente sección).
  14. Revisa la presencia de gusanos silvestres en la etapa L4 del desarrollo larval tras 34 horas de incubación. La misma etapa de desarrollo para los gusanos RAC1/CED-10 se alcanzará en 40 horas6. Distingue a los gusanos L4 de los L3 y de los adultos jóvenes midiendo su tamaño (~650 μm) y comprobando su estructura vulva12 similar a la de la luna.

3. Registro de la motilidad intestinal

  1. Lava las placas con 3 mL de M9 para recuperar los gusanos L4 en dos tubos centrífugos de 1,5 mL.
  2. Centrifugar a 2.000 x g durante 1 minuto (Figura 1A), descartar el sobrenadante y añadir 1 mL de tampón M9 fresco. Repite el paso 3 veces.
  3. Emplacar estos lombrillos lavados en una placa NGM sin OP50 (Figura 1B). Con estos pasos de lavado y de placado final, elimina el exceso de bacterias.
  4. Transfiere las lombrices individualmente a placas de 12 pozos con 5 μL sembrados de bacterias OP50 (Figura 1C). Permite que los gusanos se adapten durante 1 hora a 20 °C.
    NOTA: Estas placas se sembraron y se dejaron secar antes de añadir las lombrices. Es mejor no preparar estas placas con antelación, ya que el crecimiento excesivo de bacterias puede dificultar la visualización del ciclo de defecación.
  5. Coloca las placas de 12 pocillos con gusanos bajo el microscopio, localiza un gusano y comienza a grabar. Registrar ciclos de defecación durante 15 minutos (15 ciclos; Figura 1D). Utiliza un objetivo 5x para obtener imágenes con una cámara que ofrezca una resolución de 12 bits y una tasa de 60 fotogramas por segundo (fps). Realiza la adquisición de vídeo usando la herramienta de recorte en Windows. Empieza la grabación cuando detectes el primer ciclo de defecación.
    NOTA: Si el microscopio está conectado a un ordenador, puedes grabar la pantalla directamente con la Herramienta de Corte. Recomendamos encarecidamente tener un cronómetro informático para el control del ciclo de defecación. Haz clic en el botón Vuelos cada vez que termina el ciclo de defecación.

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Figura 1: Diagrama esquemático del protocolo experimental para medir la motilidad intestinal. (A) Gusanos sincronizados en la etapa L4 de desarrollo. Estos gusanos se recogieron y lavaron 3 veces con M9. (B) Los gusanos lavados se emplacaron en placas NGM sin OP50. (C) Los gusanos se recogieron individualmente en una placa de 12 pozos con OP50 y se dejaron arrastrarse durante 1 hora a 20 °C. Durante este tiempo, los gusanos se adaptan al nuevo medio y se relajan del estrés de la transferencia. (D) Se registraron gusanos individuales durante 15 minutos para analizar la motilidad intestinal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Análisis del ciclo de defecación

NOTA: En C. elegans, el programa motor de defecación comprende ciclos rítmicos orquestrados por una compleja red genética. Este programa consta de tres contracciones musculares secuenciales y distintas, cada una fácilmente detectable bajo un microscopio de disección. El primer paso consiste en la contracción de los músculos posteriores de la pared corporal (pBoc), seguida por la contracción de los músculos de la pared anterior del cuerpo (aBoc) y, finalmente, por las contracciones del músculo entérico (EMC), que resultan en la expulsión del contenido intestinal (Exp)13 (Figura 2).

  1. Realizar experimentos a 20 °C. Una vez que se graben todos los vídeos, comienza el análisis de datos.

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Figura 2: Ciclo de defecación en mutantes RAC1/CED-10 de C. elegans. Una representación diagramática del ciclo de defecación de C. elegans en nematodos mutantes RAC1/CED-10. pBoc denota la contracción de la musculatura de la pared posterior del cuerpo; aBoc denota la contracción de la musculatura de la pared anterior del cuerpo, y EMC + EXC corresponde a la eyección del contenido intestinal. En animales salvajes que se alimentan sin molestar, este programa motor se inicia cada 45 segundos con una regularidadmuy alta de 18. Los gusanos están orientados con la cabeza orientada hacia la izquierda y la cola hacia la derecha. La excreción (EXC) está resaltada en naranja. Esta cifra ha sido modificada desde6. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Análisis de vídeo

  1. Abre un vídeo con un programa reproductor de vídeo.
    NOTA: Usamos Windows Media Player Legacy v12. Se pueden usar otros programas de reproductor de vídeo.
  2. Prepara el archivo de la hoja de cálculo. Abre el archivo de plantilla proporcionado (Tabla Suplementaria 1). Introduce el nombre del archivo de vídeo y el tamaño del gusano (opcional) en los campos designados, y luego inicia la reproducción del vídeo.
  3. Define y registra la primera excreción. Define el tiempo cero como el momento en que comienza la grabación cuando se colocan gusanos bajo el microscopio. Observa la región del ano del gusano e identifica el primer evento de excreción. Anota el tiempo (en s) de este evento en la celda etiquetada como Primera Excreción de la hoja de cálculo.
    NOTA: El tiempo de la primera excreción variará entre gusanos (por ejemplo, Gusano 1 = 5 s, Gusano 2 = 26 s, Gusano 3 = 34 s) porque se desconoce el momento de la última excreción antes de la grabación.
  4. Registrar los eventos de excreción posteriores: Continuar la reproducción y documentar cada excreción de forma secuencial (Excreción 2, Excreción 3, etc.) hasta que se hayan introducido un total de 16 excreciones.
  5. Calcular intervalos de ciclo: La plantilla determina automáticamente el intervalo entre excreciones consecutivas (por ejemplo, Excreción 2 - Excreción 1; Excreción 3 - Excreción 2; ...). Utiliza estos intervalos como la duración del ciclo.
  6. Determinar el tiempo total del ciclo: Una vez registrados los 16 eventos, la plantilla calcula el tiempo necesario para que el gusano complete los 15 ciclos. Este valor se muestra en la celda etiquetada como Tiempo Total de la hoja de cálculo. Repite este proceso para cada gusano.
    NOTA: Actualmente, ningún software automatizado detecta de forma fiable los ciclos de defecación en C. elegans. Aunque plataformas como WMicrotracker son eficaces para cuantificar parámetros de movimiento (velocidad, distancia recorrida, número de gusanos o tamaño corporal14,15), no proporcionan la resolución necesaria para monitorizar la región del ano e identificar eventos de contracción o excreción. Por lo tanto, sigue siendo necesario la puntuación manual, similar a la limitación observada en los ensayos de bombeofaríngeo 16.

6. Mediciones de la longitud del ciclo

  1. Duración del ciclo de puntuación como el tiempo entre dos excreciones consecutivas. Calcular restando el tiempo final de un ciclo del tiempo final del siguiente ciclo, como se explica en la Tabla 1 y la Ecuación 1.
    Duración del ciclo (n) (en segundos) = Excreción temporal (n+1) - Excreción temporal (n) Ecuación 1
    Duración del ciclo (1s) = 66 s ((excreción temporal 2 = 71 s) - (excreción temporal 1 = 5 s))
  2. Para cada conjunto de datos, calcula el periodo medio del ciclo de defecación, la desviación estándar (DE) y el error estándar de la media (SEM) utilizando un software de análisis estadístico.

7. Ritmicidad o regularidad del ciclo de defecación

  1. El coeficiente de variación (CV) se utiliza para describir la variabilidad relativa y explica cómo se distribuyen los datos en comparación con la media. Se ha utilizado anteriormente como indicador de la regularidad del ciclo de defecación en C. elegans6. Calcula el CV de cada gusano aplicando la Ecuación 2.
    figure-protocol-3 Ecuación 2
  2. Para cada deformación de C. elegans , se calcula la media de la CV, la desviación estándar (DE) y el error estándar de la media (SEM) utilizando un software de análisis estadístico.

8. Análisis estadístico

  1. Realizar experimentos en tres réplicas independientes, analizando cinco gusanos por condición. Evalúa la normalidad de los datos usando la prueba de Shapiro-Wilk (α=0,05), que se recomienda para n < 50.
  2. Dado que las mediciones de longitud de ciclo no siguieron una distribución normal, el análisis se realizó con la prueba de Mann-Whitney no paramétrica, que es muy adecuada para detectar diferencias en medianas con tamaños de muestra pequeños. Por el contrario, los datos CV (%) se distribuyen normalmente; analízalos usando una prueba t no emparejada con corrección de Welch para tener en cuenta varianzas desiguales.
  3. Realiza todos los análisis estadísticos utilizando software de análisis estadístico. Para experimentos que incluyan más de dos cepas, se aplica una prueba alternativa, como ANOVA unidireccional, con verificación continua de la distribución de la muestra.

Resultados

El ensayo basado en vídeo descrito se implementó en el modelo RAC1/CED-10 de C. elegans de la DP temprana para evaluar cuantitativamente la motilidad intestinal. Dado el retraso en el desarrollo de los mutantes RAC1/CED-10, se ajustaron las poblaciones sincronizadas para asegurar comparaciones de etapas con controles de tipo salvaje. Se registraron gusanos individuales en la etapa L4 y se analizaron 15 ciclos consecutivos de defecación para determinar la duración y regularidad del ciclo. Este enfoque permite una medición precisa y de alta resolución de la función motora intestinal y permite la detección de alteraciones sutiles no motoras asociadas con fenotipos tempranos de la EP en C. elegans.

Retraso en el desarrollo en animales RAC1/CED-10 para experimentos sincronizados

Dado el retraso en el desarrollo observado en el mutante 6 de C. elegans RAC1/CED-10, los experimentos de sincronización realizados en paralelo con animales salvajes requieren ajuste temporal. Para compensar este retraso y asegurar comparaciones de etapas durante la grabación de vídeo, los animales RAC1/CED-10 fueron emplacados 6 horas antes que los controles salvajes el mismo día.

Gusanos RAC1/CED-10 para investigar alteraciones en la defecación asociadas con la enfermedad de Parkinson

El estreñimiento puede detectarse tan pronto como dos décadas antes del diagnóstico de MP motora, lo que la convierte en uno de los primeros signos reconocibles que indican el inicio de laenfermedad 17. Anteriormente hemos demostrado que el modelo RAC1/CED-10 presenta alteraciones no motoras en la etapa de desarrollo L4, antes del inicio de la neurodegeneración6, y la motilidad intestinal alterada es una de ellas. Como se describe en el Protocolo, se registraron gusanos individuales en la etapa L4. La Figura 3 muestra un gusano representativo RAC1/CED-10.

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Figura 3: Ciclo de defecación de C. elegans en imágenes de animales mutantes RAC1/CED-10. Ciclo de defecación en mutantes RAC1/CED-10 en imágenes. Los gusanos están orientados de cabeza hacia abajo. Las regiones de la cola, resaltadas en cuadros horizontales, muestran la secuencia de pasos motores de defecación tal como se describe enel 6 y se esquema en la Figura 2: (A) tracto anterior relajado, (B) contracción posterior del cuerpo (pBoc), (C) contracción del cuerpo anterior (aBoc) y (D) contracción del músculo entérico con expulsión (EMC+EXC). La duración del ciclo se indica a continuación. Las flechas marcan material expulsado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Los dos parámetros utilizados para analizar la motilidad intestinal son la duración del ciclo y la regularidaddel ciclo 13. Primero, medimos 15 ciclos de cada gusano, representados en la Figura 4.

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Figura 4: Duración del ciclo de los tipos salvajes (A) y de los individuos RAC1/CED-10 (B). Los sets 1, 2 y 3 indican réplicas independientes. Cada punto representa un ciclo de defecación, y hay 15 ciclos por gusano. El W2 rosa en B fue descartado para un análisis posterior porque no completó los 15 ciclos. W = gusano. No se realizó análisis estadístico en esta figura. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Los gusanos individuales se designaron con W (W1, W2, etc.) a lo largo de los diferentes réplicas experimentales (Set = 1, 2, 3). Para cada gusano (W), se realizaron 15 mediciones en 15 minutos. En el primer conjunto de experimentos con animales de tipo salvaje (Figura 4A, Conjunto 1), se excluyó un gusano porque era un adulto joven en lugar de un L4. En el caso de RAC1/CED-10, se descartó un gusano porque, tras procesar los datos, no completó 15 ciclos en 15 minutos. Por ello, recomendamos usar la aplicación de reloj para saber cuántos ciclos se han completado, ya que los gusanos RAC1/CED-10 eran bastante irregulares.

A partir de estos valores individuales, se calcularon la media y la desviación estándar de la longitud del ciclo para gusanos de tipo salvaje y mutantes RAC1/CED-10 (Tabla 1 y Figura 5). Como se publicóanteriormente 6, los gusanos RAC1/CED-10 presentan ciclos más largos y menos regulares que los gusanos silvestres. Los gusanos de tipo salvaje muestran ciclos más cortos (46 s ± 5 s) que los mutantes RAC1/CED-10 (55 s ± 12 s).

Tabla 1: Conjunto representativo de mediciones del ciclo de excreción para gusanos individuales. La tabla resume datos representativos recogidos de tres animales. Para cada gusano, el conjunto de datos incluye el identificador del archivo de vídeo, el tamaño corporal (μm), los puntos temporales (en s) correspondientes a eventos individuales de excreción, las longitudes de ciclo calculadas a lo largo de 15 ciclos consecutivos y la duración total de la grabación. La duración del ciclo se obtuvo restando puntos consecutivos de tiempo de excreción (por ejemplo, para el gusano VID_154028, la duración del primer ciclo fue de 66 s, calculada como 71-5 s). Las entradas restantes ilustran mediciones similares para dos gusanos adicionales, proporcionando ejemplos de variabilidad típica dentro del conjunto de datos. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

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Figura 5: Parámetros del ciclo de defecación. (A) Duración del ciclo de defecación y (B) Promedio de CV de gusanos silvestres y RAC1/CED-10. Los datos representan la media ± SD. N=3 n=5. Se aplicó la prueba de Mann-Whitney no paramétrica para la duración del ciclo de defecación. Se aplicó la prueba t no emparejada con la corrección de Welch para los datos de la media de la CV. p < 0,001 * p < 0,05. Consulte el paso 8 para información de análisis estadístico. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La regularidad del ciclo se calcula usando el coeficiente medio de variación (CV), que es la media de los coeficientes de variación para cada gusano en elexperimento 18. La Figura 5B muestra una mayor variabilidad en los animales mutantes RAC1/CED-10 en comparación con los animales salvajes. La media de la CV es del 6% ± 2% en los tipos salvajes, comparado con el 11% ± 6% en mutantes RAC1/CED-10.

Tabla suplementaria 1: Plantilla para el cálculo de la duración del ciclo de defecación en Caenorhabditis elegans. Los usuarios deben introducir el nombre de cada archivo de gusano en la primera columna y pueden registrar opcionalmente la longitud del cuerpo del gusano. El tiempo (en s) correspondiente a cada evento de excreción (excreción 1-16) se introduce secuencialmente según se determine a partir de la reproducción de vídeo. La plantilla calcula automáticamente el intervalo entre excreciones consecutivas (Excreción temporal N - Excreción temporal N-1), representando la duración del ciclo de defecación. Una vez introducidos 16 eventos de excreción, el tiempo total requerido para completar quince ciclos completos se calcula y se muestra automáticamente en la celda de Tiempo Total (mm:ss). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

C. elegans como un modelo poderoso para estudiar la DP prodrómica

Aunque la mayoría de los modelos de enfermedades neurodegenerativas se centran en la patología en faseavanzada 19, estudiar el inicio precoz de la enfermedad sigue siendo técnicamente un reto. Los modelos tradicionales de mamíferos, como ratones, ratas o primates, están limitados por ciclos de vida largos y altos costes. El nematodo microscópico C. elegans supera estas limitaciones gracias a su esperanza de vida de 3 semanas, ciclo reproductivo de 3 días y manejabilidad genética, lo que lo convierte en un sistema ideal para estudios eficientes y a gran escala de laneurodegeneración 6.

El mutante RAC1/CED-10 de C. elegans ofrece tres ventajas clave para estudiar la patogénesis temprana de la EP. En primer lugar, su resolución temporal precisa permite que los eventos neurodegenerativos se sigan a lo largo de etapas de desarrollo biendefinidas 6. En segundo lugar, el modelo ofrece una versatilidad experimental excepcional gracias a la traabilidad genética, los bajos requerimientos de mantenimiento y la compatibilidad de alto rendimiento 6,7. Tercero, dado que C. elegans carece de un homólogo endógeno α-sinucleína, incluido el modelo RAC-1/CED-10, proporciona una ventaja valiosa. Los investigadores pueden examinar mecanismos preclínicos de la EP sin interferencia α-sinucleína, que marca etapasmás avanzadas 6. Esto posiciona al modelo como una excelente herramienta para estudiar eventos patógenos iniciales y para la posterior integración de la expresión de α-sinucleína para investigar la patogénesis avanzada. Finalmente, la conservación evolutiva de la homología de CED-10 con RAC1 humano asegura la relevancia traslacionaldirecta 10,20.

El modelo de C. elegans descrito aquí es muy adecuado para ensayosfarmacológicos 17,21. Debido a que los mutantes RAC-1/CED-10 presentan retraso en el desarrollo, no es posible el cegamiento en el primer paso, ya que su identidad no puede ocultarse en relación con el tipo salvaje. Sin embargo, para los cribados farmacológicos, el sesgo puede minimizarse adoptando un diseño doble ciego en el que el experimentador que recoge los datos y la persona que los analiza no conocen todas las variables experimentales.

El estreñimiento afecta a casi todos los pacientes con EP durante la fase prodrómica, a menudo precediendo a los síntomas motores5. C. elegans ofrece ventajas únicas para estudiar esta disfunción gastrointestinal temprana. A diferencia de los modelos de mamíferos que requieren intervenciones invasivas, la transparencia y simplicidad del nematodo permiten una observación no invasiva y en tiempo real de su programa motor de defecación altamente estereotipado, una característica fundamental para cuantificar defectos de motilidad intestinal. El corto ciclo de vida y la rítmicidad precisa de la defecación de C. elegans permiten un análisis rápido y reproducible de las deficiencias funcionales. En mutantes RAC1/CED-10, las desviaciones en el momento de la defecación reflejan fenotipos similares al estreñimiento observados en el prodrómicoPD 6. Estos hallazgos proporcionan un marco fundamental para una validación posterior en mamíferos complejos (por ejemplo, ratones, primates), vinculando directamente la señalización de RAC1 con la disfunción entérica.

Más allá de su relevancia mecanicista, el modelo RAC1/CED-10 también ofrece utilidad traslacional. El ensayo de defecación es sencillo, reproducible y escalable, lo que lo hace adecuado para el cribado de drogas en fases tempranas. Los compuestos que normalizan el tiempo o la regularidad del ciclo pueden priorizarse rápidamente para pruebas en modelos de mamíferos, proporcionando un filtro rentable para candidatos terapéuticos. Dado que la disfunción gastrointestinal es común en varias afecciones neurodegenerativas, este ensayo también puede aplicarse más allá de la EP, sirviendo tanto como herramienta de descubrimiento como puente traslacional hacia la investigación preclínica.

Pasos críticos del protocolo

Presentamos una metodología refinada para estudiar la dismotilidad intestinal en mutantes RAC1/CED-10, un fenotipo no motor clave relevante para la MP prodrómica. Aunque se basa en los ensayos de defecaciónestablecidos 18,22, este protocolo aborda desafíos únicos planteados por los mutantes RAC1/CED-10 para asegurar resultados robustos y reproducibles.

Las adaptaciones clave para los mutantes RAC1/CED-10 son las siguientes:

Ajustes de sincronización: Los mutantes RAC1/CED-10 muestran una fecundidad reducida en comparación con cepas de tipo salvaje (observación personal). Para compensar el menor rendimiento de descendencia, aplicar los siguientes ajustes durante la sincronización: método de fragmento de placas - usar un inoculo más grande, aproximadamente el doble del volumen usado para cepas de tipo salvaje, para tener en cuenta una mayor variabilidad del desarrollo. Método adulto grávido - Transferir entre 15 y 20 adultos (frente a los 10 estándar) para asegurar un número suficiente de embriones para experimentos posteriores.

Sensibilidad a la lejía: Los embriones de mutantes RAC1/CED-10 presentan una mayor sensibilidad al tratamiento con hipoclorito. Para minimizar el daño, reduce el tiempo de exposición a la lejía entre un 20% y un 30% en comparación con los protocolos de tipo salvaje y verifica la integridad del embrión microscópicamente después del tratamiento.

Consideraciones sobre retraso en el desarrollo: los mutantes RAC1/CED-10 maduran más lentamente que los gusanos de tiposalvaje 10. Para lograr una sincronización adecuada para las grabaciones, comienza análisis de vídeo con gusanos salvajes para establecer una referencia temporal y registrar mutantes en etapas morfológicas coincidentes (por ejemplo, morfología vulvar) en lugar de por edad cronológica.

Justificación del flujo de trabajo: Realizar experimentos iniciales con C. elegans tipo salvaje controla la variabilidad ambiental y proporciona una referencia para los ritmos normales de defecación. Debido a los retrasos en el desarrollo de mutantes RAC1/CED-10-10, los calendarios de grabación deben adaptarse para priorizar comparaciones de etapas (en lugar de estrictamente por edad).

Consideraciones de temporización específicas por cepa: Los retrasos en el desarrollo en mutantes requieren una programación experimental flexible, con énfasis en emparejar las etapas de desarrollo entre genotipos en lugar de depender únicamente de la edad cronológica.

Limitaciones del modelo de nematodo

Aunque C. elegans carece de la complejidad anatómica y redundancia de vías de los sistemas de mamíferos —una limitación para algunos estudios traslacionales—, su simplicidad es ventajosa para examinar funciones biológicas discretas. Centrarse en la motilidad intestinal aprovecha esta fortaleza, ya que la fisiología optimizada del nematodo permite el análisis preciso de parámetros funcionales específicos. Aunque los estudios complementarios en mamíferos son necesarios para la validación terapéutica, C. elegans ofrece una plataforma excepcional para la investigación mecanicista de procesos biológicosconservados 21,23.

Nuestro modelo también carece de α-sinucleína endógena, que es beneficiosa para estudiar la enfermedad de Parkinson (Parkinson) en etapas preclínicas y tempranas, una etapa en la que el estreñimiento puede aparecer como síntomaprodrómico 3. La duración del ciclo de defecación proporciona una medida objetiva y de alto rendimiento, pero refleja solo un aspecto de la disfunción gastrointestinal y no es específica de cada enfermedad.

Aunque este ensayo no captura la agregación progresiva de α-sinucleína, la neurodegeneración compleja ni la patología sistémica relacionada con la edad observada en la PD5 humana, observamos alteraciones en la función dopaminérgica y GABAérgica y la interrupción de la señalizaciónRac1 6, lo que pone de manifiesto la relevancia mecanicista de este modelo. Por lo tanto, sigue siendo valioso para analizar los mecanismos neurogastrointestinales tempranos relacionados con la EP y las vías conservadas.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

A.M.J. reconoce la beca doctoral (FPU18/05190) en el marco del Doctorado en Biotecnología de la Universitat Autònoma de Barcelona. AL y AMJ reconocen la financiación PID2021-122645OB-100 y PID2024-1576370B-100 por MCIN/AEI//10.13039/501100011033/FEDER "Una manera de hacer Europa"; el Programa "Severo Ochoa" para Centros de Excelencia, en R&D CEX2019-000917-S (FUNFUTURE), CEX2023-001263-S (MATRANS42), Generalitat de Catalunya 2021S00446, y el programa de investigación e innovación Horizon Europe de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención nº 101057527 (NextGEM). EDC agradece el apoyo de la subvención APR-2024 (PMI24006), financiada por la Fundació d'Estudis Superiors en Ciències de la Salut (FESS) y la Fundació Institut de Recerca i Innovació en Ciències de la Vida i la Salut de Catalunya (IRIS-CC).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas multipozo de cultivo de 12 pozos, tratadas, estérilesLabboxCCPP-012-100
Agar VWRAAA10752-0EPara preparar las placas NGM
Bactopeptona VWR90000-264Para preparar las placas NGM
Lejía Cualquier hogarPara el proceso de blanqueo
CaCl2 LabkemCACH-02P-1K0Para preparar las placas NGM
Centrifugadora Sorvall ST8Sorvall15194923
Colesterol y piz;Sigma-AldrichC8667-25GPara preparar las placas NGM
RelojWindowsv 11.2503.4.0
E. coli OP50CGCOP50
etanol y la informaciónPanreac131086.1214Para preparar las placas NGM
Incubadora 20 y grado; CEcogenCIR180
KH2PO4 Sigma-AldrichP0662Para preparar el tampón M9
KPO4 Sigma-AldrichP5655 + P3786  KH2PO4 + K2HPO4; Para preparar las placas NGM
MgSO4 Sigma-AldrichM7506Para preparar las placas NGM; Para preparar el tampón M9
MicroscopioOlimpoOlympus BX51
Na2HPO4 Sigma-AldrichS9763Para preparar el tampón M9
Na2HPO4 Sigma Aldrich7558-79-4Para preparar el tampón M9
NaClSigma-AldrichS5886Para preparar las placas NGM; Para preparar el amortiguador M9; LB
NaOH Sigma-Aldrich567530Para el proceso de blanqueamiento; LB
Herramienta de recorte en Windows Windowsv 11.2504.42.0
TriptonaCONDA1612LB
Extracto de levaduraCONDA1702LB

Referencias

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