Aquí, presentamos un protocolo para examinar cómo lncPVT1 regula la estabilidad de HIF-1α y la expresión génica glucolítica en células de cáncer de tiroides, lo que permite el estudio de la regulación metabólica y posibles objetivos terapéuticos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de investigación
Aquí, presentamos un protocolo para examinar cómo lncPVT1 regula la estabilidad de HIF-1α y la expresión génica glucolítica en células de cáncer de tiroides, lo que permite el estudio de la regulación metabólica y posibles objetivos terapéuticos.
Como el principal cáncer del sistema endocrino, el carcinoma de tiroides exhibe una tendencia epidemiológica acelerada en todas las poblaciones. A pesar de los avances en las modalidades de tratamiento, la recurrencia y la metástasis siguen siendo un desafío. El ARN largo no codificante PVT1 (lncPVT1) ha surgido como un regulador oncogénico conservado en múltiples tipos de cáncer, pero su función específica en CT requiere una mayor exploración. Nuestra investigación se centró en examinar cómo lncPVT1 afecta la glucólisis en condiciones normóxicas e hipóxicas utilizando las líneas celulares TC TPC-1 y K1. La sobreexpresión de lncPVT1 mejoró significativamente el consumo de glucosa y la producción de lactato bajo hipoxia, corroborando su capacidad para aumentar la glucólisis. Además, lncPVT1 reguló al alza genes glucolíticos clave como GLUT1, HK1, HK2 y PGK1, y facilitó la proliferación de células TC. Mecánicamente, lncPVT1 estabilizó el factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) impidiendo su degradación y provocando su acumulación. Este HIF-1α acumulado luego se unió a secuencias reguladoras específicas que controlan la expresión de genes involucrados en la glucólisis, activando finalmente estos genes y aumentando la actividad glucolítica. Nuestros hallazgos demuestran que lncPVT1 regula la estabilidad de HIF-1α y la expresión génica glucolítica, lo que mejora nuestra comprensión del metabolismo de CT y potencialmente revela nuevos objetivos terapéuticos.
El cáncer de tiroides (CT), una neoplasia maligna endocrina altamente prevalente, ha experimentado un rápido aumento en las tasas de incidencia1. A pesar de los avances en las estrategias terapéuticas, incluidos los procedimientos quirúrgicos, la radioterapia y la terapia de supresión hormonal tiroidea, una proporción sustancial de pacientes con CT aún enfrentan el riesgo de recurrencia tumoral y metástasis, lo que enfatiza la necesidad de una comprensión más profunda de su patogénesis molecular 2,3. El desarrollo de CT se asocia con varios factores de riesgo establecidos, incluida la exposición a la radiación ionizante, el contacto con carcinógenos químicos, el consumo de tabaco y la obesidad; sin embargo, los intrincados mecanismos subyacentes siguen siendo difícilesde alcanzar 4. Dada la comprensión limitada de los mecanismos moleculares de TC, se ha prestado cada vez más atención a los ARN no codificantes, especialmente los lncRNA, por sus funciones reguladoras en el cáncer.
La evidencia emergente establece que los lncRNA son reguladores fundamentales de procesos biológicos multifacéticos, particularmente en el desarrollo tumoral, a través de mecanismos como el empalme alternativo, la regulación transcripcional y la esponja de microARN (miARN) 5,6,7. La translocación variante 1 del plasmocitoma (PVT1) se encuentra aguas abajo del cromosoma 8q24.21 y el oncogén C-myc8. Entre estos, lncPVT1, un lncRNA ubicado aguas abajo del oncogén C-myc en el cromosoma 8q24.21, ha atraído una atención significativa por sus funciones oncogénicas en varias neoplasias malignas, incluido el cáncer de hígado9 y el carcinoma de células renales10. Sin embargo, las implicaciones funcionales de lncPVT1 en CT permanecen en gran medida inexploradas.
Las células cancerosas se someten a una reprogramación metabólica, una característica clave de la tumorigénesis, donde exhiben una mayor actividad glucolítica junto con una fosforilación oxidativa disminuida, es decir, el efecto Warburg11. La hipoxia, una característica microambiental común en los tumores sólidos, influye profundamente en el comportamiento tumoral, promoviendo la glucólisis y la agresividad, y confiriendo un mal pronóstico12. El factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1), un factor clave que regula la reacción de la célula a los niveles bajos de oxígeno, orquesta una gran cantidad de cambios adaptativos que apoyan la supervivencia y progresión del tumor13. Estudios previos han demostrado que lncPVT1 modula la glucólisis en múltiples neoplasias malignas, incluido el cáncer de mama14, el adenocarcinoma ductal pancreático15 y el osteosarcoma16. Además, se ha demostrado que lncPVT1 mejora la proliferación celular al estabilizar HIF-1α en el carcinoma nasofaríngeo17. Sin embargo, no se ha informado de la correlación entre la expresión de lncPVT1 y los parámetros clínicos en el cáncer. Además, la función y los mecanismos específicos o las implicaciones clínicas únicas de lncPVT1 siguen sin estar claras en CT. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue explorar cómo lncPVT1 influye en el metabolismo de la glucosa en las líneas celulares TC TPC-1 y K1 expuestas a normoxia e hipoxia. Examinamos el impacto de la sobreexpresión de lncPVT1 en el consumo de glucosa, la producción de lactato y la proliferación celular. Además, desciframos los mecanismos de estabilización de HIF-1α gobernados por lncPVT1 y sus efectos resultantes en la programación transcripcional relacionada con la glucólisis. Esta investigación exhaustiva ofrece nuevas perspectivas sobre cómo lncPVT1 contribuye a la tumorigénesis, particularmente en el contexto de la reprogramación metabólica y la adaptación hipóxica.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Cultivo celular y transfección
Las líneas celulares de carcinoma de tiroides humano (CT) TPC-1 y K1 se cultivaron en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contenía 4,5 g/L de glucosa, suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Para el tratamiento de la hipoxia, se transfirieron 1 x 105 células a una cámara hipóxica sellada equilibrada con 1% de O2, 5% de CO2 y 94% de N2 a 37 ° C durante 24 h, a menos que se especifique lo contrario. Se generó una sobreexpresión estable de lncPVT1 (lncPVT1 OE) y el correspondiente control negativo (NC) en células TPC-1 y K1 utilizando un sistema de expresión lentiviral, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Evaluación de los niveles de glucosa
Para evaluar el consumo de glucosa, se cultivaron líneas celulares de carcinoma de tiroides en condiciones normóxicas (21% O2) e hipóxicas (1% O2) durante 24 h. Las concentraciones de glucosa en el medio de cultivo se midieron utilizando un kit de ensayo de glucosa de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, se mezclaron 2 μL de medio acondicionado con reactivo de trabajo de glucosa recién preparado y se incubaron a 37 °C durante 10 min. La absorbancia se midió a 530 nm utilizando un lector de microplacas para cuantificar los niveles de glucosa.
Evaluación de los niveles de lactato
Las líneas celulares de carcinoma de tiroides TPC-1 y K1 (2 x 104 células/pocillo) se cultivaron en condiciones normóxicas (21% O2, 5% CO2, 37 °C) e hipóxicas (1% O2, 5% CO2, 37 °C) durante 24 h. Después de la incubación, las placas de cultivo se centrifugaron a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células y los desechos. Posteriormente, se recogieron 2 μL del sobrenadante clarificado de cada pocillo y se mezclaron con 200 μL de reactivo de ensayo de lactato en una placa de 96 pocillos. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 10 min, después de lo cual se agregó una solución de parada para terminar la reacción. La absorbancia se midió a 530 nm utilizando un lector de microplacas. Las concentraciones de lactato se determinaron comparando los valores de absorbancia con una curva estándar generada a partir de estándares de lactato conocidos (que generalmente oscilan entre 0 y 20 nmol). Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Ensayo de proliferación celular
Las células de carcinoma de tiroides se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3 x 103 células por pocillo en 100 μL de medio de cultivo. Luego, las células se incubaron en condiciones normóxicas (21% O2, 5% CO2, 37 °C) o hipóxicas (1% O2, 5% CO2, 37 °C) durante 0 h, 24 h o 48 h. En cada punto de tiempo, se agregaron 10 μL de reactivo de proliferación celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, la placa se incubó a 37 °C durante 40 min. Después de la incubación, la densidad óptica a 450 nm (OD450) se midió utilizando un lector de microplacas para cuantificar la proliferación celular. Todas las mediciones se realizaron en al menos tres réplicas técnicas.
Análisis qRT-PCR
El ARN total se extrajo de 1 x 106 células de carcinoma de tiroides en condiciones normóxicas (21% O2, 5% CO2, 37 °C) e hipóxicas (1% O2, 5% CO2, 37 °C) utilizando un reactivo de extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo según el protocolo del fabricante. La pureza y la concentración de ARN se evaluaron espectrofotométricamente midiendo las relaciones de absorbancia a 260/280 nm. Para la síntesis de ADN complementario (ADNc), se transcribieron de forma inversa 500 ng de ARN total en un volumen de reacción de 20 μL que contenía transcriptasa inversa, cebadores de hexámeros aleatorios, dNTP, inhibidor de ARNasa y tampón de reacción. La transcripción inversa se realizó a 25 °C durante 10 min, seguida de 42 °C durante 50 min, y finalizada calentando a 70 °C durante 15 min.
La PCR cuantitativa se realizó utilizando un sistema de detección basado en SYBR Green en un volumen total de reacción de 20 μL que contenía plantilla de ADNc (dilución 1:5 a 1:20 de la síntesis original de ADNc), mezcla maestra de PCR SYBR Green, cebadores directos e inversos (cada uno a 0,2 μM) y agua libre de nucleasas. La amplificación por PCR se realizó en un termociclador con las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min; 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, recocido a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s; seguido de un análisis de la curva de fusión para verificar la especificidad de la amplificación.
Las secuencias de cebadores para GLUT1, HK1, HK2, PGK1 y GAPDH (Tabla 1) se diseñaron en base a las secuencias publicadas18 y se sintetizaron comercialmente. Los niveles de expresión de los genes diana se normalizaron a GAPDH y se calcularon utilizando el método 2-ΔΔCt 19.
Western blot
Después del tratamiento, las células del carcinoma de tiroides se lavaron 2 veces con solución salina tamponada con fosfato frío (PBS) y se lisaron utilizando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) suplementado con un cóctel inhibidor de la proteasa. Los lisados celulares se incubaron en hielo durante 30 min con mezcla intermitente y luego se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C para eliminar los residuos insolubles. La concentración de proteína del sobrenadante se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se mezclaron cantidades iguales de proteína (30 μg por muestra) con tampón de carga 5x, se hirvieron a 95 °C durante 5 min y se cargaron en geles de poliacrilamida SDS al 10% para la separación electroforética. Las proteínas se separaron por electroforesis a 120 V durante aproximadamente 90 min y luego se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un sistema de transferencia húmeda a 100 V durante 90 min a 4 °C. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,1% (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica. Posteriormente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en tampón de bloqueo: anticuerpo anti-HIF-1α (1:3.000) y anticuerpo anti-beta-actina (1:8.000). Después de lavar 3 veces con TBST (cada una durante 10 min), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiados diluidos 1: 5,000 en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados TBST adicionales, las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y se obtuvieron imágenes con un sistema de documentación de gel.
Ensayo de luciferasa dual
Para investigar la regulación transcripcional de los genes relacionados con la glucólisis por lncPVT1, las células TPC-1 se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1 x 105 células por pocillo y se cultivaron en DMEM que contenía 4,5 g/L de glucosa, suplementado con suero bovino fetal al 10% y 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina durante la noche. Las células se cotransfectaron con 500 ng de un plásmido reportero de luciferasa de luciérnaga impulsado por elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) y 50 ng de plásmido de control de luciferasa Renilla utilizando un reactivo de transfección a base de lípidos a una concentración final de 2 μL por pocillo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La eficiencia de la transfección se confirmó mediante la inclusión de una transfección paralela con un plásmido que expresa GFP y la evaluación de la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia 24 h después de la transfección. Después de 24 h de incubación en condiciones normóxicas (21% O2) o hipóxicas (1% O2), las actividades de la luciferasa se midieron utilizando un sistema de ensayo indicador de luciferasa dual. La actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de la luciferasa de Renilla, y la proporción se utilizó para el análisis comparativo entre muestras.
Análisis de datos
Todos los datos se presentaron como media ± DE. Las evaluaciones estadísticas se ejecutaron en un software de análisis estadístico. Las comparaciones entre los grupos se realizaron mediante pruebas t independientes y la significación estadística se determinó en función de un umbral de valor p inferior a 0,05.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Glucólisis mejorada en líneas celulares TC mediada por lncPVT1
Inicialmente establecimos lncPVT1 OE y NC en células TPC-1 y K1 utilizando un sistema de expresión lentiviral. La sobreexpresión exitosa de lncPVT1 se confirmó mediante qRT-PCR (Figura 1A-B). Para evaluar el impacto en la glucólisis, las células se cultivaron bajo normoxia e hipoxia durante 24 h. Nuestro...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Como la neoplasia maligna endocrina más común, la CT plantea desafíos significativos en términos de su recurrencia y metástasis22. El panorama mecanicista de la carcinogénesis tiroidea permanece incompletamente definido, especialmente en lo que respecta a la regulación mediada por lncRNA de la reprogramación metabólica oncogénica y los comportamientos celulares fundamentales23 . En este estudio, nos centramos en el lncPVT1 oncogénico y su i...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Los autores afirman que no hay conflictos de intereses, ya sean financieros o no financieros.
La financiación de la investigación se proporcionó a través del Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Fujian (2022J01784).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Meilunbio | MA0082-2 | Ensayo de cuantificación de proteínas WB |
| Cabina de bioseguridad | Lishen | HFsafe-1200LC | Paso y expansión celular |
| Centrífuga | Baiyang | B320A | Celdas de centrífuga |
| Sistema de imágenes de quimioluminiscencia | BIO-RAD (EE. UU.) | ChemiDoc Touch | Desarrollo del Banco Mundial |
| Incubadora CO2 | Thermo (EE. UU.) | 311 | Cultivo celular |
| Kit de detección de quimioluminiscencia ECL | Meilunbio | MA0186-1 | Desarrollo del Banco Mundial |
| Citómetro de flujo | BD | FACSCalbur | Ensayo de apoptosis por citometría de flujo |
| Microscopio invertido de fluorescencia | NIKON(Japón) | TS2-FL | Observación celular |
| Instrumento de PCR cuantitativa de fluorescencia | ABI (EE. UU.) | 7300 | Experimento de PCR |
| GAPDH | Tecnología de proteínas | 60004-1-IG | Anticuerpo de referencia interno WB |
| Kit de ensayo de glucosa | Jiancheng | A154-1-1 | Ensayo bioquímico |
| HIF1A | BOSTER | A00013 | Anticuerpo WB |
| IgG de cabra anti-ratón Affinipure conjugado con HRP (H + L) | Tecnología de proteínas | SA00001-1 | Experimento de inmunohistoquímica (IHC) |
| Affinipure cabra anti-conejo IgG (H + L) conjugada con HRP | Tecnología de proteínas | SA00001-2 | Experimento de inmunohistoquímica (IHC) |
| Línea celular K1 | Banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China) | NA | Línea celular de carcinoma papilar de tiroides humano |
| Kit de ensayo de ácido láctico | Jiancheng | A019-2-1 | Ensayo bioquímico |
| Lector de microplacas | Thermo (EE. UU.) | K3 | Detección ELISA |
| Kit de preparación ultrarrápida PAGE Gel (15%) | Meilunbio | MA0384 | Electroforesis WB |
| Instrumento de PCR | BIO-RAD (EE. UU.) | PTC100 | Experimento de PCR |
| Marcador de proteína arcoíris preteñido | Meilunbio | MA0342 | Electroforesis WB |
| Sistema de electroforesis vertical de proteínas | BIO-RAD (EE. UU.) | POWER PAC 200 | Electroforesis WB |
| Tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (5X) | Tiempo de beyo. | P0015L | Electroforesis WB |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | sigma | 151-21-3 | Electroforesis WB |
| Línea celular TPC-1 | Banco de células de la Academia China de Ciencias (Shanghái, China) | NA | Línea celular de carcinoma de tiroides humano |
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.