Artículo de método

Análisis basado en datos TCGA y datos de célula única, tomando TRPM4 como ejemplo

DOI:

10.3791/69304

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5 de diciembre de 2025

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1The First Clinical Medical College, Nanjing Medical University, 2School of Pediatrics, Nanjing Medical University, 3Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 4Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo para analizar a fondo el papel de un solo gen en el cáncer de vejiga (BLCA) basado en el análisis transcriptoma y el análisis de células individuales, junto con la utilización de 101 algoritmos de aprendizaje automático, para construir un modelo pronóstico para el gen único mencionado.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo, se introduce un método de análisis basado en conjuntos de datos transcriptómicos públicos y conjuntos de datos unicelulares, que podría utilizarse para describir de forma exhaustiva el papel de genes individuales en tumores, incluyendo la configuración del microambiente inmune tumoral, la configuración de subtipos moleculares tumorales y la predicción del pronóstico de los pacientes tumorales. Al mismo tiempo, la introducción de datos de un solo gen no solo puede evitar la aleatoriedad y heterogeneidad que genera el análisis de un solo transcriptoma, sino que también permite una exploración más profunda de en qué grupos específicos de células se expresa el gen, así como una investigación más profunda sobre el papel que desempeña el gen dentro de la vía. Dado que muchos investigadores pueden no ser competentes en análisis de células individuales, en este artículo de método se presenta un sitio web en línea llamado TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), ayudando así a todos a completar el análisis de célula única. Además, la aplicación de 101 métodos de aprendizaje automático ha desempeñado un papel indispensable en la construcción del modelo pronóstico más preciso. En conclusión, se cree que este método integrado de análisis de un solo gen, que combina análisis de bioinformática, aprendizaje automático y análisis de células únicas, puede desempeñar un papel indispensable y crucial en el estudio de las funciones de genes individuales en la progresión tumoral, así como en el estudio de las funciones de genes individuales en las vías.

Introducción

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Como todos sabemos, el cáncer de vejiga (BLCA) es uno de los tumores malignos más agresivos y metastásicos del mundo, y todavía existen problemas con los biomarcadores actuales del cáncer de vejiga, como la inexactitud, etc. Para identificar el pronóstico de los pacientes con BLCA y predecir los resultados de los pacientes con BLCA, la búsqueda de biomarcadores para el cáncer de vejiga y el establecimiento de modelos pronósticos son de gran importancia. Aunque se han desarrollado algunos métodos de investigación para biomarcadores, la mayoría de estos métodos actualmente se limitan a la transcriptómica, lo que inevitablemente conduce a la heterogeneidad en las muestras2. Además, estudiar solo los datos de transcriptómica a menudo no logra investigar los roles que desempeñan las diferentes subpoblaciones celulares, así como las funciones de los genes en distintas vías a nivel de célula única, lo que hace que investigaciones anteriores sean menos precisas yefectivas 3. Teniendo en cuenta que el análisis de célula única puede ser un reto para principiantes, se ha introducido una plataforma online para el análisis de célula única que les ayuda a aprender las habilidades rápidamente4. Por último, aunque no menos importante, incluso si se encuentra un solo gen como biomarcador adecuado mediante análisis transcriptómico y análisis de células individuales, no hay garantía de que el biomarcador sea aplicable a todas las cohortes, por lo que es necesario construir modelos pronósticos asociados al biomarcador para que las conclusiones sean más universalmenteaplicables 5. El algoritmo de aprendizaje automático 101 se refiere a la construcción de 101 modelos pronósticos utilizando una combinación de 10 algoritmos diferentes de aprendizaje automático, con el objetivo de identificar el modelo de pronóstico óptimo. La inclusión de algoritmos como el bosque aleatorio, XGBoost y SVM, que son más capaces de manejar datos complejos y muestran mayor estabilidad, ha dado lugar a que este algoritmo combinado demuestre una estabilidad notable. Para hacer este modelo pronóstico más preciso y relevante para el biomarcador, primero se realiza un análisis de correlación entre todos los genes y el biomarcador, luego se seleccionan unos 20-30 genes según los requisitos, y posteriormente se utiliza un algoritmo de aprendizaje automático 101 para construir el modelo pronóstico, seguido de una serie de análisis para finalizar los resultados.

En comparación con los biomarcadores predichos por el análisis transcriptómico simple de losúltimos 6, los biomarcadores del análisis unicelular y transcriptómico permiten una descomposición imparcial de tejidos o muestras en sus componentes celulares básicos. Permite la diferenciación clara de diferentes tipos celulares (como células T, células B y macrófagos) y el descubrimiento de nuevas subpoblaciones (como células T agotadas y células T reguladoras), así como la captura de procesos dinámicos continuos (como las trayectorias de diferenciación celular). Es como disponer frutas y leche por separado, permitiendo una visualización clara de cada componente y su cantidad. En comparación con los modelos deCox 7 de una sola cohorte, el modelo pronóstico construido usando aprendizaje automático 101 también es más preciso y científicamente sólido, ya que puede aprender automáticamente sobre las complejas interacciones no lineales entre variables a partir de los datos. Por ejemplo, el impacto de una mutación genética específica podría ser significativo solo en pacientes de ciertas edades y tamaños tumorales. Modelos de aprendizaje automático, como los bosques aleatorios y las redes neuronales, pueden capturar automáticamente estas interacciones de alto orden sin necesidad de especificaciónmanual 8. Las restricciones clave de aplicabilidad de señalización que indican que el conjunto de datos utilizado para el análisis debe incluir la gran mayoría de genes, sin que el número de genes sea demasiado bajo y que el número de genes usados para construir modelos pronósticos no sea demasiado alto, generalmente manteniéndose alrededor de 20-30, siendo lo óptimo. El estándar de control de calidad del conjunto de células individuales debe ser superior a 1000, el recuento de UMI por célula debe ser superior a 1000 y el número de genes por célula debe ser superior a 5009.

Aquí se ofrece un enfoque paso a paso para la identificación de nuevos biomarcadores a partir de conjuntos de datos transcriptómicos públicos y de conjuntos de datos unicelulares, tomando como ejemplo el papel de TRPM4 en BLCA. Se emplean múltiples métodos de investigación y conjuntos de datos diversos —incluyendo el Atlas del Genoma del Cáncer-Cáncer de Vejiga (TCGA-BLCA), el conjunto de datos de células unicelulares GSE145281 y los conjuntos de datos BLCA GSE32894 y GSE31684— para mejorar la precisión y aplicabilidad de los biomarcadores en oncología desde múltiples perspectivas y para avanzar en el estudio de TRPM4 en BLCA. El conjunto de datos TCGA-BLCA se obtuvo de la página web Xena de la Universidad de California, Santa Cruz (UCSC Xena). GSE32894 y GSE31684 se descargaron del Gene Expression Omnibus (GEO), y los datos de células únicas GSE145281 se obtuvieron del Tumor Immune Single-Cell Hub 2 (TISCH2). Además, se extrajeron datos sobre subtipos moleculares de BLCA y respuestas al tratamiento de archivos suplementarios de hojas de cálculo de un artículo relevante. A continuación, se realizan análisis bioinformáticos, análisis de células únicas y aprendizaje automático, estableciendo una metodología integrada de investigación de un solo gen.

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Protocolo

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NOTA: Todos los códigos utilizados en este artículo pueden encontrarse en la web https://github.com/YaoGeng-nmu/Analysis-of-TRPM4-based-on-TCGA-data-and-single-cell-data-in-BLCA/blob/main/code.

1. Preparación de datos transcriptómicos

  1. Preparación del conjunto de datos TCGA-BLCA
    1. Descarga todos los conjuntos de datos TCGA desde la web UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/)10. Los conjuntos de datos descargados están preprocesados, eliminando la necesidad de trabajos adicionales como la anotacióngénica 11.
    2. Selecciona el conjunto de datos TCGA y luego haz clic en el conjunto de datos TCGA-BLCAt. Luego, ve a la página del conjunto de datos TCGA-BLCA, haz clic en RNA-seq de expresión génica y descarga los datos clínicos y los perfiles de expresión génica del conjunto de datos TCGA-BLCA. En este conjunto de datos, asegúrese de que haya datos de expresión de ARNm de 400 pacientes con BLCA.
    3. Para diferenciar muestras tumorales de las muestras de tejido normal adyacentes, separar las muestras con los extremos 01 y 11, ya que las muestras con 01 indican muestras tumorales, mientras que las muestras con 11 indican tejidos adyacentes al cáncer (muestras normales).
  2. Preparación de GSE32894 y GSE31684
    1. Haz clic en la página web de GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) para descargar el conjunto de datos BLCA GSE32894 y GSE3168412,13.
    2. Después de hacer clic en las Entradas Respectivas en la esquina superior derecha, asegúrate de moverte a las páginas para los conjuntos de datos GSE32894 y GSE31684.
    3. A continuación, descarga los datos correspondientes de ARNm, datos clínicos y datos de supervivencia para GSE32894. Haz clic en el botón http del conjunto de datos GSE32894. Además, descarga los datos de la plataforma GPL6947 usando el botón de plataforma. Haz clic en el (los) botón(es) de Archivo de la Matriz de Series y descarga GSE32894 después de hacer clic en el botón GSE32894_series_matrix.txt.gz al descargar datos de ARNm, datos clínicos y datos de supervivencia para GSE32894.
    4. Descarga los datos correspondientes de ARNm, datos clínicos y datos de supervivencia para GSE31684. Haz clic en el botón http del conjunto de datos GSE31684. Además, descarga los datos de la plataforma GPL570 usando el botón de plataforma. Haz clic en el (los) botón(es) de Archivo de la Matriz de Series y descarga GSE31684 después de hacer clic en el botón GSE31684_series_matrix.txt.gz al descargar datos de ARNm, datos clínicos y datos de supervivencia para GSE31684.
    5. En el paso de filtrado, elimina genes sin sentido, como aquellos con un nivel de expresión cero o cercano a cero. Emplea el método ComBat, que se basa en el paqueteSVA 14, para la corrección por lotes.

2. Preparación del análisis de célula única

  1. Preparación de GSE145281
    1. Para realizar investigación a nivel de célula única, busca el conjunto de datos de células únicas de la BLCA, considerando que los datos transcriptomales por sí solos son insuficientes para determinar qué grupo celular expresa TRPM4 de forma más significativa.
    2. Aquí, visita TISCH2 (http://tisch.compbio.cn/), una página web dedicada al análisis de tumores unicelulares.
    3. Según las necesidades experimentales, se selecciona el tipo de cáncer necesario, usando la BLCA como ejemplo en este caso.
    4. Haz clic en el botón BLCA y elige el conjunto de datos llamado GSE145281.

3. Preparación de los subtipos moleculares de BLCA y datos de respuesta a elecciones terapéuticas

  1. Descarga los datos sobre los subtipos moleculares de la BLCA y la respuesta a las elecciones terapéuticas del artículo referenciado aquí15.
  2. Abre la web de PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Busca el artículo y haz clic en Tablas Complementarias. Hay un total de 18 archivos en este paquete comprimido.

4. Análisis del microambiente inmunitario BLCA de TRPM4

  1. Gráfico de mapa de calor de la expresión de 133 inmunomoduladores en diferentes grupos TRPM4
    1. Según la expresión de TRPM4, se dividen todas las muestras de BLCA en el grupo de alto TRPM4 y el grupo de bajo TRPM4 .
    2. Copia por separado todos los nombres de muestras y los datos de expresión TRPM4 , luego clasifícalos en orden descendente de expresión TRPM4 y categoriza la primera mitad de las muestras en el grupo de alto TRPM4 y la segunda mitad en el grupo de bajo TRPM4 en la columna del grupo según la expresión TRPM4 . Todas las identificaciones de los pacientes de TCGA-BLCA se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.
    3. Instala los paquetes R necesarios para el análisis de datos transcriptómicos. Haz pequeñas modificaciones al código proporcionado, como cambiar la ubicación del archivo, y luego ejecuta el código. Comprueba cuidadosamente si los identificadores génicos y los identificadores de los inmunomoduladores están correctamente emparejados, asegurando que no haya espacios ni otros factores poco visibles tras los identificadores génicos, ya que estos son las principales causas de la falla en la generación del mapa térmico.
  2. Análisis estromalológico e inmunológico de muestras tumorales utilizando el paquete ESTIMATE R
    1. Asegúrate de que todos los paquetes R necesarios para el análisis de datos transcriptómicos estén instalados. Según los requisitos del código, nombra los datos requeridos con los nombres correspondientes y luego haz clic en el botón Correr .
      NOTA: Es importante recordar que este sitio web también ofrece capacidades de análisis en línea. Aunque es posible obtener los resultados deseados visitando la página web (https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/rpackage.html), este método no es adecuado para analizar datos que se hayan autorecogido.
    2. Haz clic en el botón Enfermedad y elige la opción de Carcinoma Urotelial de la Vejiga . Luego, selecciona el botón de plataforma RNA-seq-V2 . Descarga la puntuación estromal, la puntuación inmune y la estimación de todas las muestras.
  3. Gráfico de violín de la expresión entre diferentes grupos TRPM4
    1. Instala todos los paquetes R necesarios para el análisis de datos transcriptómicos. Todos los paquetes R necesarios están listados en la Tabla Suplementaria 2. Según los requisitos del código, nombra los datos requeridos con los nombres correspondientes y luego haz clic en el botón Correr.
    2. Asegúrese de verificar cuidadosamente que los identificadores génicos estén introducidos correctamente, asegurándose de que no haya espacios ni otros factores discretos al final de los identificadores génicos, ya que estas son las principales causas de fallos en la creación de diagramas de violín.
  4. Gráfico de mapa de calor triangular entre diferentes grupos TRPM4
    1. Instala todos los paquetes R necesarios para el análisis de datos transcriptómicos. Asegúrate de preparar los datos de expresión de varios genes de control inmunitario, como TIGIT y CD80. Abre los datos del transcriptoma TCGA-BLCA y luego busca cada entrada individualmente, dado que el número de genes de puntos de control inmunitarios no es extenso.
    2. Según los requisitos del código, nombra los datos requeridos con los nombres correspondientes y luego haz clic en el botón Correr .
  5. Gráfico de correlación entre diferentes genes y TRPM4
    1. Instala todos los paquetes R necesarios para el análisis de datos transcriptómicos. Rellena TRPM4 como primer gen y añade el gen que se está investigando como el segundo gen, que en este caso es CD3E .
    2. Después de hacer clic en el botón Correr , asegúrate de cambiar CD3E a otros genes que necesiten ser analizados, como CTLA4.

5. Análisis de célula única de TRPM4 en el conjunto de datos GSE145281

  1. Análisis de GSE145281 de conjuntos de datos BLCA utilizando análisis de célula única
    1. Entra en la web y haz clic en BLCA. El análisis de célula única permite una exploración más profunda de qué grupo celular presenta alta expresión de TRPM4 en comparación con el análisis transcriptómico. Asegúrate de que los datos de análisis de una sola célula se recopilen de GSE130001 y comprueba con el estándar de control de calidad que indica que el número de células por conjunto de datos debe ser superior a 1000, el recuento de UMI por célula debe ser superior a 1000 y el número de genes por célula debe ser superior a 500. Los genes expresados diferencialmente de cada grupo en comparación con todas las demás células se identifican en función del cambio de pliegue transformado en logarítmic (|logFC| >= 0,25), y la resolución de agrupamiento debería ser 0,5.
  2. Anotación celular para diferentes grupos celulares
    1. Asegúrate de que todos los grupos de células estén anotados. Por ejemplo, las células B pueden ser anotadas por CD19, MS4A1, CD27, IGHD, IGHM, TCL1A y FCRL5. Todos los genes utilizados para la anotación celular pueden encontrarse en la Tabla Suplementaria 3.
    2. Luego, elige GSE145281 y descarga todos los resultados de TRPM4. Haz clic en el botón General y descarga el gráfico UMAP de GSE145281 de diferentes grupos y tipos celulares.
    3. Haz clic en el botón Gene y elige el único gen que va a ser analizado. Haz clic en el botón GSEA y observa las funciones de este único gen a través de varias vías, como la vía KEGG y la víaHallmark 16,17.
    4. Haz clic en el botón CCI y encuentra el gráfico de chat celular y el gráfico de burbujas del grupo que expresan fuertemente un solo gen.
    5. Haz clic en el botón de enriquecimiento de TF para ver el Factor de Transcripción enriquecido para cada grupo.

6. 101 Aprendizaje automático para construir un modelo pronóstico relacionado con TRPM4

  1. Instala todos los paquetes R necesarios para el análisis de datos transcriptómicos. Teniendo en cuenta que un único enfoque de aprendizaje automático puede no ser siempre el método óptimo para predecir el pronóstico, se puede construir un modelo pronóstico utilizando técnicas 101 de aprendizaje automático. Realizar un análisis de correlación entre todos los genes de la cohorte TCGA-BLCA y las cohortes GSE32894 y GSE31684 y TRPM4.
  2. En función del número de genes fuertemente asociados con TRPM4, se seleccionan todos los genes con una correlación mayor o igual a 0,6 o menor o igual a -0,6 con TRPM4. Selecciona todos los genes fuertemente asociados a TRPM4 en todas las cohortes.
  3. Combina todos los datos de GSE32894 y GSE31684 cohortes para formar un conjunto de validación y utiliza TCGA-BLCA como conjunto de entrenamiento.
  4. Según los requisitos del código, nombra los datos requeridos con los nombres correspondientes y luego haz clic en el botón Correr .

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Resultados

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Es bien sabido que el beneficio principal de usar la transcriptómica para analizar el microambiente inmunitario de genes individuales es que permite una correlación directa entre genes individuales y las interacciones dinámicas con las células y moléculas inmunitarias a nivel de expresión génica, lo que permite la observación directa de las características inmunitarias y la identificación de diferencias en la proporción de células inmunitarias que se infiltran entre grupos con alta o baj...

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Discusión

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En estudios previos, el análisis bioinformático de genes individuales a menudo se encontraba con problemas como superficialidad, inexactitud y aplicabilidadlimitada 19. Además, investigaciones previas sobre genes individuales se han limitado típicamente a datos transcriptomicos. Además, al centrarse únicamente en datos transcriptomicos, pueden surgir cuestiones como la heterogeneidad y la aleatoriedad de la muestra, lo que dificulta la identificación de patrones

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Queremos agradecer al BioBean Informatics Consortium por desarrollar un marco analítico inteligente (disponible en http://www.sxdyc.com/). Su innovadora infraestructura computacional aceleró sustancialmente el flujo de trabajo de investigación mediante análisis de precisión y módulos automatizados de interpretación de datos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
R 4.3.3ningunoningunoninguno

Referencias

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  4. Han, Y., et al. TISCH2: expanded datasets and new tools for single-cell transcriptome analyses of the tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1425-D1431 (2023).
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