Amyloide y la arquitectura Cross-Beta

Resumen

Las fibrillas amiloides se forman por numerosas proteínas, y las fibrillas resultantes comparten una estructura de "β de lámina cruzada". Aquí describimos cómo se pueden preparar muestras de fibrilla amiloide para la difracción de fibras de rayos X y cómo pueden analizarse los patrones.

Resumen

Las fibrillas amiloides están formadas por una proteína mal plegada y autoensamblada, organizada en una estructura bien definida y repetitiva. Son bien conocidos por su papel importante en enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y la diabetes tipo 2, en la que las fibrillas amiloides insolubles se depositan en los tejidos. Además, se ha comprobado que desempeñan un papel funcional importante en muchos organismos, proporcionando resistencia, andamiaje y protección. Los primeros modelos estructurales de amiloide se basaron en la recogida de datos de difracción de fibras de rayos X a partir de haces de fibrillas amiloides alineadas. Esto dio lugar a modelos tempranos de la estructura genérica de β cruzada, que ha sido reemplazada por un análisis de difracción más detallado de muestras altamente orientadas y semicristalinas, lo que ha dado lugar a detalles de la organización de péptidos en una arquitectura repetitiva. Aquí, nos centramos en describir métodos para determinar la arquitectura subyacente de estas fibrillas, y hemos identificado las características comunes de las fibrillas amiloides procedentes de diversas fuentes patógenas, funcionales y sintéticas. Describimos la preparación de las muestras, la recogida de datos y el posterior análisis de datos para producir una estructura de modelo que pueda compararse con los datos experimentales.

Introducción

Las fibrillas amiloides se identificaron por primera vez dentro de un grupo de enfermedades conocidas como amiloidosis, en las que las fibrillas proteicas se acumulan en los espacios extracelulares de los^{tejidos 1}. Cada enfermedad se caracteriza por una proteína precursora particular que sufre un cambio conformacional para formar fibrillas proteicas altamente ordenadas^{y estables 2,3}. La definición más reciente de fibrillas amiloides ahora incorpora fibrillas que se acumulan en el entorno celular. Más recientemente, se han identificado varios sistemas funcionales que utilizan la estructura amiloide para proporcionar estabilidad, adhesión o incluso almacenamiento de información. A pesar de la amplia variedad de estructuras proteicas que pueden autoensamblarse para formar fibrillas amiloides, todas comparten una estructura de β^{cruzada 4}. Esta disposición de β cruzada fue descrita por primera vez por Astbury para clara de huevo^{de gallina 5} y luego explicada más adelante por Geddes para seda cruzada β⁶. En esta arquitectura proteica, las fibrillas están formadas por hebras de β que corren perpendiculares al eje de la fibrilla, que luego se disponen en láminas de β que se asocian a través de las cadenas laterales para formar lo que más tarde se denominó cremalleras^{estéricas 7}. Esto crea una organización altamente estable unida mediante enlaces de hidrógeno que corren paralelos a la fibra, junto con interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y polares a través de cadenas^{laterales 8}.

Los primeros estudios estructurales utilizaron difracción de fibras de rayos X para examinar la estructura de las fibrillas amiloides, mediante las cuales las fibrillas se alineaban y orientaban para formar un haz de fibrillas amiloides que podían colocarse en el haz de rayos X de un difractómetro ^9,10. Se generó una estructura genérica de fibrillas amiloides para ajustarse a los patrones de difracción de varias fibrillas amiloides extraídas de tejido de enfermedades humanas o cultivadas in vitro^4, lo que ha proporcionado una base para descripciones estructurales^{posteriores 11}. En los últimos años, los avances en resonancia magnética nuclear en estado sólido (ssNMR), cristalografía de rayos X en microcristales y microscopía electrónica criogénica (CryoEM) han proporcionado detalles atómicos para la estructura de β^{cruzada 11}. Sin embargo, el método de difracción de fibras de rayos X sigue siendo importante y útil, y proporciona información sobre la organización repetitiva de las proteínas. Además, en algunos casos, puede estar disponible información relacionada con una orden de largo plazo. Fundamentalmente, la difracción de fibras de rayos X se utiliza a menudo para confirmar la presencia de fibrillas amiloides formadas a partir de diferentes proteínas, y el patrón de β cruzado es uno de los principales requisitos para que un ensamblaje fibroso se clasifique como^{amiloide 12}.

Aquí describimos la metodología utilizada para preparar las fibrillas amiloides y las alineamos para la recogida de datos de difracción de fibras de rayos X. Además, proporcionamos detalles de cómo se pueden analizar más a fondo los datos de difracción para generar una estructura de modelo, su patrón de difracción previsto y compararlo con datos de difracción de fibrillas derivadas ex vivo.

Protocolo

1. Preparación de muestras fibrilares para difracción de fibras de rayos X

1. Disolver la proteína o péptido de interés en condiciones óptimas para la formación de fibrillas del péptido amiloidogénico seleccionado y evaluar la formación de fibrillas mediante microscopía electrónica o microscopía de fuerza atómica. Detalles sobre cómo preparar muestras y realizar imágenes están disponibles en otro^{lugar 13}. Asegúrese de que las fibrillas sean largas, rectas y sin ramificaciones, como se muestra en la Figura 1. Por ejemplo, las fibrillas mostradas en la Figura 1 fueron fotografiadas mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Coloca una gota que contenga fibrillas en una rejilla de microscopio electrónico y luego tiñe negativamente usando acetato de^{uranilo 14}.
   NOTA: Es deseable una cobertura y distribución uniforme de las fibrillas en la cuadrícula.
2. Alinear para producir un haz de fibrillas cuyos ejes fibrados son idealmente todos paralelos (Figura 2A).
   1. Funde la cera de vela hasta que esté líquida usando una placa caliente. Usando un cortador de vidrio como un bolígrafo de diamante, corta capilares de vidrio borosilicato de 1 mm de aproximadamente 2-3 cm de longitud y sumérjalos brevemente en la cera líquida. Aspira la cera de vela por acción capilar (aproximadamente 1-2 mm de longitud dentro del capilar). Asegúrate de que la superficie de cera sea plana para que la suspensión de la fibrilla pueda descansar de forma uniforme.
   2. Utiliza plastilina para fijar los capilares sellados horizontalmente en una placa de Petri con un espacio de 0,5 mm a 2 mm entre los extremos rellenos de cera (Figura 2A).
   3. Con una pipeta, suspende cuidadosamente una gota de 10 μL de solución entre los extremos rellenos de cera de los dos capilares. Asegúrate de que la solución haga contacto con ambos extremos de cera pero no se extienda sobre el vidrio.
   4. Protege la muestra del polvo cubriendo la placa de Petri. Dejar que la muestra se evapore durante la noche, lo que resulta en la alineación de las fibrillas (véase la Figura 2A).
      NOTA: Puede tardar varios días en secarse completamente la muestra, y esto dependerá de la temperatura y humedad ambiente, así como de la viscosidad de la muestra.
   5. Sella la placa; incubar a temperaturas más bajas en un frigorífico o incubar usando humedad en una caja sellada para ralentizar el secado, lo que puede resultar en una mejor alineación de la muestra.
3. Alinear las fibrillas amiloides en un capilar de vidrio (Figura 2B).
   1. Fija una jeringuilla de 1 mL con un pequeño trozo de tubo de goma en el extremo ancho a un capilar de cristal siliconado de 0,7 mm de diámetro y aspira 2-3 cm de suspensión de fibrillas.
   2. Sella un extremo del capilar con cera derretida y deja que el otro extremo permanezca abierto para permitir la evaporación. Coloca el capilar en vertical y déjalo secar durante varios días o semanas hasta que forme un disco seco en el tubo capilar (Figura 2B).
4. Alinea las fibrillas como una "estera" o película fina (Figura 2C).
   1. Coloca una muestra de alta concentración (por ejemplo, >10 mg/mL) de fibrilla sobre una lámina de vidrio, parafilm o trozo de teflón, y déjala secar al aire durante al menos 24 horas. Esto debería secarse para formar una película fina y plana en la superficie. Levanta cuidadosamente esto con un bisturí y luego únelo a un tubo capilar de vidrio usando pegamento o plastilina.
   2. La alfombra tendrá una disposición aleatoria de fibrillas (véase la Figura 2C). Monta cuidadosamente la muestra sobre una cabeza goniómica para que el haz de rayos X pase por el borde de la muestra y sea paralelo al plano de la película (Figura 2C).
      NOTA: La difracción a través de la cara de la película producirá anillos de difracción debido a la alineación aleatoria (véase la Figura 2C).
5. Examina la muestra.
   1. Investiga qué tan bien está alineada la muestra examinándola a través de un polarizador cruzado bajo un microscopio óptico. Si hay birrefringencia, puede sugerir que hay una buena alineación en el haz de fibrillas.
   2. Coloca la muestra de fibra capilar en una cabeza goniómétrica usando plastilina. Considera si la muestra es un haz de fibra, estera o disco al colocarla en el haz de rayos X.
      1. Nótese que el eje de rotación de la muestra estará alrededor del eje de la fibra para un haz de fibras (Figura 2A), mientras que en los discos las fibras tienden a alinearse a lo largo del diámetro del tubo (Figura 2B). Una esterilla tendrá dos direcciones distintas (paralela al plano de la película y perpendicular a ella) (Figura 2C).
   3. Recoge un patrón de difracción (como se muestra en la Figura 3A) utilizando equipos de rayos X propios (CuKα para cristalografía de proteínas) o radiación sincrotrón. Los tiempos de exposición variarán según la intensidad del haz de rayos X; Ajusta esto según los tiempos recomendados de recogida para la fuente de difracción.

2. Análisis de datos

1. Uso de CLEARER para análisis^{de datos 15}.
   NOTA: El programa de análisis de patrones de difracción de fibras de rayos X está disponible gratuitamente para usuarios académicos por parte del autor correspondiente. Existen otros métodos para el análisis de difracción^16,17 (www.esrf.fr/computing/expg/subgroups/data_analysis/FIT2D)¹⁸. Las cursivas entre paréntesis indican comandos de menú.
   1. Convierte el patrón de difracción a un archivo .tiff y súbelo a CLEARER (Figura 4).
   2. Introduce los ajustes de difracción (Patrón de difracción: ajustes de difracción), incluyendo el tamaño del píxel en la imagen TIFF, la fuente de rayos X y la distancia entre la muestra y el detector.
   3. Asegúrese de que el patrón de difracción esté orientado de modo que el meridiano sea vertical (Procesamiento de imágenes: Rotar). Utiliza el módulo de centrado (Patrón de Difracción: Imagen Central) para centrar la imagen. Defina los dos ejes principales (meridiano y ecuador): Este módulo compara la intensidad a lo largo de estos dos ejes del patrón. Una vez completado el centrado, guarda la imagen y asegúrate de que se utilice en los pasos siguientes.
   4. Especifica un ángulo adecuado (configurado a lo largo de los dos ejes principales [meridiano y ecuador]) y genera un gráfico que muestre la posición de la señal de difracción frente a la intensidad usando el módulo de promedio radial (patrón de difracción: promedio radial) (Figura 4A).
   5. Mide y emite automáticamente las posiciones de la señal de difracción usando el módulo Peak Find (Patrón de Difracción: Promedio Radial: Pico Find) (Figura 4B). Asegúrese de que todas las señales de difracción se detecten con precisión ajustando el ancho de búsqueda pico mientras se asegura de que no se detecte ruido.
   6. Revisa las posiciones de señal emitidas por Peak Find usando el módulo Zoom & Measure (Patrón de Difracción: Zoom & Measure). Verifica que todas las posiciones de señales estén listadas y asignadas al eje correcto.
   7. Explora las dimensiones de celda unitaria (b y c) que generarán las señales de difracción observadas utilizando el módulo de Optimización de Celda Unitaria (Patrón de Difracción: Optimización de Celda Unitaria) (Figura 5A). Examina las señales fuertes encontradas en el ecuador para generar una estimación inicial que introducir en la tabla de entrada de celdas unitarias y especifica los índices mínimo y máximo [hkl] sobre los cuales CLEARER busca celdas potenciales (una dimensión es meridional y por defecto es 4,76 Å).
   8. Calcular las dimensiones potenciales de la celda unitaria y comparar las posiciones predichas de la señal de difracción con las reflexiones observadas. Las celdas unitarias se puntuan en función del grado de concordancia entre las señales predichas y experimentales. A continuación, se muestran los veinte mejores combates. Considera la longitud del precursor peptídico y otra información de microscopía electrónica, AFM o resonancia magnética nuclear de estado sólido (ssNMR) para ayudar a seleccionar las mejores celdas unitarias posibles que se ajusten a los datos y a la muestra.

3. Modelado estructural y pruebas del modelo usando CLEARER

1. Construir modelos moleculares (formato PDB).
   NOTA: Utilice programas de modelado de proteínas como Pymol (DeLano)¹⁹ o Insight II (Accelerys) y otros, para generar coordenadas PDB del péptido precursor en conformación de β cadena y en una disposición de β hojas. Esta sección describe un proceso sencillo utilizado para una celda unitaria ortorrómbica (todos con ángulos de 90°). Existen organizaciones no ortogonales cuando se requiere un conocimiento más experto de difracción. Estos pueden explorarse en CLEARER para celdas unitarias más complejas.
   1. Construye disposiciones tridimensionales de los péptidos en una disposición de láminas β para que encajen en la(s) celda(s) unitaria(s) determinada(s). Asegúrate de que este modelo contiene todos los objetos relacionados con simetría dentro de la celda.
   2. Carga el modelo PDB en el módulo Generador de Cadena de Estructuras (Simulación de Difracción: Estructuras: Generador de Cadenas de Estructuras) para comprobar las coordenadas estructurales construidas. Asegúrate de que el eje de la fibra y el eje de la viga estén correctamente asignados. Introduce las dimensiones determinadas de la celda unitaria. Comprueba si se produce choque para las dimensiones seleccionadas de las celdas (Figura 5B).
   3. Sube las coordenadas del modelo PDB al módulo de Simulación de Difracción de Fibra (Simulación de Difracción: Simulación de Difracción de Fibra).
      1. Introduce la dirección del eje de la fibra, la orientación del haz, las dimensiones de la celda unitaria seleccionadas del paso 3.1.2, la fuente de rayos X y los ajustes del detector, y haz clic en simular. Para una simulación de celda unitaria ortorrómbica, el eje de la fibra se define por el eje cartesiano relacionado con la orientación del eje de la fibra en el modelo utilizado.
      2. Asegúrate de que los ejes de la viga estén perpendiculares al eje de la fibra, es decir, en uno de los otros dos ejes posibles. Guarda los ajustes de simulación como archivos .html (Archivo: Guardar como). Estos pueden subirse y editarse más tarde para explorar iterativamente la estructura óptima del modelo.
      3. Guarda el patrón simulado resultante en un formato en bruto, que puede subirse más tarde para un análisis posterior, o como .tiff (este formato tiene información adicional de contraste descartada) (Simulación: Guardar la imagen visible como TIFF). Luego, compáralo con el patrón experimental.
2. Comparar patrones simulados de difracción con patrones experimentales para la presentación.
   1. Utiliza los pasos 2.1.5-2.1.6 para medir señales simuladas de difracción y comparar con las medidas de patrones experimentales (Figura 6). Anota esto en una tabla.
   2. Utiliza un módulo llamado Capas (Patrón de Difracción: Capas) para superponer patrones simulados y experimentales y comparar posiciones de señal ( Figura 6C).
   3. Compare las posiciones de la señal e intensidades relativas entre los patrones experimentales y simulados organizando un cuadrante del patrón simulado junto al patrón experimental (como se muestra en la Figura 6B)^8,20,21.
   4. Evalúa la validez de una celda unitaria y modelo sugeridos, y luego altera iterativamente el modelo y la celda para mejorar la similitud entre el patrón simulado y el patrón experimental de difracción.
   5. Compara extensamente los resultados de diferentes modelos y células utilizando el procedimiento descrito en el paso 3.1 para probar varias alternativas. Asegúrese de que la información recogida de otras técnicas, como TEM, AFM y RMN, se considere que limita la modelización y que se logra la mejor representación estructural posible que encaje con^{los datos} 8,21,22,23.

Resultados

Ejemplo²⁴ de CcbMet: La Figura 1 muestra micrografías electrónicas que muestran una alta densidad de fibrillas amiloides en una rejilla adecuada para la preparación de una muestra de fibra de rayos X. La Figura 2 describe las diferentes texturas que pueden generarse a partir del haz de fibras de muestras fibrosas (Figura 2A), disco (

Discusión

La difracción de fibras de rayos X puede utilizarse para evaluar si una muestra está formando una estructura amiloide y para obtener una mayor comprensión de la organización molecular de la proteína precursora o el péptido dentro de las fibras. Aquí hemos descrito los métodos mediante los cuales se pueden preparar muestras fibrosas para la difracción de fibras de rayos X, obtener datos y luego analizarse. De forma crítica, la calidad de los datos obtenidos dependerá tanto del orden dentr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Capilares de cuarzo para rayos X de 0,7 mm de diámetro	GLAS, W. Muller, D-13503, Berlín, Alemania	Q-07-001-80
Cápsulas de vidrio de 1,5 mm de borosilicate	Harvard apparatus Ltd, (Edenbridge, Kent, UK)	BS4 30-0074	ejemplo, disponible en otros fabricantes
Difractómetro de rayos X para cristalografía de proteínas	Varios		Varios fabricantes