Un flujo de trabajo integral para la proteómica plasmática mediante espectrometría de masas: una estrategia para el descubrimiento de biomarcadores en enfermedades sistémicas humanas

Resumen

La proteómica plasmática permite el descubrimiento de biomarcadores para enfermedades sistémicas mediante muestreo mínimamente invasivo. A pesar de los retos analíticos derivados de la complejidad plasmática, este estudio presenta un flujo de trabajo optimizado de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS) que mejora la cobertura del proteoma, reduce la variabilidad y mejora la reproducibilidad, permitiendo comparaciones precisas entre muestras de enfermedad y de control.

Resumen

El plasma, el componente libre de células de la sangre, ofrece una fuente mínimamente invasiva y rica de información biomolecular, lo que lo hace ideal para investigar enfermedades sistémicas. La llegada de tecnologías proteómicas de alto rendimiento ha revolucionado el análisis plasmático al permitir la identificación y cuantificación a gran escala de proteínas circulantes. Estos avances han facilitado el descubrimiento de biomarcadores para el diagnóstico temprano, el pronóstico y la selección terapéutica de diversos trastornos, incluidos los cánceres y enfermedades inflamatorias. Sin embargo, la complejidad inherente del plasma, junto con métodos inconsistentes de preparación y análisis de muestras, ha limitado históricamente la cobertura y la reproducibilidad del proteoma. Los primeros enfoques basados en análisis de plasma crudo a menudo sufrían de mala consistencia y efectos significativos en lotes, lo que dificultaba estudios comparativos fiables entre cohortes clínicas.

Para superar estas limitaciones, el estudio actual introduce un flujo de trabajo robusto y escalable de proteómica de plasma. El protocolo integra pasos preparatorios clave como la inmunodepleción, la filtración de corte de peso molecular, la liofilización, la cuantificación y normalización de proteínas, la digestión enzimática y el perfilado LC-MS/MS. Esta estrategia optimizada mejora significativamente la profundidad del proteoma y reduce la variabilidad, permitiendo así un análisis de expresión diferencial proteica más preciso y reproducible entre casos de enfermedad y controles sanos. El flujo de trabajo proporciona una plataforma valiosa para los investigadores que buscan generar datos proteómicos de alta calidad a partir del plasma, contribuyendo en última instancia al avance del diagnóstico basado en biomarcadores y la medicina personalizada.

Introducción

El plasma, el componente libre de células de la sangre, está ganando cada vez más reconocimiento como un reservorio de información biológica relevante para los estudios de enfermedades. Alberga una gran variedad de biomoléculas circulantes diversas, que van desde proteínas y metabolitos hasta lípidos y ácidos nucleicos, lo que refleja el estado fisiológico y patológico del organismo. Esta naturaleza sistémica del plasma lo convierte en una muestra biológica ideal para investigar la fisiopatología de las enfermedades, que van desde el cáncer hasta trastornos metabólicos e inflamatorios. Un beneficio importante de usar plasma como muestra radica en su método de recogida mínimamente invasivo, que permite muestreos repetidos en entornos clínicos, lo cual es importante para la observación de la progresión de la enfermedad o la respuesta terapéutica. Sin embargo, el plasma presenta una matriz proteómica extremadamente compleja, por la cual proteínas como albúmina e inmunoglobulina abarcan más de diez órdenes de magnitud, enmascarando^{la identificación 1}.

En las dos últimas décadas, la proteómica plasmática ha permitido la identificación de biomarcadores clínicamente relevantes como la gonadotropina coriónica beta humana (β-hCG) y la troponina I, impulsadas por los avances en tecnologías de análisis de proteínas^{a gran escala 2}. Estas herramientas aceptan, como entrada, información altamente sensible y, gracias a su naturaleza de alto rendimiento, proporcionan un perfilado a gran escala de proteínas plasmáticas. Con la llegada de las plataformas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS/MS), ahora es posible analizar miles de especies de proteínas utilizando tan solo 10-50 μL de plasma de entrada, con un rango dinámico de detección que abarca varios órdenes de^{magnitud 3,4}. Esto ha incrementado el uso de la proteómica plasmática en la investigación traslacional: detección temprana de enfermedades, mejoras en modelos pronósticos y descubrimiento de nuevos objetivos terapéuticos⁵.

Un hito importante en esta área fue el establecimiento del Proyecto de Proteoma del Plasma Humano (HUPO-HPPP), que catalogó sistemáticamente proteínas plasmáticas y demostró la viabilidad de la proteómica plasmática como campo^{establecido 6}. Posteriormente, el Consorcio Clínico de Análisis Proteómico de Tumores (CPTAC) adoptó protocolos rigurosamente validados y estudios interlaboratorios para abordar cuestiones de reproducibilidad que anteriormente desconcertaban la investigación^{proteómica 7}. Estas iniciativas subrayaron la necesidad de estandarización y destacaron procedimientos clave, incluyendo el manejo uniforme del plasma, el agotamiento de proteínas abundantes, la digestión enzimática y parámetros consistentes de LC-MS/MS. Estudios recientes de Geyer y colegas demostraron que las firmas proteómicas plasmáticas pueden generarse de forma fiable en muchos individuos cuando se utilizan metodologías estandarizadas, proporcionando una base para estudios a nivel poblacional y procesos de validación de^{biomarcadores 8}.

La progresión de la proteómica plasmática ha sido moldeada considerablemente por el reconocimiento del control de calidad (QC) y las métricas de rendimiento como componentes críticos del diseño experimental. Convencionalmente, las diferencias en la eficiencia de la digestión, las tasas de identificación de péptidos y el rendimiento del instrumento han provocado inconsistencias entre estudios de investigación, afectando así la reproducibilidad. Se han realizado numerosos estudios para abordar estos problemas. Gawor et al. expusieron indicadores de calidad medibles para la preparación de muestras y el rendimiento de espectrometría de masas, proporcionando así un método sistemático para evaluar la robustez de la cadena de perfilado^{de proteínas 9}. Tsantilas et al. presentaron herramientas de benchmarking informatizadas que permiten a los investigadores comparar conjuntos de datos entre plataformas y laboratorios, aumentando así la transparencia en la presentación de datos de proteómica¹⁰. Además, los avances en metodología, como la inmunodepleción, la fraccionación por exclusión de tamaño y la adquisición independiente de datos (DIA), han mejorado la cobertura del proteoma y reducido el sesgo técnico^11,12. Estas medidas de aseguramiento de la calidad aseguran que los datos proteómicos plasmáticos sean reproducibles y sirvan como andamiaje para futuros estudios de traducción clínica.

A pesar de estos avances significativos, la complejidad inherente del plasma sigue presentando desafíos. Es común que el análisis directo de plasma crudo dé una cobertura subóptima de proteoma, ya que proteínas muy abundantes superan a los analitos de baja abundancia, muchos de los cuales son los candidatos a biomarcadores más prometedores. Además, la variación técnica derivada de la cuantificación variable de proteínas, la digestión incompleta y la limpieza insuficiente pueden contribuir a artefactos de lote y a una disminución de la comparabilidad^{de cohortes 13}. Estas limitaciones subrayan la necesidad de flujos de trabajo altamente optimizados que equilibren la profundidad del proteoma, la reproducibilidad y la escalabilidad. Este protocolo de estudio aborda esta necesidad demostrando un flujo de trabajo optimizado para la proteómica plasmática que combina inmunodepleción, filtración de corte en peso molecular, liofilización, normalización y cuantificación de proteínas, digestión enzimática y perfilado LC-MS/MS. Al aumentar la cobertura del proteoma y reducir la variación técnica, el marco metodológico permite una cuantificación relativa consistente entre los grupos afectados por la enfermedad y los grupos de control. Al introducir escalabilidad y acomodar análisis posteriores, el flujo de trabajo proporciona un método utilizable y reproducible para extraer información clínicamente significativa de la proteómica plasmática.

Protocolo

Este protocolo describe un flujo de trabajo optimizado diseñado para mejorar la proteómica plasmática para el descubrimiento de biomarcadores en enfermedades inflamatorias^{sistémicas 14,15}. El estudio se realizó de acuerdo con el Comité de Ética Institucional y la Declaración de Helsinki de 1975, revisada en 2000. Se obtuvo el consentimiento informado de los participantes. Inicialmente, las muestras de plasma sufren inmunodepleción para eliminar proteínas de alta abundancia, seguidas de una filtración basada en peso molecular para reducir la complejidad de la muestra. Las muestras se liofilizan y cuantifican para asegurar que la concentración de proteínas sea adecuada para el procesamiento posterior. Tras la normalización, las proteínas se someten a digestión tríptica para generar péptidos adecuados para su análisis. Finalmente, la espectrometría de masas se emplea para detectar y cuantificar proteínas de baja abundancia, facilitando comparaciones fiables entre condiciones sanas y de enfermedad (la Figura 1) muestra la cadena de proteómica sanguínea.

1. Recogida de muestras:

1. Obtener 3 mL de sangre de los participantes en tubos de vacutainer de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) mediante venopunción de la vena antecubital en condiciones asépticas. Esto lo realiza un flebotomista cualificado.
2. Para separar el plasma, centrifugar las muestras (rotor de ángulo fijo con 12 × 15 mL) durante 10 minutos a 704 g. Conserva las muestras de plasma almacenadas a -80 °C hasta el examen posterior.

2. Inmunodepleción

NOTA: La inmunodepleción es un método basado en cromatografía de afinidad utilizado para eliminar selectivamente proteínas de alta abundancia de fluidos biológicos como suero, plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR). Un cartucho spin que contiene anticuerpos inmovilizados es objetivo y captura 14 proteínas comunes de alta abundancia, incluyendo albúmina, inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM), transferrina y complemento C3. Estas proteínas se retienen en el cartucho mientras que las proteínas de baja abundancia pasan para un análisis posterior. La técnica mejora el perfilado proteómico al reducir la complejidad de la muestra y mejorar la detección de posibles biomarcadores. Este enfoque está ampliamente adoptado en proteómica plasmática para mejorar la sensibilidad y la^{reproducibilidad 16,17}.

1. Preparación del cartucho
   1. Saca el cartucho de spin de 0,45 mL de la nevera. Déjalo equilibrarse con la temperatura ambiente.
   2. Preparar el buffer A Equil/Load/Wash y el buffer B Elution según el número de muestras procesadas. Aplicar aproximadamente 5 mL de tampón A y 2 mL de tampón B por cada muestra de plasma de 10 μL. Decanta en tubos centrifugadores estériles de 50 mL.
   3. Etiqueta dos jeringuillas estériles Luer-Lok de 5 mL como A para el Buffer A y B para el Buffer B.
2. Preparación de muestras de plasma
   1. Diluir cada 10 μL de muestra de plasma con 190 μL de Buffer A hasta un volumen final de 200 μL.
      NOTA: Añadir inhibidores de proteasas al Buffer A para evitar la degradación de proteínas plasmáticas durante el procesamiento.
   2. Una muestra de plasma puede contener partículas en suspensión. Puede obstruir el cartucho. Para evitar obstrucciones y mejorar la claridad de la muestra, centrifugar la muestra diluida a través de un filtro de spin de 0,22 μm durante 1 minuto a 16.000 ×g a 4 °C.
3. Configuración del cartucho
   1. Quita la tapa del cartucho y la de abajo y guárdalas para usarlas después.
   2. Coloca un adaptador Luer-Lok en el cartucho de spin.
   3. Extrae 4 mL de buffer A de la jeringuilla etiquetada como "A" y conecta la jeringuilla al adaptador Luer-Lok.
   4. Haz fluir gradualmente el buffer A a través del cartucho para permitir que la resina se equilibre y desplazar cualquier aire atrapado.
   5. Aspira el exceso de buffer de la parte superior del cartucho con una micropipeta estéril.
   6. Retira el adaptador Luer-Lok y deposita el cartucho de centrifugación en un tubo de recogida con tapón de rosca marcado como F1.
4. Carga de muestras y recolección de fracciones
   1. Añade 200 μL de plasma filtrado y diluido directamente sobre la cama de resina.
   2. Centrifuga el cartucho a 100 × g durante 1 minuto a 4 °C. Deja el cartucho sin tapa o con tapa flojo para permitir un flujo suave.
   3. Recoge la fracción de flujo directo F1 en el tubo de recogida etiquetado. Asegúrate de que la cama de resina y la frita permanezcan húmedas tras la centrifugación.
   4. Deja reposar el cartucho a temperatura ambiente durante 5 minutos.
5. Lavado y recuperación de fracciones de flujo
   1. Añade 400 μL de Buffer A sobre la cama de resina y centrifuga a 100 × g durante 2,5 minutos a 4 °C. Añade este eluado al tubo de recogida de F1.
   2. Transfiere el cartucho a un nuevo tubo de recogida etiquetado como F2.
   3. Añade otros 400 μL de Buffer A y centrifuga a 100 × g durante 2,5 minutos a 4 °C. Recoge el eluado en el tubo F2.
6. Elución de proteínas unidas
   1. Quita el cartucho del tubo F2 y conecta el adaptador Luer-Lok.
   2. Llena la jeringuilla etiquetada como "B" con 2,5 mL de Buffer B y conéctala al cartucho.
   3. Empuja lentamente el Buffer B a través del cartucho para eluir las proteínas unidas y de alta abundancia a un tubo de recogida fresco.
      NOTA: Guardar la fracción acotada si se requiere un análisis adicional; de lo contrario, descarta adecuadamente.
7. Reequilibrio del cartucho
   1. Retira la jeringuilla que contiene el Buffer B del cartucho y coloca la jeringuilla etiquetada como "A" que contiene 5 mL de Buffer A.
   2. Empuja lentamente el buffer A a través del lecho de resina para reequilibrar el cartucho a un caudal de 0,5 mL por minuto.
      NOTA: No permitas que la cama de resina ni la frita se sequen. Deja una pequeña cantidad de tampón encima de la frita durante el almacenamiento.
   3. Una vez equilibrado, el cartucho está listo para la siguiente muestra.
8. Uso aguas abajo
   1. Para la máxima recuperación de proteínas de baja abundancia, combina fracciones de flujo directo F1 y F2.
      NOTA: F1 y F2 también pueden analizarse por separado si se requiere análisis diferencial. El buffer añadido es de 1 mL, por lo que la fracción combinada de F1 puede ser de ~850 μL para asegurar una buena recuperación. Analizar el plasma crudo, el flujo y el eluado mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE) para confirmar la eliminación de las 14 proteínas principales de alta abundancia del flujo directo. Se utilizarán 12,5 μL de flujo a través de F1, plasma crudo y eluato para cargar en gel y así obtener un volumen de pozo de 25 μL (tampón de muestras de Laemmli: relación de muestra 2:1)

3. Concentración de proteínas usando un concentrador de espín de 5 kDa

NOTA: Concentrar una muestra usando un concentrador de espín de 5 kDa se basa en el principio de exclusión de tamaño y filtración molecular para lograr una concentración rápida y una alta recuperación de biomoléculas objetivo en un solo tubo. Esto permite la concentración de proteínas mediante la eliminación del intercambio de disolventes y tampones o la desensalada de la solución proteica.

1. Llena el concentrador de centrifugado con hasta 4 mL de la muestra de proteína.
2. Coloca el concentrador de espín en una centrífuga refrigerada.
3. Centrifugar a 5.000 × g a 10 °C durante 30 minutos, o hasta alcanzar la reducción de volumen deseada (por ejemplo, concentración del 30×).
4. Retira el concentrador de espín de la centrífuga y recupera la muestra concentrada del fondo de la cámara de retento usando una micropipeta. Para asegurar una buena recuperación, se espera un concentrado de ~150 μL recuperado de un total de 850 μL de una muestra de proteína.
   NOTA: Asegúrese de que la membrana no se reseque durante la centrifugación para mantener la integridad de las proteínas y la eficiencia en la recuperación.

4. Desalado e intercambio de tampón

1. Descarta el filtrado de la cámara inferior del concentrador.
2. Rellene el tubo de la centrífuga con un volumen igual de 50 mM de tampón de bicarbonato de amonio (pH 7,2-7,4). (Por ejemplo, si el retentado es de 150 μL, se añaden 150 μL de buffer)
3. Centrifugar de nuevo a 5.000 × g a 10 °C hasta alcanzar la concentración original.
4. Repite este proceso de intercambio de tampón tres veces para eliminar aproximadamente el 99% de los contaminantes de pequeñas moléculas como sales o urea.
5. Concentra las muestras de proteína liofilizándolas usando un liofilizador rápido al vacío.
   NOTA: Ajusta el número de ciclos en función del grado de dessalado necesario para aplicaciones aguas abajo.

5. Cuantificación de proteínas mediante ensayo de ácido bicinquinínico (BCA)

NOTA: La concentración de proteínas de las muestras se determinó mediante el ensayo de proteínas BCA, con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar. El ensayo BCA es un método colorimétrico compatible con detergentes, basado en ácido bicinconinico, para detectar y cuantificar la proteína total. Se basa en la reducción de Cu²⁺ a Cu⁺ por proteínas en un ambiente alcalino (la reacción de Biuret), seguida de una detección colorimétrica altamente sensible y selectiva del ion cuproso (Cu⁺) mediante un reactivo que contiene ácido bicinconínico. El ensayo produce un complejo de color púrpura formado por la quelación de un ion cuproso con dos moléculas de BCA. El ensayo BCA produce una respuesta consistente y lineal con BSA, asegurando una referencia fiable de curvas estándar. Aunque se sabe que diferentes proteínas producen distintas respuestas en el ensayo de BCA, el uso de BSA proporciona una cuantificación relativa reproducible entre muestras diversas. Dado que nuestro objetivo era la normalización para una carga igual de proteínas en lugar de la cuantificación absoluta de todas las especies, la calibración basada en BSA ofrecía el enfoque más robusto y reproducible.

1. Procedimiento
   1. Añadir 25 μL de cada estándar BSA (rango de trabajo 20-2000 μg/mL) y la muestra de proteína desconocida en pozos designados de una placa de 96 pozos.
   2. Añade 200 μL de reactivo BCA funcional a cada pozo.
   3. Mezcla bien usando un agitador microplate durante 30 s.
   4. Cubre la placa e incuba a 37 °C durante 30 minutos.
   5. Lleva el plato a temperatura ambiente.
   6. Mide la absorbancia a 562 nm usando un lector de microplacas.
2. Análisis de datos
   1. Resta la absorbancia media del blanco (proteína cero) de todos los valores de absorción de muestra y estándar.
   2. Grafica una curva estándar de absorbancia frente a concentración de BSA (microgramo/microlitro).
   3. Utiliza la ecuación de regresión de la curva para calcular concentraciones de proteínas en muestras desconocidas.

6. Normalización de la concentración de proteínas

1. Procedimiento
   1. Mide la concentración de proteínas de cada muestra de plasma utilizando un método de cuantificación adecuado.
   2. Registra la concentración y el volumen total de cada muestra.
   3. Prepare 50 mM de tampón de bicarbonato de amonio (pH 7,8) como diluyente.
   4. Calcular la dilución requerida usando la fórmula C₁V₁ = C₂V₂.
   5. Para una muestra con una concentración de 1,3 mg/mL y un volumen de 100 μL, calcular el volumen final necesario para alcanzar 1 mg/mL:[V₂ = \frac{1,3 \multiplicado por 100}{1} = 130\ \mu L]
   6. Calcular el volumen de búfer a sumar restando el volumen inicial del volumen final: Volumen de tampón = 130 μL − 100 μL = 30 μL.
   7. Añadir 30 μL de 50 mM de bicarbonato de amonio (pH 7,8) a la muestra de plasma de 100 μL.
   8. Mezcla la muestra suavemente pipeteando o haciendo un vórtice breve.
   9. Confirma que el volumen final es de 130 μL a una concentración normalizada de 1 mg/mL.
   10. Proceder con la preparación de muestras proteómicas aguas abajo.
       NOTA: Asegúrese de ajustar la concentración con precisión calculando el factor de dilución requerido en función de los resultados del ensayo BCA. Cada paso se valida y los datos se dan como datos suplementarios (Tabla Suplementaria 1).

7. Preparación de muestras y digestión tríptica

1. Reducción de proteínas
   1. Añadir un agente reductor adecuado (por ejemplo, 1,4-ditiotreitol [DTT]) a la solución proteica en el tampón de bicarbonato de amonio hasta una concentración final de 100 mM.
   2. Incuba la mezcla a 60 °C durante 30 minutos en un termomezclador o bloque calefactor.
      PRECAUCIÓN: El DTT es un irritante y debe manejarse con guantes dentro de una campana extractora.
      NOTA: Se ha proporcionado información adicional sobre la tripsina utilizada para la digestión en la Tabla de Materiales. Brevemente, se utilizó tripsina tratada con tosil fenilalanil clorometil cetona (TPCK) de grado secuenciado (para eliminar la actividad quimotráptica) para asegurar una alta especificidad de la clivagancia en los residuos de lisina y arginina. La actividad enzimática se verificó según las especificaciones del fabricante, lo que corresponde a una actividad de N-Benzoil-L-Arginina Éster Etilico (BAEE) de aproximadamente 1 unidad por mg de proteína. En cuanto a las concentraciones de DTT y acetamida de yodo (IAA), confirmamos que los 100 mM de DTT y 200 mM de IAA se refieren a soluciones estándar, no a las concentraciones finales utilizadas en la reacción. Las concentraciones finales de trabajo durante la reducción y la alquilación estuvieron dentro del rango estándar (típicamente 5-10 mM de TDT y 10-20 mM de IAA, respectivamente).
2. Alquilación de residuos de cisteína
   1. Deja que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos después de la reducción.
   2. Centrifuga brevemente para recoger el condensado en el fondo del tubo.
   3. Añadir 200 mM de IAA preparado en un tampón de 50 mM de bicarbonato de amonio (ABC) para alquilar los residuos reducidos de cisteína.
   4. Incuba la muestra a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos para evitar la degradación de la IAA.
      NOTA: La iodoacetamida es fotosensible y potencialmente tóxica; Evita la exposición y la maniobra en luz tenue.
3. Digestión enzimática
   1. Preparar tripsina modificada de grado secuenciado en buffer ABC de 50 mM inmediatamente antes de su uso.
   2. Añade tripsina a cada muestra en una proporción tripsina-proteína de 1:25 (c/w).
   3. Incubar la reacción a 37 °C durante 17 horas para permitir una digestión enzimática completa.
      NOTA: Los tiempos de digestión prolongados pueden provocar una sobredigestión; Asegura la estabilidad de la temperatura durante toda la incubación.
4. Apagar la reacción
   1. Detener la reacción enzimática añadiendo ácido fórmico a cada muestra para lograr una concentración final del 1,0% (v/v).
   2. Incubar a 37 °C durante 20 minutos para desnaturalizar la tripsina residual y estabilizar la mezcla de péptidos.
      PRECAUCIÓN: El ácido fórmico es corrosivo; Utiliza el equipo de protección individual (EPI) adecuado y trabaja en una campana extractora química.
5. Recuperación de péptidos
   1. Centrifuga la mezcla de péptidos digeridos a 3500 g durante 12 minutos a temperatura ambiente para eliminar material insoluble.
   2. Transfiera cuidadosamente el supernadante transparente que contiene los péptidos digeridos a viales de automuestreo sin alterar el pellet.
   3. Almacenar las soluciones peptídicas a -20 °C hasta un análisis LC-MS/MS adicional.
6. Preparación para el análisis LC-MS
   1. Carga las muestras de péptidos directamente en el sistema LC-MS equipado con movilidad iónica para la separación y análisis de péptidos.
   2. Asegúrese de que todos los viales estén correctamente sellados para evitar la evaporación y la contaminación.

8. Análisis MS-MS de LC

1. Carga de péptidos y desalación
   1. Carga 1 μg de la muestra de péptido en un lazo de muestra en modo de inyección de lazo parcial.
   2. Desalar péptidos usando una columna trampa de C18 lavándolo con disolvente acuoso que contenga 0,1% de ácido fórmico a un caudal de 15 μL/min durante 1 minuto.
      NOTA: Utiliza agua con 0,1% de ácido fórmico como disolvente A y acetonitrilo con 0,1% de ácido fórmico como disolvente B durante toda la producción.
2. Separación de péptidos
   1. Conecta la columna de trampa en línea con una columna C18 analítica de fase inversa.
   2. Péptidos elutados usando un gradiente lineal del 3% al 40% de disolvente B durante 55 min a un caudal de 300 nL/min.
   3. Enjuaga la columna con disolvente B al 80% durante 7,5 minutos para eliminar los componentes que se reten.
   4. Reequilibra la columna con un 3% de disolvente B antes de la siguiente inyección.
   5. Mantén el horno de columna a 35 °C y el automuestreador a 4 °C durante la funcionalidad.
      NOTA: Incluye inyecciones en blanco entre muestras para minimizar la transferencia.
3. Ajustes de adquisición por espectrometría de masas
   1. Análisis espectral de masas de péptidos eluentes
      1. Configura el sistema UPLC y acoplarlo directamente al MS de alta definición.
      2. Controla el sistema usando software de Microsoft.
      3. Asegúrese de que el espectrómetro de masas esté configurado como un instrumento híbrido de cuadrupolas de iones, movilidad ortogonal de aceleración y tiempo de vuelo (OA-TOF).
      4. Verifica que todas las conexiones de nitrógeno y gas de bloqueo estén seguras y libres de fugas antes de iniciar la operación.
         PRECAUCIÓN: Manipular conexiones de alta tensión y gases presurizados cumpliendo con las normas de seguridad del laboratorio.
   2. Configuración de ionización
      1. Operar el espectrómetro de masas en modo de ionización positiva por electropulverización (ESI) utilizando una fuente de iones electrospray dual.
      2. Ajusta el voltaje capilar nano-ESI a 3,4 kV.
      3. Ajusta el voltaje del cono de muestra a 40 V y el voltaje del cono de extracción a 4 V.
      4. Ajusta el flujo de gas nitrógeno por espectrometría de movilidad iónica (IMS) a 90 mL/min.
      5. Inspecciona la estabilidad del spray y asegúrate de que la corriente de iones sea constante antes de continuar.
   3. Separación de movilidad iónica
      1. Ajusta la altura del pulso guía iónica IMS a 40 V durante la transmisión iónica.
      2. Ajusta la velocidad de la guía iónica IMS a 800 m/s.
      3. Incrementa la altura de la onda viajera linealmente de 8 V a 20 V durante todo el ciclo IMS para lograr una separación óptima de iones por movilidad.
         PRECAUCIÓN: Asegurar un flujo estable de gas IMS; Las fluctuaciones pueden afectar la separación de iones y la reproducibilidad del tiempo de deriva.
   4. Calibración de masa por bloqueo
      1. Calibrar el analizador de tiempo de vuelo (TOF) usando una solución de yoduro de sodio (NaI) de 2 μg/μL.
      2. Ajusta el rango de calibración para detectar iones entre 50 m/z y 2000 m/z.
      3. Adquiere espectros de referencia de masa de bloqueo cada 45 s utilizando el canal de fuente de iones electrospray dual para la corrección de masa en tiempo real.
      4. Verifica que la curva de calibración alcance una precisión de masa dentro de ±5 ppm antes de proceder a la adquisición de datos.
4. Adquisición de datos
   1. Adquiere datos en modo continuo, alternando entre dos funciones:
      1. Función 1 (EM de baja energía): Registrar espectros iónicos precursores de baja energía.
      2. Función 2 (HDMSE de alta energía): Registrar espectros iónicos fragmentados a energía de colisión elevada con separación de movilidad iónica.
   2. En la Función 2, ajusta la energía de colisión en la región de trampa a 4 eV.
   3. Aumenta la energía de colisión en la región de transferencia de 20 eV a 45 eV para lograr una fragmentación controlada de los péptidos.
   4. Establece el tiempo de adquisición espectral por función a 0,9 s y el retardo entre escaneos a 0,024 s.
   5. Monitoriza el cromatograma iónico total (TIC) para confirmar la respuesta consistente del instrumento durante toda la prueba.
   6. Importar datos en bruto en software de análisis proteómico (por ejemplo, Progenesis QI o equivalente).
   7. Alinea los cromatogramas entre secuencias usando la referencia de alineación predeterminada o una ejecución de referencia seleccionada manualmente.
   8. Identificar péptidos y proteínas utilizando una base de datos seleccionada (por ejemplo, UniProt Human - solo entradas revisadas).
   9. Establece los siguientes parámetros de búsqueda:
      Enzima: Tripsina
      Modificación fija: Carbamidilación (C)
      Modificación variable: oxidación (M)
      Tolerancia a péptidos: según la resolución del instrumento
      Se permiten escotes perdidos: 1
      Tasa de Descubrimiento de Falsos Datos (FDR): ≤ 1%
   10. Realizar la normalización usando el método de normalizar a todas las proteínas .
   11. Aplicar umbrales de filtrado: ≥2 péptidos por proteína, ≥1 péptido único, cambio de plegamiento ≥1,5 y valor p ajustado <0,05.
       NOTA: Esta es una guía general de seguridad en laboratorio: siempre sigue las normativas EHS (Salud y Seguridad Ambiental) de la institución y los requisitos legales locales.
5. Control de calidad
   1. Realizar comprobaciones de calibración antes y después de la ejecución utilizando el estándar NaI para confirmar la precisión de masa.
   2. Asegúrate de que la referencia de masa del bloqueo permanezca estable durante todo el análisis.
   3. Evalúa las inyecciones replicadas para confirmar la reproducibilidad en el tiempo de retención, el tiempo de deriva y la intensidad espectral.
      PRECAUCIÓN: El yoduro de sodio es un irritante. Mientras manipulas, usa guantes y evita inhalar o contactar con la piel.
      NOTA: Consulte el Archivo Suplementario 1 para orientación sobre la eliminación de residuos. Trabaja siempre en un ambiente frío o sobre hielo al manipular muestras de plasma para evitar la degradación de proteínas. Lleva guantes Nitryl, bata de laboratorio y protección ocular al manipular muestras biológicas y amortiguadores. Realizar los pasos de centrifugación utilizando una centrífuga refrigerada preenfriada a 4 °C. Asegúrese de que todos los tubos de centrifugadora y jeringuillas utilizados sean estériles y estén correctamente etiquetados para evitar contaminaciones cruzadas. Siempre usa agua de grado proteómico para preparar los tampones.

Resultados

Las muestras de plasma se procesaron utilizando un cartucho de spin para eliminar selectivamente 14 proteínas de alta abundancia, a saber: albúmina, IgG, IgA, transferrina, haptoglobina, antitripsina, fibrinógeno, alfa2-macroglobulina, glicoproteína alfa1-ácida, IgM, apolipoproteína AI, apolipoproteína AI, complemento C3 y transtiretina. Este paso de agotamiento fue fundamental para mejorar la detección de biomarcadores de baja abundancia en el análisis proteómico posterior. Cada muestra...

Discusión

La complejidad intrínseca del plasma como matriz biológica presenta un gran desafío para el análisis proteómico. El enorme rango dinámico de concentraciones de proteínas, junto con la predominancia de algunas especies de alta abundancia, puede enmascarar la detección de proteínas clínicamente relevantes y de menor abundancia. Para este estudio actual, mitigamos estas desventajas utilizando una tubería estandarizada de varios pasos para la preparación de muestras, diseñada para enriquecer...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Concentrador de espín de corte de peso molecular de 5 kDa	Agilent Technologies	5185 y menos; 5991	Se utiliza para el intercambio de tampones y la eliminación de sales; retiene proteínas por encima de 5 kDa
Bicarbonato de amonio (ABC)	Sigma Aldrich	Número de cat: T6567	Utilizado para la digestión tríptica
Buffer A Equil/Load/Wash	Agilent Technologies	5185-5987
Elución del Buffer B	Agilent Technologies	5185-5988
Centrífuga fría	Centrifugadora refrigerada CPR-30 Plus	N/A	Utilizado para centrifugar muestras de proteínas a baja temperatura
DTT	Sigma Aldrich	CASNo: 3483-12-3	Utilizado para la digestión tríptica
Aparato electroforético	BIO RAD	1658004	Utilizado para SDS PAGE
IAA	Sigma Aldrich	Número de CAS: 144-48-9	Utilizado para la digestión tríptica
IMS T-Wave & nbsp;	Aguas	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/library/white-papers/2012/water-whitepapers-Triwav eMásCompletaCaracterización de Mi xturesandMolecules-720004176.pdf	Separación de movilidad iónica (IMS)
Lector multimodo Infinite M Plex	TECAN		Lector múltiple
Sistema LC-MS	Aguas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/liquid-chromatography-ms-systems.html
Software MassLynx 4.1 SCN781	Aguas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/informatics-and-software/mass-spectrometry-software/masslynx-mass-spectrometry-software.html	Software de espectrometría de masas
Cartucho de Spin Multiple Removal Affinity Human 14 (MARS Hu-14)	Agilent Technologies	5188 y menos; 6560	Se utiliza para agotar 14 proteínas plasmáticas de alta abundancia, incluyendo albúmina, IgG, IgA, transferrina, etc.
Sistema nanoACQUITY UPLC	Aguas	https://www.waters.com/nextgen/en/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-m-class-system.html
NanoLockSpray	Aguas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/services/instrument-services/instrument-upgrades/mass-spectrometry-ms-upgrades/nanolockspray-exact-mass-ionization-source-upgrade.html
Operón FDU-7003	Operón	http://www.operon.co.kr/en/pro2-FDU.html	Liofilizador de vacío de velocidad
Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce	Termo Científica	23225	Utilizado para cuantificar la concentración de proteínas mediante ensayo colorimétrico
Progenesis QI para Proteómica	Aguas	V4.2
Centrífuga de laboratorio R-8C BL, rotor de ángulo fijo con 12 y más tiempos; 15 mL	REMI		Centrifugadora
SYNAPT G2 MS de alta definición	Sistema HDMSE, Waters Corporation	https://www.waters.com/content/dam/waters/en/app-notes/2009/720003057/720003057-en.pdf	Espectrómetro de masas de aceleración ortogonal (oa-Tof) híbrido IMS
Vial de recuperación total	Aguas	https://www.waters.com/nextgen/us/en/shop/vials-containers--collection-plates/186004631-clear-glass-12-x-32-mm-screw-neck-total-recovery-vial-preassembl.html
Tripsina	Sigma Aldrich	Número de cat: T6567	Utilizado para la digestión tríptica