ML385 atenúa la progresión maligna de las células de adenocarcinoma de pulmón inducidas por sílice a través de la vía del eje de autofagia ROS/NRF2

El adenocarcinoma de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, con un estimado de 2 millones de casos nuevos y 1,76 millones de muertes cada año¹. En los últimos años, la incidencia de adenocarcinoma de pulmón entre personas que nunca han fumado ha aumentado, lo que puede estar relacionado con factores ambientales como la contaminación del aire². La sílice es un contaminante ambiental común y se ha identificado como un factor patogénico potencial para el adenocarcinoma de pulmón humano³. La sílice puede causar inflamación crónica persistente, lo que lleva a la infiltración de macrófagos, linfocitos y neutrófilos, y la liberación de especies reactivas de oxígeno y factores inflamatorios⁴. Este microambiente inflamatorio a largo plazo promueve la aparición de adenocarcinoma de pulmón ^5,6. Aunque se ha confirmado la asociación entre la exposición a sílice y el adenocarcinoma de pulmón, su mecanismo molecular específico no se ha dilucidado completamente.

El factor de transcripción NRF2, codificado por el gen NFE2L2, juega un papel crucial como regulador maestro en el mantenimiento de la homeostasis redox celular en respuesta al estrés oxidativo ^7,8. En circunstancias normales, NRF2 está marcado y degradado por el complejo ubiquitina ligasa KEAP1-CUL3. Bajo la estimulación del estrés oxidativo o sustancias electrofílicas, la actividad de KEAP1 se inhibe, lo que permite que NRF2 se acumule de manera estable y entre en el núcleo, ejerciendo así el papel de defensa y regulador del núcleo⁹. Sin embargo, la activación excesiva de NRF2 en el microambiente tumoral puede mejorar la glucólisis y la supervivencia de las células tumorales al detener la acumulación de ROS y aumentar la resistencia apoptótica^10,11. Los estudios han demostrado que la exposición a la sílice puede provocar una activación anormal de la vía de señalización NRF2 ^12,13. Por lo tanto, dirigirse a NRF2 puede ser una estrategia eficaz para intervenir en la progresión maligna del adenocarcinoma de pulmón inducido por sílice¹⁴.

Este estudio tiene como objetivo aclarar si el inhibidor de NRF2 ML385 inhibe la progresión maligna inducida por sílice del adenocarcinoma de pulmón mediante la regulación de la vía del eje ROS/NRF2-autofagia. Establecimos un modelo de ratón inducido por sílice para reproducir las características clave de la enfermedad y utilizamos métodos experimentales in vitro para estudiar la interacción entre macrófagos y células tumorales. Encontramos que la sílice indujo la expresión de moléculas inflamatorias e inmunes y promovió aún más la formación de tumores a través de la vía del eje de autofagia ROS / NRF2. Cuando se usó el inhibidor de NRF2 (ML385), el efecto promotor de la sílice en la formación de tumores se desaceleró, lo que indica que el inhibidor de NRF2 puede desempeñar una función en el tratamiento de los tumores de pulmón inducidos por sílice.

Todos los bloques de donantes se obtuvieron de muestras patológicas de archivo recolectadas entre 2016 y 2018 en el Hospital Popular Afiliado Huai'an NO.1 de la Universidad Médica de Nanjing. Las muestras fueron desidentificadas antes de su uso y procesadas de acuerdo con los protocolos aprobados. El comité de ética del Hospital Popular Afiliado Huai'an No.1 de la Universidad Médica de Nanjing, KY-2024-250-01. La cría, eliminación y aplicación de ratones experimentales sigue estrictamente las Regulaciones sobre la Administración de Animales de Laboratorio y las pautas internacionales.

Construcción de un modelo de ratón inducido por sílice
Preparación de ratones y suspensión de sílice: Criar ratones machos C57BL/6, de 6-8 semanas de edad, en una sala de animales con una temperatura ambiente de 20-25 °C y un ciclo de 12 h de luz / 12 h de oscuridad. Para preparar la suspensión de polvo de silicio, se pesaron con precisión 300 mg de polvo de polvo de silicio y se suspendieron en 10 ml de solución salina estéril 1x tamponada con fosfato. Posteriormente, la mezcla se agitó vigorosamente en vórtice y osciló durante 5 min, y luego se trató por ultrasonidos en una máquina ultrasónica de baño de agua durante 30 min para garantizar una dispersión uniforme de las partículas y evitar la agregación. La concentración final de esta suspensión de reserva es de 30 mg/mL. Esterilice en autoclave a 121 °C durante 30 min. Antes de cada uso, es necesario agitar y agitar nuevamente durante 2-3 minutos para volver a suspender las partículas sedimentadas.

Los ratones inhalaron suspensión de sílice por la nariz. La micropipeta se utilizó para introducir lentamente y gota a gota la solución en la cavidad nasal de los ratones. Los ratones se dividieron en 6 grupos con 20 ratones en cada grupo. El volumen de inhalación de cada grupo fue de 10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL y 200 μL, con una concentración de 30 mg/mL, una vez al día durante 40 días consecutivos. Al perfundir, agarre la piel detrás de la oreja del ratón con el pulgar y el índice de la mano izquierda, y fije el cuerpo y la cola del ratón con los otros dedos. Asegúrese de que el ratón esté en posición supina con la cabeza ligeramente inclinada hacia atrás para permitir que la suspensión se inhale naturalmente en las vías respiratorias. Encontramos que no hubo un evento de muerte después del segundo día de inhalación de 10 μL, 30 μL, 50 μL y 70 μL de suspensión de sílice en ratones, mientras que hubo un evento de muerte después del segundo día de inhalación de 90 μL y 200 μL de suspensión de sílice en ratones. Por lo tanto, el volumen máximo de inhalación de sílice en ratones fue de 70 μL por día.

Cuando se manipula sílice cristalina, debe realizarse en un gabinete de bioseguridad o campana extractora, y se deben usar máscaras N95, gafas a prueba de polvo, guantes de nitrilo y ropa protectora durante todo el proceso. Al preparar la suspensión, los movimientos deben ser suaves y se debe utilizar una cámara de pesaje para evitar la generación de aerosoles. Todos los residuos en contacto con la sílice deben recogerse en recipientes sellados con resistencia a la perforación y eliminarse de acuerdo con la normativa sobre residuos químicos peligrosos. Está estrictamente prohibido mezclarlo con basura general o verterlo en la alcantarilla. Los desechos biológicos, como el medio de cultivo celular, deben recolectarse en botes de basura especiales que contengan desinfectantes y esterilizarse a alta presión. Los cadáveres y tejidos de animales deben colocarse en bolsas de desechos biológicos y esterilizarse a alta presión para un tratamiento inofensivo.

Evaluar el éxito del modelo de ratón inducido por sílice. Evalúe a los animales en diferentes momentos después de la inhalación de sílice, es decir, en los días 3, 14 y 40. Los ratones se colocaron en dispositivos profesionales de eutanasia animal y se introdujo dióxido de carbono a una tasa de llenado del 30% al 50% de volumen / min. Estuvieron continuamente expuestos hasta que dejaron de respirar. Después de confirmar la muerte, se llevaron a cabo operaciones posteriores. Se extirpó el tejido pulmonar. El tejido pulmonar se fijó en solución de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 48 h. Después de la fijación, el tejido se deshidrató con alcohol de gradiente, se hizo transparente con xileno y luego se incrustó en parafina. Los cortes continuos se realizaron utilizando una máquina de corte de parafina con un espesor de 4-5 μm para su posterior tinción histológica y análisis inmunohistoquímico. El tejido pulmonar no requiere tratamiento de descalcificación. Se realizó un examen patológico del tejido pulmonar para evaluar la generación exitosa del modelo. Los criterios de éxito de la construcción del modelo de silicosis fueron los siguientes: inflamación pulmonar significativa, fibrosis y aparición de nódulos de silicosis.

Análisis de la infiltración de células inmunitarias en el modelo de ratón inducido por sílice
Los tejidos pulmonares de los ratones en el día 14 después de la inhalación de sílice se tiñeron con marcadores fluorescentes que contenían CD3e (relación de dilución 1:200), CD8a (relación de dilución 1:200), CD86 (relación de dilución 1:200), F4/80 (relación de dilución 1:200) y Nk1.1 (relación de dilución 1:200) para visualizar las células inmunitarias. Fijar secciones celulares o de tejido y bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 1 h para reducir la unión inespecífica. Utilice suero normal del mismo origen de especie que el anticuerpo bloqueador, diluya suero con PBS en una proporción de 1:10 y agregue 100 μL de suero diluido a la muestra. Luego, bloquee a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que el suero bloquee los anticuerpos endógenos. Después de sellar, enjuague suavemente 2 veces con PBS. Los anticuerpos primarios que contenían CD3e (relación de dilución 1:200), CD8a (relación de dilución 1:200), CD86 (relación de dilución 1:200), F4/80 (relación de dilución 1:200) y Nk1.1 (relación de dilución 1:200) se incubaron durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 1-2 h. Después del lavado con PBS, se agregó el anticuerpo secundario fluorescente y se incubó en la oscuridad durante 1 h.

Tinción de Masson y análisis inmunohistoquímico
Las secciones de parafina se desparafinaron con xileno y se hidrataron con alcohol de gradiente, y luego se realizó la recuperación de antígenos en tampón de citrato de sodio con pH 6.0 mediante remediación térmica a alta presión. Para la remediación térmica a alta presión, coloque las rodajas de tejido empapadas en tampón de reparación en un horno microondas a fuego medio durante 8-12 min. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 min, y luego el sitio de unión no específico se bloqueó con BSA al 5% a temperatura ambiente durante 30 min. Agregue los anticuerpos primarios NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) y VDAC1 (1:500) e incube durante la noche a 4 °C. Después de lavar 3 veces con PBS, agregue el anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con HRP (1: 500) e incube a temperatura ambiente durante 1 h. Las secciones de parafina se sometieron a tinción DAB, contratinción de hematoxilina, transparencia de deshidratación y sellado de gel neutro para obtener los resultados de inmunohistoquímica molecular correspondientes. Cuando se usa DAB para el desarrollo del color, el desarrollo moderado del color debe ser de amarillo parduzco a marrón parduzco, y el fondo debe ser claro. Tanto el desarrollo excesivo (marrón oscuro) como el insuficiente (amarillo claro) requieren la optimización del tiempo de desarrollo del color.

El grado de fibrosis pulmonar se analizó semicuantitativamente utilizando el método de puntuación de Ashcroft¹⁵: se observaron secciones teñidas con Masson bajo un microscopio de aumento de 100x y el tejido pulmonar se dividió aleatoriamente en 8 regiones. Cada región se puntuó según el grado de fibrosis (0-8 puntos), siendo la puntuación final la media de todas las regiones: 0 puntos (tejido pulmonar normal), 1-2 puntos (fibrosis leve), 3-4 puntos (fibrosis moderada), 5-8 puntos (fibrosis grave).

Los resultados inmunohistoquímicos se analizaron cuantitativamente mediante el software Image. Se seleccionaron aleatoriamente cinco campos de gran aumento y se midió el valor promedio de densidad óptica (MOD) de cada campo como indicador del nivel de expresión de proteínas.

Examen del impacto de la sílice y ML385 en la autofagia y las ROS en células RAW264.7
Tanto las células RAW264.7 como las A549 (proporcionadas por la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui) se cultivaron utilizando medio de alto contenido de glucosa DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y solución de anticuerpos biespecíficos penicilina-estreptomicina al 1%. Las células 1 x 10⁷ se cultivaron uniformemente en una incubadora a temperatura constante a 37 °C y 5% de CO₂. Se agregaron 5 μL de suspensión de sílice de 30 mg/mL a 1 x 10⁵ celdas/mL de celdas RAW264.7. Después de la incubación durante 24 h, las células se enjuagaron con PBS 3x y la autofagia y el estrés oxidativo se detectaron mediante sondas ROS, LC3 y lisosomas. Al mismo tiempo, se utilizó ML385¹⁶, un inhibidor de NRF2, para inhibir la expresión de NRF2 (concentración final de ML385: 5 mM/L). La autofagia y el estrés oxidativo se detectaron de acuerdo con los pasos experimentales anteriores. Se analizaron estadísticamente el estrés oxidativo y el flujo de autofagia de los dos grupos.

Análisis inmunohistoquímico de las expresiones de VDAC1, CDK1, p62 y NRF2 en tejido de adenocarcinoma de pulmón
Se verificaron las expresiones de VDAC1, CDK1, p62 y NRF2 en 30 pacientes. Los tejidos con adenocarcinoma de pulmón y tejidos sanos adyacentes se obtuvieron del Hospital Popular Afiliado Huai'an NO.1 de la Universidad Médica de Nanjing y se analizaron mediante inmunohistoquímica (IHC). Se analizaron estadísticamente los resultados de IHQ y fibrosis pulmonar. Recopile datos del paciente de acuerdo con la información del paciente en el sistema hospitalario. Los pasos experimentales específicos son los siguientes: las secciones de parafina se desparafinaron con xileno y se hidrataron con alcohol de gradiente, y luego se llevó a cabo la remediación de antígenos en tampón de citrato de sodio con pH 6.0 mediante remediación térmica a alta presión. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 min, y luego el sitio de unión no específico se bloqueó con BSA al 5% a temperatura ambiente durante 30 min. Agregue los anticuerpos primarios NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) y VDAC1 (1:500) e incube durante la noche a 4 °C. Después de lavar 3 veces con PBS, agregue un anticuerpo secundario anti-conejo de cabra marcado con HRP (1:500) e incube a temperatura ambiente durante 1 h. Desarrollo de color DAB, contratinción de hematoxilina, transparente deshidratado, sellado neutro de las encías. Cuando se usa DAB para el desarrollo del color, el desarrollo moderado del color debe ser de amarillo parduzco a marrón parduzco, y el fondo debe ser claro. Tanto el desarrollo excesivo (marrón oscuro) como el insuficiente (amarillo claro) requieren la optimización del tiempo de desarrollo del color.

Análisis de migración e invasión celular
Se estudió el efecto del ML385 y el sobrenadante de la coincubación de sílice con células RAW264.7 sobre la migración e invasión celular después de ser incubadas con la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549. El sobrenadante de las células RAW264.7 cocultivadas con sílice durante 24 h se agregó a las células A549. Las células se dividieron en el grupo de sílice, el grupo de sílice + ML385 y el grupo de PBS. El grupo de sílice: se agregaron 5 μL de suspensión de sílice de 30 mg/mL a 1 x 10⁵ celdas/mL de celdas RAW264.7. Después de la incubación durante 24 h, retire el sobrenadante celular para su uso posterior. El grupo sílice + ML385: se agregaron 5 μL de suspensión de sílice de 30 mg / ml y una concentración final de 5 mM / L ML385 a 1 x 10^{5 celdas} / ml de células RAW264.7. Después de la incubación durante 24 h, retire el sobrenadante celular para su uso posterior. Grupo PBS: se agregaron 5 μL de PBS a 1 x 10⁵ células/mL de células RAW264.7. Después de la incubación durante 24 h, retire el sobrenadante celular para su uso posterior. Durante el ensayo de raspado, las células A549 se sembraron primero en placas de 12 pocillos a una densidad de 5 x 10⁵ por pocillo. Después de que las células crecieron hasta el 95%-100% de fusión, se hicieron rasguños en las células monocapa con la punta de una pipeta estéril de 200 μL. Las células exfoliadas se lavaron suavemente con PBS. Posteriormente, las condiciones de cultivo se cambiaron para incluir el medio básico FBS al 1% y los sobrenadantes de cada grupo de tratamiento para mantener la viabilidad celular durante el período experimental de 7 días. Las imágenes de la misma posición se recogieron bajo un microscopio invertido a las 0 h (día 0) y al 7º día (día 7) después del rasguño, respectivamente. Finalmente, se analizó cuantitativamente el área de rascado y se calculó la tasa de cierre de rayado utilizando el software ImageJ para evaluar el efecto del sobrenadante de diferentes grupos de tratamiento sobre la capacidad de migración de las células A549.

En el ensayo de invasión de poros de tamaño específico que pasan a través de poros, se utilizó una cámara de membrana de policarbonato de 8 μm, con la membrana de la cámara superior prerecubierta con gel que simula el entorno extracelular diluido en una proporción de 1:8 para construir una barrera de membrana basal. Las células A549 se resuspendieron en una suspensión hecha mezclando medio libre de suero con los sobrenadantes de cada grupo de tratamiento en una proporción de 1:1 y luego se inocularon en la cámara superior (2 x 10⁴ células por cámara). En la cámara inferior, se agregó una solución hecha mezclando un medio que contenía un 20% de FBS con los sobrenadantes de los grupos de tratamiento correspondientes (grupo Sílice + ML385, grupo Sílice y grupo PBS) en la misma proporción como atrayente químico. Los sobrenadantes de los grupos de tratamiento correspondientes se recogieron por succión a través de una pistola de pipetas en RAW264.7 Fagocitosis celular de sílice. Después de que las células se incubaron continuamente a 37 °C y 5% de CO₂ durante 7 días, las células no invasivas en la cámara superior se retiraron con hisopos de algodón, y las células que habían penetrado la membrana y llegado a la cámara inferior se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con violeta cristal al 0,1%. Finalmente, el número de células invasoras se seleccionó aleatoriamente de 5 campos de visión mediante un microscopio óptico.

Análisis del impacto de la sílice y ML385 en la apoptosis de las células A549 mediante citometría de flujo
Preparación y agrupación celular: Se recogieron células A549 tratadas con los sobrenadantes de cada grupo de tratamiento (grupo PBS, grupo sílice, grupo sílice + grupo ML385). Las células se lavaron suavemente 2 veces con PBS preenfriado, luego se resuspendieron en tampón de unión 1x y la densidad celular se ajustó a 1 x 10⁶ células por tubo/100 μL. Luego, se agregaron 5 μL de anexina V-FITC y 5 μL de solución de tinción PI a la suspensión celular, se agitaron suavemente en vórtices para mezclar y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Después de la incubación, se añadieron 400 μl de tampón de unión 1x a cada tubo y se probaron inmediatamente en la máquina. La detección se realizó mediante un citómetro de flujo. Excitada por un láser de 488 nm, la señal de fluorescencia de la anexina V-FITC se recogió a través del canal FITC, y la señal de fluorescencia de PI se recogió a través del canal PE. Antes del experimento, se utilizaron muestras de tinción única para el ajuste de compensación de fluorescencia para eliminar la superposición espectral. Al realizar el análisis de datos, primero delinee la población de células objetivo en el diagrama de dispersión FSC-A/SSC-A y elimine los fragmentos. Posteriormente, se excluyeron las adhesiones celulares utilizando el diagrama de dispersión FSC-H/FSC-A; Finalmente, se estableció una puerta para distinguir entre células vivas, células apoptóticas tempranas, células apoptóticas / necróticas tardías y células dañadas mecánicamente. Los datos se obtuvieron y analizaron utilizando el software FlowJo V10.

Modelo de ratón de sílice
En la Figura 1, a los ratones se les administró sílice por vía intranasal a una dosis de 30 mg / ml y 70 μl durante 40 días consecutivos, lo que aseguró que no ocurrieran eventos de muerte en los ratones y que el modelo de ratón de sílice pudiera establecerse con éxito. Mientras tanto, se utilizaron sonda de ratones con PBS como controles negativos. El objetivo era eliminar la influencia de la operación y del propio disolvente y garantizar que el fenotipo fuera inducido específicamente por sílice. La replicación exitosa de este modelo de lesión pulmonar inducida por sílice proporciona una base in vivo necesaria para la investigación posterior sobre el mecanismo de progresión maligna y la intervención farmacológica.

Análisis de la infiltración de células inmunitarias en los nódulos de ratones inducidos por sílice
En la Figura 2, al detectar la infiltración de células inmunitarias en los nódulos de ratones de sílice, se encontró que había una gran cantidad de infiltración de células inmunitarias (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ y Nk1.1+) en los nódulos, que estaban implicadas en la formación y desarrollo de la enfermedad pulmonar por sílice. Esto indica que la sílice induce un microambiente tumoral inflamatorio persistente, que es un factor promotor clave para la aparición y el desarrollo del tumor, y también la base fisiopatológica para la participación de la vía ROS/NRF2.

Relación entre la fibrosis pulmonar inducida por sílice y NRF2, CDK1 y VDAC1 en ratones
Al detectar la expresión de moléculas inmunes en los nódulos, se encontró que NRF2 (diana inhibidora ML385), CDK1 (relacionada con el ciclo celular) y VDAC1 (implicada en el estrés oxidativo mitocondrial) se expresaban en gran medida alrededor y dentro de los nódulos y estaban relacionados con la fibrosis pulmonar (Figura 3).

Impacto de la sílice y ML385 en la autofagia y las ROS en células RAW264.7
A través del cocultivo de células de sílice y RAW264.7, se encontró que la sílice podría inducir la producción de autofagosomas. Después de 24 h de cultivo, se redujo la colocalización de autofagosomas y lisosomas, se inhibió el flujo de autofagia y también se redujo la producción de ROS. Cuando se agregó ML385 (inhibidor de NRF2 ), se mejoró la colocalización de autofagosoma y lisosoma, también se mejoró el flujo de autofagia y también se aumentó el ROS en consecuencia (Figura 4).

Análisis de las expresiones de VDAC1, CDK1, p62 y NRF2 en tejido de adenocarcinoma de pulmón por IHC
Como se muestra en la Figura 5, NRF2 (una diana inhibidora de ML385), CDK1 (relacionada con el ciclo celular), VDAC1 (implicada en el estrés oxidativo mitocondrial) y p62 (implicada en la autofagia) están altamente expresadas en los tejidos del adenocarcinoma de pulmón y presentan diferencias significativas en comparación con los tejidos adyacentes.

Efecto del ML385 y el sobrenadante de la coincubación de sílice con células RAW264.7 en la migración e invasión de células A549
La sílice y el sobrenadante de cultivo celular RAW264.7 pueden promover la migración y proliferación de células A549, mientras que ML385 puede inhibir significativamente estos procesos (como se muestra en la Figura 6). Este resultado indica que el efecto promotor tumoral del microambiente de macrófagos inducido por la sílice depende de la vía NRF2 . La inhibición de NRF2 puede bloquear eficazmente este efecto promotor de tumores, reduciendo así la progresión maligna de las células tumorales.

Impacto de la sílice y ML385 en la apoptosis de las células A549
La Figura 7 muestra que la sílice y el sobrenadante de cultivo celular RAW264.7 tienen un cierto efecto inhibidor sobre la apoptosis de las células A549, y ML385 puede promover la apoptosis de las células A549.

Este estudio reveló la vía mecanicista por la cual la exposición a la sílice promueve la progresión maligna del adenocarcinoma de pulmón a través del eje ROS/NRF2/autofagia utilizando métodos in vivo e in vitro . Los experimentos con animales han confirmado que las moléculas clave de la vía de señalización NRF2 se activan significativamente en el microambiente de la fibrosis pulmonar inducida por sílice. Los experimentos celulares han demostrado que la sílice inhibe directamente el flujo autofágico en los macrófagos y reduce los niveles de ROS, y este efecto puede revertirse específicamente con el inhibidor de NRF2 ML385. Los estudios de mecanismos han demostrado que los macrófagos tratados con sílice promueven la migración, invasión e inhibición de la apoptosis de las células de adenocarcinoma de pulmón mediante factores secretores, y este efecto promotor de tumores depende completamente de la activación de la vía NRF2.

Disponibilidad de datos:
Los conjuntos de datos que respaldan la conclusión de este artículo se incluyen en el artículo.

Figura 1: Construcción de un modelo de sílice en ratones. (A) Tratar ratones con inhalación nasal de sílice (30 mg / ml) a diferentes volúmenes (10 μL, 30 μL, 50 μL, 70 μL, 90 μL y 200 μL). 20 ratones por dosis inhalada. (B) Curva de supervivencia del ratón. La cantidad máxima de inhalación es de 70 μL/día. (C) Resultados de la observación de la tinción histopatológica pulmonar de HE en ratones del grupo de sílice y del grupo PBS el día 3, el día 14 y el día 40. (D) Resultados estadísticos del número de nódulos pulmonares observados en ratones con bajo aumento, prueba t, ***p <0,001, p = 0,004, t = 10,61 (día 14), p = 0,0006, t = 10,02 (día 40). N = 9. Las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Observación de la infiltración de células inmunitarias en tejido nodular de ratones mediante tinción de fluorescencia. Alta infiltración de células inmunes (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ y NK1.1+) en nódulos de nódulos pulmonares inducidos por sílice en ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de la relación entre las expresiones de NRF2, CDK1, VDAC1 y fibrosis inducida por sílice a través de inmunohistoquímica (IHC) y tinción de Masson. (A) Las expresiones de NRF2, CDK1 y VDAC1, y los resultados de la tinción de Masson. (B) Los resultados de IHC. (C) Se realizó un análisis estadístico de la fibrosis pulmonar entre el grupo de sílice y el grupo de ratones PBS. prueba t, ***p <0,001, p = 0,0002, t = 13,42 (NRF2), p = 0,0008, t = 9,247 (CDK1), p = 0,0009, t = 8,944 (VDAC1), p = 0,0003, t = 11,76 (fibrosis pulmonar). N = 9. Las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de la sílice sobre la autofagia en células RAW264.7 y el efecto regulador de la autofagia del inhibidor de NRF2 ML385. (A) Después de coincubar sílice con células RAW264.7 durante 24 h, la colocalización de autofagosomas (LC3) y lisosomas disminuyó (Green). Sin embargo, con la adición de ML385, la colocalización de autofagosomas y lisosomas aumentó (amarillo). (B) Después de coincubar sílice con células RAW264.7 durante 24 h, las ROS generadas por el grupo sílice disminuyeron, pero aumentaron después de la adición de ML385. (C) Análisis estadístico de las ROS y el flujo de autofagia de los dos grupos, prueba t, ***p <0,001, p = 0,0005, t = 10,59 (ROS), p <0,0001, t = 17,08 (autofagolisosoma). N = 6. Las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis inmunohistoquímico de las expresiones de VDAC1, CDK1, p62 y NRF2 en tejido de adenocarcinoma de pulmón humano. (A) Expresiones diferenciales (VDAC1, CDK1, p62 y NRF2) entre tejido de adenocarcinoma de pulmón humano y tejido no canceroso adyacente. (B) Análisis estadístico de la expresión diferencial entre 30 casos de cáncer y tejidos no cancerosos adyacentes del Hospital Popular Afiliado Huai'an NO.1 de la Universidad Médica de Nanjing, prueba t, ***p <0.001, p <0.0001, t = 8.322 (CDK1), p <0.0001, t = 16.4 (NRF2), p <0.0001, t = 15.47 (p62), p <0.0001, t = 17.75 (VDAC1). N = 30. Las barras de error muestran el error estándar. (C) Análisis estadístico de fibrosis en tejido de adenocarcinoma de pulmón y tejido no canceroso adyacente, prueba t, ***p <0,001, p = 0,0009, t = 8,854 (fibrosis). N = 30. Las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Efecto del ML385 y el sobrenadante de la coincubación de sílice con células RAW264.7 sobre la migración e invasión celular después de ser incubadas con la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549. (A) Los resultados del rayado celular el día 0 y el día 7 después de la coincubación del sobrenadante y ML385 con células A549. (B) Los resultados invasivos de células el día 7 después de la coincubación de sobrenadante y ML385 con células A549. (C) Realizar análisis estadísticos sobre los resultados del ensayo de rayado celular. *p <0,05, **p <0,01. prueba t, p = 0,0020, t = 22,43 (sílice + ML385 versus sílice), p = 0,0135, t = 8,510 (sílice + ML385 frente a PBS), p = 0,0143, t = 8,281 (sílice frente a PBS). N = 6. Las barras de error muestran el error estándar. (D) Realizar análisis estadísticos sobre los resultados del ensayo invasivo de células. *p <0,05, **p <0,01, prueba t, p = 0,0097, t = 10,06 (sílice + ML385 versus sílice), p = 0,0472, t = 4,437 (sílice + ML385 versus PBS), p = 0,0125, t = 8,857 (sílice versus PBS). N = 6. Las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Análisis del impacto de la sílice y ML385 en la apoptosis de las células A549 mediante citometría de flujo. (A) Detectar los resultados de apoptosis de las células A549 mediante citometría de flujo. (B) Realizar análisis estadísticos sobre el porcentaje de células apoptóticas. *p <0,05, **p <0,01, prueba t, p = 0,0013, t = 27,29 (sílice + ML385 versus sílice), p = 0,0022, t = 6,973 (sílice + ML385 versus PBS), p = 0,0048, t = 5,649 (sílice versus PBS). N = 6. Las barras de error muestran el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.