Protección cardiocerebral mediante electroacupuntura en un modelo murino de hipoxia crónica

Resumen

Este estudio estableció un modelo murino de hipoxia crónica de 12 semanas para investigar la protección cardiocerebral de la electroacupuntura. Los hallazgos demostraron que la estimulación por electroacupuntura en puntos de acupuntura, comúnmente utilizada para mejorar la función cognitiva, no solo mejoró la función cognitiva, sino que también alivió la disfunción cardíaca y redujo el daño patológico en el tejido miocárdico.

Resumen

Este estudio estableció un modelo murino de hipoxia crónica de 12 semanas para investigar los efectos cardio-cerebrales protectores de la electroacupuntura. Los enfoques terapéuticos existentes para trastornos relacionados con la hipoxia, como la oxigenoterapia hiperbárica y ciertos fármacos, suelen estar limitados por la mala accesibilidad o por mecanismos de objetivo único. Para abordar esta brecha, planteamos la hipótesis de que la estimulación de EA en puntos de acupuntura tradicionalmente empleados para la mejora cognitiva podría mejorar simultáneamente tanto las funciones cognitivas como cardíacas bajo condiciones hipóxicas crónicas. Treinta ratones machos C57BL/6J fueron asignados aleatoriamente a tres grupos: grupo control (Con), grupo modelo de hipoxia crónica (CH) y grupo de tratamiento con hipoxia crónica más electroacupuntura (CH+EA). Los grupos CH y CH+EA estuvieron expuestos a un entorno hipóxico (10,0% ± 0,5% O₂) durante 8 horas diarias durante 12 semanas, mientras que el grupo CH+EA además se sometió a estimulación diaria de EA en GV20, GV24 y ST36 bilateral durante las últimas 2 semanas. Las pruebas de comportamiento, la evaluación ecocardiográfica y el análisis histopatológico revelaron que la EA no solo aliviaba significativamente los comportamientos similares a la ansiedad y mejoraba la memoria espacial, sino que también mejoraba múltiples parámetros de la función cardíaca, al tiempo que reducía el daño neuronal del hipocampo y la remodelación miocárdica. Estos hallazgos demuestran que la EA confiere efectos protectores cardiocerebrales, que se alinean con el "concepto holístico" de la Medicina Tradicional China, proporcionando así una novedosa estrategia de intervención no farmacológica para las comorbilidades cardiocerebrales relacionadas con la hipoxia.

Introducción

La hipoxia representa un desafío patológico común en diversas condiciones, incluyendo entornos de gran altitud, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedades cardiocerebrovasculares, así como escenarios especializados como operaciones aeroespaciales y de buceo, que pueden conducir a un deterioro funcional multiorgánico. Como órganos con mayor consumo de oxígeno en el cuerpo, el cerebro y el corazón son especialmente vulnerables al daño hipóxico. Los estudios demuestran que la prevalencia de deterioro cognitivo en pacientes con EPOC oscila entre el 32% y el 88%^1,2, mientras que la incidencia de disfunción cardíaca alcanza hasta el 70%^3. Los estudios han demostrado que la hipoxia crónica induce disfunción mitocondrial cerebral, provocando posteriormente estrés oxidativo, sobrecarga de calcio y neuroinflamación, lo que finalmente causa daño neuronal en el hipocampo y la corteza cerebral y dificulta las funciones de aprendizaje y memoria ^4,5,6. Simultáneamente, la hipoxia activa tanto el sistema nervioso simpático como el sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), lo que provoca vasoconstricción, presión arterial elevada, aumento de la carga cardíaca y promoción de hipertrofia y fibrosis miocárdicas, lo que finalmente conduce a insuficiencia^{cardíaca 7,8,9}. Esta lesión cardiocerebral concurrente aumenta significativamente la dificultad del manejo clínico para los pacientes, haciendo que el desarrollo de estrategias terapéuticas efectivas y accesibles sea una necesidad clínica crítica no cubierta.

Las estrategias terapéuticas actuales para el deterioro cognitivo inducido por hipoxia y la disfunción cardíaca incluyen principalmente la oxigenoterapia hiperbárica, potenciadores metabólicos cerebrales (por ejemplo, piracetam, oxiracetam), terapia con factores^{neurotróficos 10,11} y bloqueadores β (por ejemplo, metoprolol⁾¹². Sin embargo, estos enfoques presentan limitaciones significativas: la oxigenoterapia hiperbárica requiere equipos especializados y carece de accesibilidad; Las intervenciones farmacológicas suelen causar efectos secundarios y suelen dirigirse a vías patológicas individuales; mientras que la terapia con factores neurotróficos enfrenta desafíos relacionados con la penetración y estabilidad de la barrera hematoencefálica. Por ello, identificar estrategias eficientes y accesibles para el tratamiento cardiocerebral simultáneo se ha convertido en una línea clave de investigación.

La acupuntura, un componente fundamental de la Medicina Tradicional China (MTC), enfatiza una perspectiva terapéutica holística que se alinea con la demanda de regulación multidirigida. Demuestra un potencial terapéutico único tanto para trastornos neurológicos como cardiovasculares. La electroacupuntura (EA), una evolución moderna de la acupuntura que integra la punción tradicional con la estimulación eléctrica, permite una modulación más precisa de la actividad electrofisiológica^{neural 13,14}. La AA mejora eficazmente la lesión por isquemia-reperfusión cerebral, reduce la liberación de enzimas miocárdicas (GPBB, H-FABP) y ejerce una cardioprotección significativa^15,16. En resumen, como innovación moderna de la acupuntura tradicional, la electroacupuntura ejerce una regulación multimecanicista y multidirigida, demostrando un claro valor de aplicación y potencial clínico en el tratamiento de enfermedades neurológicas y cardiovasculares, y uniendo la MTC con la medicina moderna.

Sin embargo, los estudios actuales sobre la AA para el deterioro cognitivo hipóxico y la lesión cardíaca se limitan mayormente a efectos de un solo órgano/sistema, sin explorar su potencial en el tratamiento cardiocerebral simultáneo. Basándose en el "concepto holístico" de la MTC y en la realidad clínica de la comorbilidad cardiopulmonar-cerebral inducida por hipoxia crónica a largo plazo, este estudio pretende investigar el efecto de la EA en el "tratamiento cardiocerebral simultáneo", aclarar su papel en la mejora sincrónica del daño neuronal inducido por hipoxia, la hipertrofia/fibrosis miocárdica y los deterioros funcionales relacionados, y proporcionar un régimen holístico y dirigido no farmacológico para las asociaciones cardiopulmonar-cerebrales enfermedades.

Protocolo

Treinta ratones machos C57BL/6J, de entre 7 y 8 semanas y con un peso de 18-22 g (véase Tabla de Materiales), fueron alojados en una instalación de SPF en el Centro de Evaluación de Nuevos Fármacos del Instituto de Investigación Farmacéutica Yiling de Hebei. La temperatura ambiente se mantuvo entre 20 y 26 °C con una humedad relativa del 40%-70%, bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas. Los ratones tenían acceso improvisado a comida estándar de roedores de laboratorio y agua limpia. Tras un periodo de aclimatación de una semana, los ratones se asignaron aleatoriamente en tres grupos (n = 10): el grupo control normal (Con), el grupo modelo de hipoxia crónica (CH) y el grupo de tratamiento con hipoxia crónica más electroacupuntura (CH+EA). Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Animal del Instituto de Investigación Farmacéutica de Yiling de Hebei (Número de aprobación: TTN-2025001) y se llevaron a cabo estrictamente conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Establecimiento de un modelo murino de hipoxia crónica (Figura 1)

El modelo murino de hipoxia crónica se estableció basándose en un método previamente descrito con^{modificaciones 17}. Se utilizó un sistema automatizado de control y entrega de gases para generar y mantener un entorno hipóxico. Este sistema estaba programado para regular con precisión válvulas solenoides que mezclaban osígeno puro y nitrógeno en una proporción específica, entregando la mezcla a una cámara de hipoxia de acero inoxidable hecha a medida. Esta configuración permitía un control preciso tanto del momento como de la concentración de la entrega de gas. La concentración de oxígeno dentro de la cámara se monitorizaba continuamente mediante un analizador digital de oxígeno y se mantenía en un 10,0% ± 0,5% mediante un mecanismo de retroalimentación que ajustaba el caudal de gas en consecuencia. Los ratones de los grupos CH y CH+EA fueron alojados juntos en la cámara de hipóxia y sometidos a condiciones hipóxicas durante 8 horas al día (de 9:00 a.m. a 5:00 p.m.), tras lo cual se les devolvió a condiciones normóxicas durante el resto del día. Este protocolo se repitió diariamente durante 12 semanas. Durante toda la exposición a la hipóxica, los animales tenían acceso ad libitum a comida y agua. Se prestó especial atención durante la infusión inicial de nitrógeno para reducir la concentración de oxígeno; Este proceso se llevó a cabo gradualmente para evitar la muerte aguda de animales derivada de un rápido descenso de los niveles de oxígeno. Los ratones del grupo Con fueron alojados bajo condiciones normóxicas en una cámara adyacente, con todas las demás condiciones de alojamiento idénticas a las de los grupos experimentales.

Anestesia (Figura 2)

Para garantizar la estabilidad animal durante la intervención electroacupuntura y minimizar la interferencia del estrés fisiológico en los resultados, en este estudio se utilizó isoflurano inhalado para anestesia¹⁷. Durante los procedimientos se administró anestesia a todos los ratones de los grupos experimentales para garantizar condiciones operativas consistentes. Antes de la anestesia, se preparó una máquina de anestesia para animales pequeños (véase la Tabla de Materiales) y una almohadilla térmica controlada termostáticamente a 37 °C para evitar la hipotermia en los animales durante el procedimiento. La inducción por anestesia se realizó en una cámara de inducción sellada utilizando isoflurano al 2%-2,5% (véase Tabla de Materiales) durante aproximadamente 1 minuto. Tras la pérdida de movimiento espontáneo y una reducción significativa del tono muscular, cada ratón fue transferido a la almohadilla térmica. Una mascarilla miniatura especialmente diseñada se colocó suavemente sobre su hocico para mantener la anestesia con isoflurano entre 0,5% y 1,2%. La profundidad efectiva de la anestesia se determinó por la ausencia del reflejo de parpadeo y la ausencia de un reflejo de retirada significativo en respuesta a la estimulación plantar. Este protocolo de anestesia mantuvo un estado anestésico estable en los ratones durante más de 30 minutos, lo que fue suficiente para completar todos los procedimientos posteriores.

Tratamiento con electroacupuntura

Se inició la intervención con electroacupuntura para el grupo CH+EA de ratones en la undécima semana de exposición crónica a la hipoxia. Los puntos de acupuntura seleccionados fueron Baihui (GV20) y Shenting (GV24) en la cabeza, junto con Zusanli bilateral (ST36). GV20 se encuentra en la línea media del vértice craneal, aproximadamente en el punto medio entre los dos ápices de la^{oreja 18}. GV24 está situada en la línea media de la frente, aproximadamente 1-2 mm por encima del punto medio de la línea que conecta el canto interior de los^{ojos 19}. ST36 se encuentra en la extremidad posterior, inferior y lateral a la articulación de la rodilla, en una depresión aproximadamente 2 mm por debajo del borde inferior de la cabeza^{fibular 20,21}. Tras alcanzar un estado anestésico estable, el operador sostenía una aguja de acupuntura estéril desechable de acero inoxidable (especificación: 0,18 × 7 mm; véase Tabla de Materiales) en la mano derecha. Para los puntos de acupuntura de la cabeza (GV24 y GV20), el cuero cabelludo se levantaba suavemente con la mano izquierda y la aguja se insertaba de forma subcutánea en un ángulo de 15-30°, avanzando hacia atrás hasta una profundidad de unos 2 mm. Para el punto de acupuntura ST36 en la extremidad inferior, la aguja se insertó perpendicularmente a una profundidad de aproximadamente 3-4 mm. Los electrodos de salida del dispositivo de electroacupuntura (véase Tabla de Materiales) se conectaban entonces a las empuñaduras de las agujas: un juego de electrodos conectaba GV20 y el izquierdo ST36, mientras que el otro conjunto conectaba GV24 y el derecho ST36. Se aplicó estimulación simultánea con electroacupuntura mediante dos juegos de cables. Los parámetros EA se establecieron de la siguiente manera: onda continua, frecuencia 2 Hz^22,23. La intensidad actual fue aumentando gradualmente desde 0,1 mA hasta que se observó un leve espasmo rítmico del miembro local (normalmente mantenido alrededor de 2 mA). La electroacupuntura se realizó una vez al día durante 30 minutos, de forma continua durante 6 días con 1 día de descanso, para un tratamiento total de 2 semanas. Mientras tanto, los ratones de los grupos Con y CH fueron sometidos a anestesia y sujeción de duración y condiciones idénticas, pero sin inserción de aguja ni activación del dispositivo de electroacupuntura.

Prueba en campo abierto

Se realizó la Prueba de Campo Abierto (OFT) para evaluar la actividad locomotora espontánea, el comportamiento exploratorio y las respuestas similares a la ansiedad de ratones en un entorno^{novedoso 24}. El aparato OFT era un cubículo blanco (50 cm 50 cm 30 cm), cuyo suelo estaba prácticamente dividido en una cuadrícula de 25 cuadrados (cada uno de 10 cm 10 cm) para análisis conductual. Antes de la prueba formal, todos los ratones fueron aclimatados a la sala de pruebas durante 1 hora para minimizar el impacto del estrés inducido por el cambio ambiental en los resultados conductuales. Durante las pruebas, cada ratón fue colocado suavemente en el centro del aparato. Tras un periodo de habituación de 2 minutos, su comportamiento se registró formalmente durante 10 minutos. Toda la sesión se grababa utilizando un sistema de seguimiento de vídeo (véase Tabla de Materiales) para rastrear automáticamente la trayectoria del movimiento. Los parámetros analizados incluyeron la distancia total recorrida, el tiempo pasado en la zona central, la velocidad en la zona central y el número de entradas en la zona central. Todos los ratones comenzaron la exploración desde la misma ubicación central, y cada ratón fue probado solo una vez. Para evitar interferencias olfativas, el aparato se limpió a fondo con etanol al 75% tras la prueba de cada ratón

Laberinto acuático Morris (MWM)

La prueba del laberinto de agua Morris (MWM), un método estándar para evaluar la función de la memoria, se empleó principalmente para evaluar el aprendizaje espacial y las capacidades de memoria en^{ratones 25}. El aparato consistía en una piscina circular, de 120 cm de diámetro y 30 cm de profundidad, que conceptualmente se dividía en cuatro cuadrantes iguales (I, II, III, IV). Para minimizar las distracciones externas, se colgaron cortinas opacas alrededor de la piscina y se colocaron señales visuales distintivas en las paredes superiores, permaneciendo constantes durante todo el experimento. La piscina se llenó con agua mantenida a 22-24 °C, y el nivel del agua se mantuvo aproximadamente 1 cm por encima de la superficie de la plataforma. Se añadió polvo de dióxido de titanio no tóxico al agua a una concentración del 20% para volverla opaca, aumentando así el contraste entre el ratón y el fondo para un seguimiento de vídeo más preciso. El procedimiento experimental duró 6 días consecutivos, comprendiendo una fase de entrenamiento de adquisición espacial de 5 días seguida de un ensayo de sonda espacial de 1 día. Durante la fase de entrenamiento, se colocó una plataforma circular de 10 cm de diámetro en el cuadrante III, que servía como ubicación objetivo. El primer día, la plataforma se colocó ligeramente por encima de la superficie del agua (~1 cm) para familiarizar a los ratones con el objetivo de escape. Del segundo al quinto día, la plataforma estuvo sumergida aproximadamente 1 cm bajo la superficie del agua para evaluar el aprendizaje espacial. Cada día, cada ratón se colocaba secuencialmente en el agua mirando hacia la pared de la piscina desde cada uno de los cuatro cuadrantes en un orden predeterminado. El experimentador salía inmediatamente de la habitación tras colocar al animal para evitar convertirse en una señal espacial no deseada. El tiempo que tardaba en localizar la plataforma oculta (latencia de escape) se registraba en cada prueba. Si un ratón no encontraba la plataforma dentro del tiempo límite de 90 s, se le guiaba suavemente hasta la plataforma y se le permitía permanecer allí durante 30 s para reforzar el aprendizaje espacial, y su latencia se registraba como 90 s. Si el ratón encontraba la plataforma en menos de 90 s, se le permitía permanecer en ella durante 10 s. Después de cada sesión de entrenamiento, el ratón se secaba con una toalla y se le devolvía a su jaula de origen. La secuencia del cuadrante inicial variaba sistemáticamente, con un intervalo entre ensayos de aproximadamente 20 minutos para cada ratón. Un sistema de seguimiento de vídeo (véase Tabla de Materiales) registraba automáticamente parámetros como la distancia de nado, la velocidad y la latencia de escape. El sexto día se realizó un ensayo con sonda para evaluar la memoria espacial. La plataforma se retiraba del cuadrante objetivo (cuadrante III), y cada ratón se liberaba del cuadrante opuesto a la ubicación anterior (cuadrante I) y se le permitía nadar libremente durante 90 segundos. Se registraron el tiempo pasado en el cuadrante objetivo (donde antes se encontraba la plataforma), el número de cruces sobre la ubicación exacta de la plataforma anterior y la trayectoria de natación. Inmediatamente después del ensayo con la sonda, el ratón fue secado a fondo y devuelto a su jaula bajo una fuente de calor para evitar la hipotermia. Durante todo el experimento, la posición de todas las señales visuales alrededor del laberinto permaneció sin cambios para garantizar la consistencia en condiciones experimentales.

Ecocardiografía

La ecocardiografía en ratones es una técnica de imagen no invasiva y en tiempo real, fundamental para evaluar la estructura y función cardíaca, y se ha aplicado ampliamente en la investigación de modelos de enfermedades cardiovasculares. El examen se realiza bajo anestesia general, manteniendo el estado anestésico durante todo el procedimiento siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El ratón se coloca boca arriba sobre una plataforma controlada termostáticamente mantenida a 37 °C. Una vez que las extremidades están suavemente aseguradas, se aplica una crema depilatoria uniforme en la región torácica y abdominal. Todo el cabello y la crema residual se eliminan a fondo tras 1-2 minutos para garantizar una calidad óptima de transmisión de ultrasonidos. Para el monitoreo fisiológico en tiempo real, se utilizan parches de electrodos conectados a las extremidades mediante gel conductor para registrar continuamente el electrocardiograma y la frecuencia respiratoria. Para obtener vistas estándar de ultrasonido, la posición del ratón se ajusta para que su cabeza quede ligeramente más alta que la cola, asegurando que el eje largo del corazón sea paralelo a la plataforma. Se tiene especial cuidado para evitar aplicar una presión excesiva sobre la pared torácica con la sonda, ya que esto puede alterar la geometría cardíaca y afectar la precisión de las mediciones. Se aplica una generosa cantidad de gel de ecografía sin burbujas (de 2-5 mm de grosor) en la zona afeitada. Se utiliza una sonda de matriz lineal de alta frecuencia (30-50 MHz), con el marcador de orientación de la sonda apuntando consistentemente hacia la cabeza del ratón. La sonda se posiciona inicialmente paralela al eje largo del cuerpo del ratón y luego se rota en sentido antihorario aproximadamente entre 30°C y 45°. Se realizan ajustes finos para obtener una vista clara del eje largo parasternal del ventrículo izquierdo. La adquisición dinámica de la imagen comienza una vez que la imagen de la ecografía muestra claramente la cámara ventricular izquierda, las válvulas aórtica y mitral, y muestra la alineación horizontal del ápice cardíaco con el tracto de salida aórtico. Todas las imágenes son adquiridas por un operador experimentado utilizando configuraciones de parámetros consistentes para garantizar la comparabilidad de los datos. Tras el examen, la sonda de ultrasonido se limpia según los procedimientos estándar y se elimina cualquier gel residual del cuerpo del ratón. El ratón es trasladado a una jaula cálida para un seguimiento cercano hasta que se recupera completamente de la anestesia y recupera la normalidad de la marcha.

Preparación de secciones de parafina

Tras completar las pruebas de comportamiento, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (20 mg/kg). La fijación sistémica se logró entonces mediante perfusión transcárdica con solución salina, seguida de un 10% de paraformaldehído (véase la Tabla de Materiales). Tras extraer cuidadosamente los tejidos cerebrales, se sumergieron en un 10% de paraformaldehído durante 72 horas de fijación a temperatura ambiente. Es importante señalar que, dado que la perfusión cardíaca altera la microestructura miocárdica, las muestras cardíacas utilizadas para el análisis histológico en este estudio se obtuvieron específicamente de ratones que no se sometieron al procedimiento de perfusión, mientras que todas las demás condiciones de manipulación permanecieron idénticas. Al finalizar la fijación, los pañuelos se enjuagaron bajo agua corriente durante 6 horas. La deshidratación por gradiente posterior se realizó utilizando un procesador de tejidos automatizado (véase Tabla de Materiales), que implicó inmersión secuencial en etanol del 60%, 70% y 90% durante 1 hora cada uno, seguido de etanol en 95% y 100% durante 2 horas cada uno. Las muestras deshidratadas se eliminaron en xileno durante 2 horas y se infiltraron con parafina a 60°C durante 3 horas. Finalmente, los tejidos se incrustaron en parafina mediante una máquina de incrustación, asegurando una orientación anatómica estándar. Tras solidificarse completamente los bloques incrustados, se cortaban secciones en serie de 4 μm de grosor con un microtomo rotatorio, se montaban sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-L-lisina, se secaban al aire y se almacenaban para su posterior tinción y análisis.

Tinción por hematoxilina y eosina

El examen histológico de los tejidos cerebrales y cardíacos se realizó mediante tinción de hematoxilina y eosina (HE) para evaluar la lesión hipóxica y valorar los efectos terapéuticos de la intervención con electroacupuntura. Las secciones de tejido, de 4 μm de grosor, se deparafinizaron primero en xileno I y xileno II (10 min cada una) y luego se rehidrataron mediante una serie graduada de etanol (100%, 95% y 80%, 2 min cada una), seguida de un enjuague final con agua destilada. Para la tinción, las secciones se sumergieron en una solución de hematoxilina durante 3-8 minutos hasta lograr una tinción nuclear clara, se enjuagaron bajo agua corriente para inducir el azulamiento y posteriormente se contrateñieron con eosina durante 1-3 minutos para obtener la coloración rosada adecuada en el citoplasma. Finalmente, las secciones teñidas se deshidrataron con alcohol absoluto, se limpiaron con xileno y se montaron con bálsamo neutro.

Tinción de Nissl

Para evaluar el estado de supervivencia de las neuronas en la región hipocampal, se empleó tinción de Nissl para observar la distribución de los cuerpos de Nissl y la morfología celular dentro de las neuronas. Tras la deparafinización y rehidratación de las secciones de parafina del tejido cerebral, las rodajas se sumergieron en una solución precalentada de tinción de azul toluidina e incubaron a 56 °C en una incubadora a temperatura constante durante 1 hora. Después de teñir, las secciones se enjuagaron suavemente con agua destilada y luego se transfirieron a una solución diferenciadora Nissl durante varios segundos hasta 2 minutos. El proceso de diferenciación se monitorizaba cuidadosamente al microscopio hasta que el fondo quedaba casi incoloro. Posteriormente, las secciones diferenciadas se deshidrataban rápidamente mediante una serie absoluta de etanol, se limpiaban en xileno y finalmente se montaban con resina neutra para su conservación y observación permanente.

Tinción tricroma de Masson

La tinción tricroma de Masson, una técnica clásica de tinción del tejido conectivo, se empleó principalmente para distinguir fibras de colágeno de fibras musculares en tejido cardíaco. Tras la deparafinización y rehidratación de las secciones de parafina cardíaca, el procedimiento de tinción se realizó según las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit de tinción tricromo de Masson (véase Tabla de Materiales). El protocolo de tinción se llevó a cabo de la siguiente manera. Inicialmente, las secciones se sumergieron durante 4 minutos en una solución de trabajo de hematoxilina de hierro de Weigert recién preparada para teñir los núcleos, aplicando una agitación suave para asegurar una tinción uniforme. Posteriormente, las secciones se enjuagaron con agua corriente, se diferenciaron en alcohol ácido al 1% durante 5-10 segundos y luego se trataron con una solución azulante durante 4 minutos para obtener una tinción nuclear clara de azul púrpura. Las secciones se teñieron posteriormente con solución de fucisina de ácido Ponceau durante 5 minutos, seguidas de una diferenciación en solución de ácido fosfomilobdídico al 0,2% durante 1 minuto. Tras un breve enjuague en una solución ácida débil durante 1 minuto, las secciones se contra-tintaron con una solución azul de anilina al 0,2% (pH 6,8) durante 2 minutos para resaltar las fibras de colágeno. Al completar los pasos de tinción, las secciones se deshidrataron mediante una serie de etanol graduado, se limpiaron con xileno y finalmente se montaron con bálsamo neutro. Todas las secciones montadas se capturaron digitalmente utilizando un sistema de escaneo de diapositivas totalmente automatizado (véase Tabla de Materiales) para su posterior análisis.

Análisis estadístico

Los resultados obtenidos se presentan como la media ± SEM. Los datos se analizaron utilizando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de LSD o prueba t. Se utilizó ANOVA bidireccional para analizar los datos del OFT y el MWM. P < 0,05 se consideró el nivel de importancia. El análisis estadístico y los gráficos fueron creados por el software GraphPad Prism 9.0.

Resultados

La electroacupuntura mejora el comportamiento similar a la ansiedad y la disfunción cognitiva inducida por la hipoxia crónica sostenida en ratones.

El comportamiento similar a la ansiedad en ratones sometidos a CH fue evaluado inicialmente mediante OFT (Figura 3A). Los gráficos de trayectoria revelaron patrones de comportamiento distintos: los ratones control mostraron tendencias exploratorias robustas en el entor...

Discusión

Este estudio confirma que la hipoxia crónica a largo plazo puede inducir comportamientos similares a la ansiedad y deterioro de la memoria espacial en ratones, lo cual es coherente con los hallazgos de investigaciones^{anteriores 26,27}. Mientras tanto, descubrimos que la hipoxia crónica a largo plazo también puede causar disfunción cardíaca y daño estructural miocárdico. Sin embargo, actualmente carece de estrategias terapéuticas q...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de paraformaldehído al 10%	Bioroyee (Beijing) Biotechnology Co., Ltd	RL3234
ANY-laberinto	Ciencia	SA201	Sistema de seguimiento de vídeo
Ratones C75BL/6J	PEKÍN HFK BIOSCIENCE CO.,LTD	Nº 110322220103041767	Género: Masculino, y no de la nada; Peso: 18 y de la línea guion; 22 g
Agujas desechables de acupuntura	Huatuo	246076	Agujas estériles de acupuntura para un solo uso (0,25 mm y agudas; 13 mm)
Dispositivo de electroacupuntura	Gran Muralla	KWD-808 I
HistoCore MULTICUT - Microtomo rotatorio semiautomatizado	Alemania, Leica	RM2245	Cortador de parafina
Acupuntura Hwato  aguja	Fábrica de Aparatos Médicos de Suzhou	2655519
Isoflurano	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22
Kit de tinte tricromo de Masson' s	solarbio	G1340	Kit de tinción de masón
Laberinto acuático Morris	Sansbio	SA201	Dispositivo de laberinto acuático Morris
Patología digital NanoZoomer	Fotónica Hamamatsu K. K	C9600-01
NDP. Vista 2	Japón, Sakura		Software de escáner de diapositivas
Máquina de anestesia para animales pequeños	RWD	YL-LE-A106
Tissue Tech Prisma Plus	Japón, Sakura	20B2X00014000034	Dispositivo totalmente automatizado diseñado para teñir muestras como secciones de tejido incrustadas en parafina, secciones congeladas y células montadas en portaobjetos.
Módulo de Incrustación Tissue-Tek TEC 6	Japón, Sakura	M01-021E-02	Máquina de incrustación de parafina