Este protocolo establece una definición objetiva de la suficiencia del injerto basada en la producción diaria de orina y los valores del panel de función renal sérica para caracterizar de forma reproducible y objetiva si el injerto es capaz de sostener la homeostasis de forma independiente sin depender de la diálisis en los primeros 7 días tras el trasplante.
Artículo de método
Un protocolo estandarizado de autotrasplante de riñón porcino para estudiar la función tardía del injerto
En este artículo
Resumen
Resumen
La función tardía del injerto (DGF) se define comúnmente como la necesidad de diálisis dentro de los 7 días posteriores al trasplante de riñón; Sin embargo, las definiciones actuales a menudo se basan en un juicio clínico subjetivo y carecen de criterios estandarizados que describan con precisión la suficiencia del injerto. Esta inconsistencia dificulta el diagnóstico y la comparación de la investigación. Este protocolo establece umbrales objetivos para la DGF utilizando valores cuantificables de producción urinaria y función renal sérica para describir objetivamente la suficiencia del injerto y la capacidad independiente de mantener la homeostasis. La investigación en modelos porcinos es desafiante debido a la ausencia de criterios diagnósticos consensuados para la DGF y a la dificultad de realizar diálisis durante largos periodos. Para abordar esto, introducimos un protocolo claramente definido para definir e inducir la DGF en el autotrasplante renal porcino tras 30 minutos de isquemia tibia renal aislada, simulando una obtención similar a la muerte circulatoria (DCD). Describimos métodos de cateterismo de Foley no invasivos, acceso venoso central y monitorización de la línea arterial en cerdos femeninos, permitiendo una medición precisa de la producción de orina, análisis diarios y monitorización intraoperatoria. Estas técnicas se detallan para garantizar la transparencia y la reproducibilidad, creando un punto final estandarizado para los estudios de DGF en cerdos que recapitula el fenotipo clínico.
Introducción
La lista de espera para trasplantes de riñón en EE. UU. supera los 90.000 pacientes. Debido a la escasez de injertos, se realizan menos de 30.000 trasplantes de riñón al año, mientras que una cohorte similar de nuevos pacientes se sumó a la listade espera 1. Para abordar esta escasez cada vez mayor, cada vez se eligen más riñones con DCD con lesiones subóptimas por isquemia. De hecho, desde 2023, el 50% de los riñones trasplantados en EE. UU. provienen de donantes con DCD. Los riñones con DCD se asocian a altas tasas de función tardía del injerto (DGF). La mayoría define el DGF como un requisito de diálisis dentro de los 7 días posteriores al trasplante de riñón. Aunque la DGF es una insuficiencia temporal del injerto, se asocia con un aumento de las tasas de rechazo temprano y tardío, y una supervivencia mediana del injerto más corta, de 8-12años 2. Siendo mayormente una definición clínica subjetiva, la DGF es difícil de estudiar en modelos porcinos debido a la falta de una definición objetiva y estandarizada y a los retos de la diálisis a largo plazo en cerdos. En este trabajo, desarrollamos un protocolo objetivo y estandarizado para definir la suficiencia de injertos e inducir la DGF en el autotrasplante renal porcina. Debido a las similitudes demostradas por xenotrasplantes en la función de los riñones porcinos y humanos, este protocolo es trasladable al trasplante de riñón humano. Se eligió el autotrasplante renal porcino para este modelo por la razón principal de aislar el efecto de la lesión isquemia-reperfusión como variable que controla la insuficiencia temprana del injerto y neutraliza la alloinmunidad o toxicidad inmunosupressora como factores de confusión.
Definición de función tardía del injerto: Para superar los dos principales retos de 1) definir objetivamente la suficiencia del injerto y 2) definir la naturaleza temporal del fenotipo en ausencia de apoyo para la diálisis como puente hacia la recuperación funcional del injerto, utilizamos valores objetivos de salida orina y panel de función renal para definir la enfermedad. Estandarizar la reanimación volumétrica, los criterios de autotrasplante y la ausencia de compromiso anastomótico (arteria, vena o uréter), descarta una causa anatómica permanente de insuficiencia del injerto. Definimos la función tardía del injerto en autotrasplantes porcinos como: insuficiencia temporal temprana del injerto debido a anuria prolongada (<100 mL/día) que supera los 3 días, lo que conduce a niveles variables de BUN, creatinina y acumulación de potasio hasta alcanzar un punto final humano de K ≥ 8 mEq/L (alto riesgo de arritmia cardíaca e indicación objetiva para diálisis urgente/urgente) en ausencia de compromiso anastomótico. Según esta definición, un injerto funcional produce suficiente salida de orina para mantener el equilibrio electrolítico y reducir la BUN y la creatinina. Por el contrario, un injerto insuficiente no produce suficiente orina para excretar BUN y creatinina y causar hiperpotasemia potencialmente mortal que requiera diálisis (o eutanasia humanitaria en su ausencia), debido a una lesión reversible por isquemia-repercusión parenquimatosa y no a compromisos o rechazos anastomóticos irreversibles.
Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke (IACUC). En este modelo se utilizan cerdos Yorkshire solo hembras (para inserción de catéter de Foley no invasivo) que pesan entre 40 y 50 kg (para facilitar los diámetros ostiales renales y uretrales para la canulación). Este protocolo podía ser realizado por un equipo de cuatro personas: un cirujano, un asistente, un perfusionista de órganos y un responsable de estudio (para muestras, suministros y datos).
1. Día postoperatorio (POD) -1 (Extracción de riñón)
- Anestesia
- Premedicar a los animales con inyecciones intramusculares (IM) de ketamina (22 mg/kg) y midazolam (0,5 mg/kg).
NOTA: Comenzar con una dosis relativamente alta de ketamina ayuda a reducir de forma segura la necesidad intraoperatoria de isoflurano. - Administra Isoflurano inicialmente mediante el cono del hocico al 1-1,5% (máximo 2,5%) hasta que la mandíbula y las vías respiratorias superiores estén relajadas para permitir la intubación. Ajusta el volumen de marea a 7-7,5 mL/kg y la velocidad de ventilación a 18-20 respiraciones por minuto para mantener los niveles fisiológicos de saturación de oxígeno y laPCO 2. Aplica suavemente ungüento y/o cierra los párpados con cinta adhesiva para protegerlos de rascados o sequedades.
- Premedicar a los animales con inyecciones intramusculares (IM) de ketamina (22 mg/kg) y midazolam (0,5 mg/kg).
- Colocación de líneas centrales con túnel
- Coloque una línea central Hickman tunelada de un solo lumen de 9,6 Fr que sale de la piel desde la parte trasera del cerdo entre los omóplatos para permitir una toma de muestras de sangre indoloras y a demanda, permitiéndoles tumbarse de lado con el mínimo malestar y con bajo riesgo de alteración del catéter de línea central (Figura 1).
- Tras preparar la piel, utilizando un bisturí de 11 cuchillas, realiza tres incisiones superficiales cutáneas a través de la dermis hasta la capa de grasa subcutánea, entre los omóplatos, en la nuca y en la parte anterior derecha del cuello.
- Utiliza el túnel de tejidos para crear un túnel subcutáneo que conecta las tres incisiones. Mientras estás en posición de boca abajo, pasa el catéter desde entre los omóplatos hasta la parte anterior derecha del cuello.
- Para insertar el catéter de línea central en la vena yugular externa derecha (EJ), gira el cerdo a la posición de Trendelenburg supina y utiliza una aguja localizadora de 18 G para aspirar la EJ usando la técnica de triangulación anatómicade Flourney y Mani 3. Enhebra un alambre en la luz usando la técnica4 de Seldinger, utiliza el introductor despegante para dilatar el tracto, enhebra el catéter Hickman en la luz del EJ y asegura la línea central en la parte trasera. Tras confirmar el retorno sanguíneo, la heparina bloquea la línea y repite la línea trascada uso 5. Si acceder a la EJ derecha resulta complicado, utiliza el túnel tisular para extender el túnel subcutáneo anterior a la tráquea y lleva el catéter al lado izquierdo del cuello para su inserción en la EJ izquierda.
- Coloque una línea central Hickman tunelada de un solo lumen de 9,6 Fr que sale de la piel desde la parte trasera del cerdo entre los omóplatos para permitir una toma de muestras de sangre indoloras y a demanda, permitiéndoles tumbarse de lado con el mínimo malestar y con bajo riesgo de alteración del catéter de línea central (Figura 1).
- Colocación de Foley (tres métodos para aumentar la invasividad en caso de fallo de inserción)
- Enfoque manual
- Coloca al animal boca arriba en la mesa de operaciones. Prepara la piel alrededor de la bóveda vaginal con betadine e inunda la bóveda vaginal con 10 mL de betadine (para disminuir la carga microbiana y el riesgo de infección urinaria).
NOTA: Incluso cuando están completamente inflados, los globos de 5 mL tienden a resbalarse. - Inserta manualmente un catéter de Foley lubricado a 12-14 Fr, endurecido con un cable, palpando la abertura uretral a 4-5 cm de profundidad en la abertura vaginal en la pared vaginal anterior (ventral).
- Coloca al animal boca arriba en la mesa de operaciones. Prepara la piel alrededor de la bóveda vaginal con betadine e inunda la bóveda vaginal con 10 mL de betadine (para disminuir la carga microbiana y el riesgo de infección urinaria).
- Enfoque con espéculo: Si el enfoque manual falla, utiliza un espéculo lubricado para visualizar la abertura uretral dentro de la vagina. Utiliza las pinzas largas de DeBakey con gasa estéril para secar suavemente la Betadine e inserta el catéter de Foley con balón de 12-14 Fr, 10 mL, con o sin alambre de rigidez, bajo visualización directa. Infla el balón solo después de verificar el retorno de orina.
- Enfoque quirúrgico: Si el enfoque con espéculo (paso 1.3.2) también falla, inserta quirúrgicamente el catéter de Foley sobre un alambre. Después de la laparotomía, introduce una aguja de 18 g en la vejiga, introduce un alambre de 0,035" de aproximadamente 1 m de largo en la uretra a través de la vejiga, y pasa el catéter de Foley por encima de él hasta la vejiga para inflar el balón. Retira el alambre a través de la vagina (para evitar contaminación abdominal) y cierra el pequeño agujero de la aguja en la vejiga con un cierre de una sola capa 6-0 Prolene en forma de 8. Sutura el cuerpo del Foley y una bolsa de orina de 1 L a la piel del cerdo (Figura 1).
- Enfoque manual
- Medicación preincisión
- Administrar la primera dosis diaria de antiplaquetarios de aspirina 81 mg por vía oral dentro de la bolsa de la mejilla, seguida de ceftiofur depot IM antibiótico, 1 g de cefazolina IV por vía central para la prevención de SSI, buprenorfina intramuscular (0,005-0,01 mg/kg) para el control del dolor, y comenzar un total de 1 L de solución electrolítica equilibrada a una infusión constante de 250 mL/h.
2. Autotrasplante renal de DCD porcino que mantiene la vida
- Obtención de riñón
- Prepara y coloca la piel del abdomen. Realiza una laparotomía de la línea media desde el xifoides hasta el pubis.
NOTA: Hay 1 o 2 venas grandes que cruzan la línea media de forma subcutánea cerca del pubis y que sangran abundantemente si se cortan, pero se controlan fácilmente con electrocauterización. - Instala un separador Bookwalter (o dos separadores Balfour a 90°) con cuatro cuchillas de la pared corporal que sujetan ambos lados de la pared abdominal hacia arriba para evitar el derrame del intestino delgado del abdomen con la posterior compresión venosa y linfática, y la hinchazón intestinal.
- Utilizar dos toallas quirúrgicas tibias humedecidas con solución salina para retraer el intestino hacia el lado izquierdo del abdomen y colocar los separadores por encima de ellos para exponer suavemente el retroperitoneo derecho que contiene el riñón derecho.
NOTA: Cierto grado de posición de Trendelenburg (cabeza hacia abajo) también puede ayudar con la retracción intestinal. - Abre el peritoneo posterior en el lado lateral del riñón (para evitar lesionar el uréter derecho antes de visualizarlo). Disecciona el uréter derecho desde el peritoneo posterior y la arteria renal derecha y divídelo entre dos ligaduras de seda 2-0 en el polo inferior del riñón derecho. Deja una cola de sutura más larga en el uréter restante para facilitar la identificación durante el implante (24 horas después). Dejar el resto del uréter cubierto por su revestimiento peritoneal para reducir las cicatrices y la necesidad de una disección extensa en la segunda operación de implante.
NOTA: Ten mucho cuidado de no lesionar las dos venas lumbares que se unen a la VCI justo al momento de despegue de la arteria renal derecha de la aorta (anatomía específica de cerdo diferente de la retroperitoneal humana). Atar y dividir esas venas lumbares también es una opción segura. - Disecciona la arteria renal alejándola de la vena renal y a lo largo de su curso bajo la VI hasta su origen aórtico para obtener la máxima longitud arterial disponible. Comprime brevemente la VI y hazla girar hacia el retroperitoneo izquierdo para exponer el origen de la arteria renal derecha que circula por debajo tras su despegue de la aorta abdominal.
NOTA: En los cerdos, normalmente hay 1-2 ganglios linfáticos asociados a la arteria renal que la obstruyen; sin embargo, la arteria renal queda bien esqueletizada tras diseccionar y extraer estos ganglios. - Diseca la vena renal derecha alejándose de la glándula suprarrenal derecha de forma craneal. Para obtener unos pocos milímetros de despeje entre la vena renal derecha y la glándula suprarrenal, se levanta cuidadosamente el revestimiento peritoneal posterior de la vena renal derecha hasta que se visualizen las venas suprarrenales más grandes entrando en la VCI.
- Para simular el proceso de obtención de DCD, administra 500 U/kg de heparina por la línea central y deja que circule durante 5 minutos, luego haz doble atar la arteria renal seguida de la vena renal en su origen (para máxima longitud) usando lazos de seda 2-0 o mayores (los lazos de seda 3-0 son demasiado finos y frágiles para este tejido flexible y resbalan con frecuencia) y comienza un cronómetro durante 30 minutos de in-situ Tiempo isquémico cálido renal aislado. Durante el tiempo cálido de isquémica, utiliza tijeras de tenotomía o electrocauterización en la configuración de corte para esqueletizar y separar la arteria y la vena renal entre sí y facilitar el implante posterior.
NOTA: El esqueletización de los vasos in situ durante el tiempo cálido isquémico aprovecha el control vascular para prevenir la pérdida de sangre en caso de lesión vascular, permitiendo que los vasos llenos de sangre revelen cualquier pequeña fuga vascular que pudiera repararse mediante hemorragias de la circulación renal aislada atada para simular la lesión isquémica. - Al final del tiempo cálido isquémico, dividir los vasos y el uréter y canular la arteria renal con una cánula recta de 3 mm y administrar 250 mL de solución de Belzer de la Universidad de Wisconsin helada a través de la arteria renal.
NOTA: Una cánula recta de 5 mm es demasiado grande y podría causar daños familiares y la formación de solapas. - Conservar el injerto mediante perfusión de máquina hipotermia no oxigenada durante 24 horas. Irrigar el abdomen con 1 L de solución electrolítica equilibrada y cerrar la fascia con suturas continuas en bucle de Prolene 1-0. Irriga la herida y cierra la piel con grapas.
- Extuba al cerdo, vuelve a su terrario y recupérate de la anestesia durante 24 horas. Para controlar el dolor, inyecta bupivacaína (dosificación basada en el peso) por vía subcutánea en los bordes de la herida y administra buprenorfina de liberación prolongada intramuscular (dosificación basada en el peso).
NOTA: También se podía administrar paracetamol sin efecto sobre la TFG (a diferencia de los AINEs).
- Prepara y coloca la piel del abdomen. Realiza una laparotomía de la línea media desde el xifoides hasta el pubis.
- Implantación renal
NOTA: La implantación renal ocurre intraperitonealmente tras el enfoque modificado de Starzl del implante renal directamente sobre la aorta abdominal y la VI con anastomosis uréter-uréter6. El riñón derecho se explanta y se reimplanta en una posición inferior, invertido en el retroperitoneo derecho, siguiendo la técnica Simforoosh7. El tiempo de la cirugía de implantes oscila entre 3 y 5 horas, y el tiempo de sutura del implante entre 20 y 40 minutos, según el nivel de formación o experiencia y la complejidad de la anatomía.- Tras 24 horas de recuperación, premedicar, intubar, preparar y colocar de nuevo el abdomen del cerdo en el quirófano (Figura 2).
- Colocación de la línea arterial (tres métodos en caso de fallo de inserción)
- Línea arterial auricular: Para monitorizar la hemodinámica intraoperatoriamente y guiar la reanimación con líquido y pressores, especialmente después de la reperfusión, para apoyar al animal durante el síndrome de reperfusión y no causar una lesión renal aguda secundaria de bajo flujo (AKI), colocar una línea arterial angiocath de 22 G en la arteria auricular mediante la palpación del pulso de la arteria auricular en el lado posterior de cualquiera de las orejas del cerdo.
- Línea arterial carótida: Si la inserción auricular falla, alternativamente, se crea una incisión en la línea media del cuello hasta la tráquea. Diseca el tejido conectivo adyacente a la tráquea y retrételo usando un Weitlaner o un separador autoretenedor Gelpi. Una vez visualizado, rodea la arteria carótida con una corbata de seda 2-0. Colocar una línea carótida percutánea de 4 Fr Cordis mediante la técnica de Seldinger sin necesidad de dilatación arterial. Ata el extremo distal de la carótida y deja un lazo de seda 2-0 para atar el extremo proximal al final de la operación una vez retirada la línea arterial, seguido de un cierre de piel grapado.
- Línea arterial femoral. Alternativamente, se podría insertar una línea femoral por vía percutánea o mediante corte.
NOTA: Una línea femoral quedará temporalmente infuncional durante el pinzamiento de la aorta para la anastomosis arterial durante el implante.
- Colocación de la línea arterial (tres métodos en caso de fallo de inserción)
- Medicación preincisión
- Administrar la segunda dosis diaria de antiplaquetarios, aspirina 81 mg por vía oral dentro de la bolsa de la mejilla, seguida de 1 g de cefazolina IV por vía central para la prevención del SSI, buprenorfina intramuscular (0,005-0,01 mg/kg) para el control del dolor, y comenzar un total de 4 L de solución electrolítica equilibrada a una infusión constante de 250 mL/h.
- Inicia una infusión constante de dopamina no titulable a través de la línea central a 2 μg∙kg-1∙min-1 y una infusión de noradrenalina titratable hasta un máximo de 0,4 μg∙kg-1∙min-1 para un MAP objetivo de 80-100 mmHg.
NOTA: La velocidad de administración de líquidos puede aumentarse temporalmente a 1 L/h o más mediante una bolsa de presión inmediatamente antes de la reperfusión para proporcionar un mejor soporte hemodinámico si la hipotensión durante el síndrome de reperfusión es especialmente complicada.
- Reabrir el abdomen retirando las grapas de la piel y cortando las suturas fasciales, y reintroducir el separador Bookwalter.
- Diseccionar la cubierta peritoneal descendente del colon desde la línea media que cubre la aorta y la VI (en cerdos el colon descendente se une mediante una cubierta peritoneal más corta a la línea media que cubre la aorta y la VI desde los vasos renales izquierdos hasta la arteria mesentérica inferior para revelar la aorta y la VI en el retroperitoneo (lugar de inserción del injerto renal)8.
NOTA: Ten mucho cuidado de dividir solo la unión peritoneal del colon justo por encima de los grandes vasos y no desvascular el colon descendente dividiendo las arterias mesentéricas arqueadas superior e inferior que corren más cerca de la pared del colon.
No se observó hernia interna con esta maniobra, como lo demuestran las necropsias, que revelaron que este espacio ya se había cicatrizado y cerrado espontáneamente para el día 7 postoperatorio. - Disecciona la aorta y la VCI de su unión peritoneal lateral a los músculos psoas bilateralmente. Después, disecciona la aorta y la VI separadas hasta que se visualicen las arterias y venas lumbares. Opcional: permitir la máxima elevación y exposición de luz de la aorta en la pinza Satinsky durante la costura, diseccionar, atar y dividir las 1-2 arterias y venas vertebrales que normalmente se encuentran en ese segmento de los grandes vasos (desde los vasos renales izquierdos hasta la arteria mesentérica inferior) en ese segmento de la aorta lumbar entre 2-0 lazos de seda. Esqueletiza la sección lumbar de la aorta desde su pesada cubierta adventicial para prepararla para la implantación.
NOTA: No se observaron complicaciones en la columna con esta maniobra. - Administra 100 U/kg de heparina de forma sistémica a través de la línea central y deja que circule durante 5 minutos. Simultáneamente, pida al equipo de anestesia que aumente temporalmente la tasa de infusión equilibrada de electrolitos de 250 mL/h a 1 L/h y que empiece a ajustar la noradrenalina según sea necesario hasta un máximo de 0,4 μg∙kg-1∙min-1 para lograr una MAP de 80-100 mmHg en preparación para el síndrome de reperfusión.
- Clampa la VCI con una pinza Satinsky de mordisco lateral en ángulo caudal (para no interferir con las manos del cirujano de costura situadas en el lado izquierdo del cerdo) y crea una venenotomía y aspira/enjuague el interior de la VI.
- Retirar el riñón del hielo o de la perfusión con máquina y enjuágalo con 250 mL de solución electrolítica equilibrada como hielo y llevarlo al campo quirúrgico, marcando el inicio del segundo tiempo isquémico tibio (de coser).
- Gira el autoinjerto de riñón derecho al revés (técnica Simforoosh) para que el uréter apunte hacia arriba, la arteria media y la vena sea lateral, y se coloque en el lado derecho del abdomen mirando hacia la aorta infrarrenal 7,9.
- Anastomosis venosa: Utiliza dos suturas 6-0 Prolene de doble brazo para realizar una anastomosis venosa en funcionamiento. Coloca una pinza de bulldog en la vena renal y retira la pinza Satinsky. Independientemente del momento de la costura de la vena, mantén la pinza Satinsky en la VCI durante 25 minutos estandarizados para permitir una lesión isquémica estandarizada al injerto.
- Anastomosis arterial: Después de la pinza intravenosa de 25 minutos y la fijación de 5 minutos entre vasos, usa de nuevo la pinza Satinsky para pinzar completamente la aorta. Haz una incisión en una rendija y ensáchala usando un punzón redondo de 4,0 mm para asegurar una abertura limpia. Utiliza una sutura 6-0 Prolene de doble brazo para realizar un paracaídas o una anastomosis arterial de la cicatrización hasta los dedos de los pies. De manera similar, independientemente de la velocidad de finalización de la anastomosis arterial, mantén la pinza Satinksy durante 25 minutos en la aorta para estandarizar un tiempo total de costura de 55 minutos.
NOTA: El tiempo total de isquémica cálida (30 minutos simulando donación y 55 minutos simulando manipulación del implante) condujo a la inducción de DGF. - Reperfusión de injertos: Tras los 55 minutos estandarizados totales de tiempo cálido de costura isquémica, retira primero la pinza bulldog de la vena renal, seguida de la pinza Satinksy en la aorta, y comprueba la reperfusión del injerto y la hemostasis. Mantener una reanimación agresiva con líquidos y noradrenalina para lograr una MAP de 80-100 mmHg durante aproximadamente 1 hora después de la reperfusión para apoyar al animal durante el síndrome de reperfusión.
NOTA: No olvide controlar cualquier sitio de biopsia con aguja de 18 G, si se realiza, con electrocauterización superficial de presión y alta coagulación. - Anastomosis del uréter: Esqueletose los uréteres restantes y los del injerto eliminando 1 cm del tejido graso circundante. Espatulado 1 cm del uréter del injerto y del uréter derecho remanente. Utiliza dos suturas dobles de 6-0 Prolene (PDS para planificar la supervivencia a largo plazo y disminuir el riesgo de formación de piedras) para aproximarlos. Enhebra un stent ureteral doble J de 7F x 24 cm sobre la anastomosis fresca y completa la anastomosis con suturas corriendo.
- Neprectomía contralateral
- Para permitir que el riñón trasplantado sea el riñón que sostiene la vida, se extirpa el riñón contralateral (izquierdo).
- Cierre abdominal
- Tras comprobar la hemostasia y los conteos, irrigar el abdomen con 1 L de solución electrolítica equilibrada y cerrar la fascia con Prolene en bucle 1-0, seguido de irrigación cutánea y cierre con grapadora. Inyecte bupivacaína al 0,25% en la línea de sutura para proporcionar anestesia local e inyecte SQ de liberación prolongada suficiente para controlar el dolor. Extuba al cerdo y devólvelo a su terrario separado mediante barreras de cristal o plástico para evitar que se muerdan las líneas centrales y los catéteres de Foley.
- Tras 24 horas de recuperación, premedicar, intubar, preparar y colocar de nuevo el abdomen del cerdo en el quirófano (Figura 2).
- Cuidados postoperatorios diarios
- Revisa los cerdos durante las rondas QID principalmente para asegurarte de que la bolsa de orina no se llene en exceso, causando obstrucción postrenal iatrogénica y roturas de vejiga o uréter.
- Por la mañana, administra un antiplaquetario oral 81 mg de aspirina, toma una muestra de sangre de la línea central y la bloquea con hep, y mide la cantidad de orina en la bolsa de orina y toma de la muestra.
NOTA: No se indican más líquidos intravenosos ni medicamentos, ya que los cerdos suelen recuperar el apetito y la función intestinal mediante la POD1.
- Sacrificio
- Al final del estudio sobre POD7, o antes para un punto final humano, colocar al cerdo nuevamente bajo anestesia endotraqueal general y examinar el injerto con ecografía para asegurar la integridad anastomótica, seguido de reabrir el abdomen como se describió antes.
- Examina el injerto en busca de signos de perfusión y examina las tres anastomosis para comprobar la permeabilidad. Retira el injerto con las tres anastomosas intactas y espátulalas a lo largo de su longitud para verificar su integridad interna y patencia.
- Biopsia el parénquima del riñón con una pistola de biopsia de 18 G.
Resultados
Función inmediata frente a función tardía del injerto. Realizamos autotrasplantes de riñón porcino de 30 minutos con DCD tras 24 horas de preservación con máquina hipotermia sin oxigenar utilizando (MAP = 40 mmHg) y monitorizamos el fenotipo de recuperación y función del injerto en la primera semana tras el trasplante, utilizando muestras diarias de sangre y la producción total de orina. Observamos dos fenotipos de recuperación tras el trasplante. El primer fenotipo fue de recuperación/suficiencia inmediata/temprana del injerto. Tres de cada cinco cerdos implantados con los injertos simulados de DCD (60%) presentaron retorno de la producción de orina (producción diaria > 500 mL/día) por POD 2-3, permitiendo una homeostasis electrolítica continua sin intervención (diálisis, quelación potástica o desplazamiento intracelular mediado por insulina) (Figura 3). El segundo fenotipo fue la función tardía del injerto (DGF), caracterizada por anuria sostenida más allá de la POD 3, asociada a la acumulación de BUN sérico, creatinina y el desarrollo de hiponatremia e hiperpotalemia, que serían una indicación clínica objetiva para la diálisis. La anuria y la hiperposemia progresaron hasta causar cambios en el EKG (picos de ondas T) alrededor de K ≥ 8 mEq/L. Esto representaba una indicación urgente para la diálisis y, por tanto, se trataba como un punto final humano. Una vez alcanzado este punto final, se realizó la eutanasia bajo anestesia general para descartar otras causas de insuficiencia/fallo del injerto debido a compromisión anastomótica u otras complicaciones quirúrgicas. Usando esta definición de DGF, los riñones de DCD porcinos con 30 minutos de isquemia tibia in situ , seguidos de 24 horas de preservación con máquina hipotermia no oxigenada y 55 minutos de cosido de tiempo isquémico caliente desarrollaron DFG a una tasa del 40% (dos de cada cinco cerdos). Esta tasa de DGF recapitula la tasa reportada en trasplante de riñón deDCD humano 1.
Figura 1: Colocación de la línea central tunelada y del catéter de Foley. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 2: Autotrasplante renal de DCD porcino que mantiene la vida. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Función tardía del injerto en el modelo porcina. La diferencia en la producción de orina (A ) entre los injertos de función inmediata y los de función retardada; (B) niveles de potasio entre el injerto de función inmediata y el de función retardada; (C) niveles diarios de creatinina sérica entre los injertos de función inmediata y de función retardada. Todas las cifras se representan como Media + SEM con los valores reportados como LOCF y analizados mediante análisis de modelos mixtos. Abreviatura: LOCF = última observación llevada adelante. N=5 cerdos por brazo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Discusión
El retraso en la función del injerto afecta negativamente al curso clínico tras el trasplante de riñón. En el contexto inicial tras el trasplante, se asocia a hospitalizaciones prolongadas, una mayor tasa de procedimientos invasivos y un mayor riesgo de rechazo. A largo plazo, el DGF también se asocia con una supervivencia más corta del injerto. El DGF es una manifestación de una lesión grave por isquemia-reperfusión (I/RI), como lo demuestra su mayor prevalencia en trasplantes de DCD en comparación con DBD o trasplantes de riñón con donante vivo. La lesión renal aguda (AK) es secundaria a la necrosis tubular aguda causada por la I/RI y se considera la razón más común por la que un aloinjerto falla en funcionar de inmediato. Clínicamente, el DGF se define por la necesidad de diálisis en la primera semana del trasplante. En modelos animales de gran tamaño, la DGF ha sido difícil de definir y estudiar debido a la falta de una definición estandarizada de suficiencia del injerto y a la imposibilidad de realizar diálisis para determinar la naturaleza temporal de la condición, utilizando la diálisis como puente para la recuperación funcional del injerto.
En este protocolo, se eligió un modelo porco, ya que se acepta ampliamente que es muy paralelo a la fisiología renal humana (como ha demostrado un xenotrasplante exitoso reciente)10,11. Se eligió el autotrasplante para eliminar la respuesta aloinmune, el rechazo y la necesidad y los efectos tóxicos confundentes de los inhibidores de la calcineurina. La definición de DGF se basa en anuria prolongada (<100 mL de orina por día) después de POD3, lo que conduce a cambios graves asociados al electrocardiograma asociados a la hiperpotalemia. La cateterización de Foley permite una recogida precisa de orina, lo que ancla la definición de función y suficiencia retardada del injerto en el resultado funcional de la calidad y cantidad de la orina. La recogida diaria de sangre permite la vigilancia diaria de los parámetros tradicionales de los paneles de función renal, proporcionando una visión completa de la homeostasis electrolítica.
Establecer un modelo animal fiable y reproducible de función tardía del injerto, creemos, aceleraría el estudio de terapias eficaces para la función retrasada del injerto y, en última instancia, resultaría en mejores resultados en el trasplante de riñón. En resumen, este protocolo establece un modelo reproducible de autotrasplante de riñón porcino que permite la caracterización objetiva de la función tardía del injerto utilizando la producción cuantificable de orina y parámetros bioquímicos séricos tras una lesión isquémica tibia controlada. Al incorporar condiciones quirúrgicas estandarizadas, recogida de orina no invasiva y monitorización en serie de laboratorio, este enfoque proporciona un marco práctico para estudiar la DGF en ausencia de diálisis y facilita la comparación con fenotipos clínicamente relevantes de disfunción del injertoposttrasplante 12,13,14,15.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos al laboratorio de perfusión de órganos de Toronto (Top lab) por compartir su experiencia durante la formación en trasplante de riñón porcina. También agradecemos a Michelle Mendiola Pla por compartir su experiencia sobre la inserción de Foley porcino no invasivo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Inserción de Foley supina | |||
| 12 Padre Foley | Recogida de orina | ||
| Lubricante quirúrgico | Inserción de Foley | ||
| 1 L de bolsa de orina | Recogida de orina | ||
| Sutura de nailon 2-0 | Foley y aseguramiento de líneas centrales | ||
| Espéculo y Long Debakey & Luz | Inserción de Foley | ||
| Tubos de muestreo de orina (50 ml cónicos) | Muestreo de orina | ||
| Cartuchos CG8 + Chem 8 + Piccolo | Laboratorios diarios | ||
| Inserción de línea central propensa a supino | |||
| 9,6 Fr Bandeja de catéter Hickman de un solo lúmen | Laboratorios diarios | ||
| Hoja 10 | Incisiones de puñalada para la inserción de CVC | ||
| Línea central con cierre de bloqueo sin necesidad | |||
| Bolsa de suero fisiofisiológico (1L de suero fisiológico + 10 viales de heparina) | heplock CVC | ||
| Explantación | |||
| Paquete de laparotomía | |||
| Bovie | |||
| Mangos de luz estériles | |||
| Paquete de esponjas | |||
| Toallas OR - blancas 17X23 pulgadas (4 por paquete) | |||
| 2-0 Corbatas de seda | Control vascular | ||
| 1 L Plasmalyte | Solución electrolítica balanceada | ||
| Bandeja de instrumentos para laparotomía general estéril | |||
| Suero tibio normal para toallas de intestino húmedo | Manejo intestinal | ||
| Caja de gestión de agujas | |||
| Separador Bookwalter | |||
| Backtable | |||
| Bolsas para órganos estériles - 2 por riñón | |||
| 1 litro de bolsa cristaloide para granizado | |||
| Solución UW - 250 ml por riñón | |||
| Tubería de descarga | |||
| Angiocath calibre 14 | |||
| Drapeado mecánico | |||
| Peso del órgano (báscula + cuenco + bolsa estéril para órgano) | |||
| Perfusión por máquina | |||
| Máquina de perfusión | Transportador de riñón Lifeport | ||
| Cámara de órgano desechable | Transportador de riñón Lifeport | ||
| Solución de perfusión | Solución KPS-1 | ||
| Implante | |||
| Tubería de succión | |||
| Punta de succión Yankauer | |||
| Contenedor de succión | |||
| Pestañas de goma | |||
| Punzón aórtico de 4 mm | Anastomosis arterial | ||
| Instrumentos de microcirugía + pinza | |||
| Alambre guía del uréter | |||
| Stent de uréter - 4,8 fr x 12 mm | Anastomosis en uréter | ||
| Cierre abdominal | |||
| Proleno en bucle 1 | |||
| Bupivacaína | |||
| Grapadoras de piel | |||
| muestras | |||
| Bandeja de muestras | |||
| Pistola de biopsia de 14 G | |||
| Tarros de biopsia NBF | |||
| Tubos Eppendorf | |||
| Tubos de sangre verde superior | |||
| Cónicas de 15 mL | |||
| Medicación | |||
| Vial de noradrenalina | |||
| Vial de dopamina | |||
| 1 L de plasmalito | Solución electrolítica balanceada | ||
| Comprimidos de aspirina 81 mg por la vida diaria | |||
| Vial de cefazolina | |||
| Exceed | |||
| Unidades de heparina 10K |
Referencias
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