Un protocolo para construir un modelo de ratón de fibrosis miocárdica hipertensiva usando angiotensina II

Summary

La infusión continua de angiotensina II (Ang II) a través de bombas osmóticas es uno de los métodos clásicos para construir modelos animales de fibrosis miocárdica hipertensiva. Este protocolo optimizó sistemáticamente el proceso de construcción de este modelo y elaboró los puntos clave de la implantación de la bomba osmótica, el posicionamiento y el ajuste de la concentración de Ang II.

Abstract

La infusión continua de angiotensina II (Ang II) a través de bombas osmóticas es un enfoque ampliamente utilizado para establecer modelos animales de fibrosis miocárdica hipertensiva. Sin embargo, esta técnica presenta ciertas limitaciones en los informes actuales, como la inestabilidad de Ang II, la colocación inexacta de la bomba y la falta de un procedimiento estandarizado. Los informes actuales sobre la metodología para el establecimiento siguen siendo relativamente limitados. Este protocolo ha optimizado sistemáticamente el establecimiento de modelos de fibrosis miocárdica hipertensiva inducida por bomba osmótica Ang II en ratones, incluida la preparación estandarizada de la solución de Ang II, la calibración de la dosis, la implantación subcutánea precisa de bombas osmóticas y los estándares cuantitativos para los indicadores de evaluación del modelo. Los resultados experimentales demostraron que la bomba osmótica Ang II indujo fibrosis miocárdica hipertensiva en ratones con altas tasas de supervivencia. Los niveles de presión arterial sistólica (PAS) se estabilizaron en 160 mmHg después de siete días de implantación subcutánea. Los ratones modelo habían reducido significativamente las fracciones de eyección del ventrículo izquierdo y aumentado las dimensiones telediastólicas del ventrículo izquierdo. En comparación con el grupo de cirugía simulada, aumentó el depósito de colágeno dentro del tejido intersticial miocárdico hipertensivo y las regiones perivasculares. Este estudio, basado en un tamaño de muestra pequeño (n = 6), validó preliminarmente la viabilidad de establecer un modelo de ratón de fibrosis miocárdica hipertensiva utilizando Ang II combinado con una bomba osmótica, y estableció un sistema cuantitativo de verificación del fenotipo.

Introduction

La fibrosis miocárdica (MF), un resultado patológico importante de la hipertensión, se caracteriza por un depósito excesivo de fibras de colágeno dentro del miocardio dañado o comprimido. Representa una de las formas más importantes de daño a órganos diana mediado por hipertensión y contribuye a la disfunción cardíaca progresiva ^1,2. El establecimiento de modelos animales apropiados es esencial para avanzar en la investigación mecanicista y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para la fibrosis miocárdica hipertensiva. La angiotensina II (Ang II), un efector central del sistema renina-angiotensina, juega un papel fundamental en la patogénesis de la hipertensión³. Por lo tanto, la inducción basada en Ang II se ha convertido en un enfoque ampliamente utilizado para establecer modelos de hipertensión en ratones.

Los métodos actuales para construir modelos animales de hipertensión incluyen principalmente la inducción quirúrgica, la inducción farmacológica y los modelos espontáneos transgénicos. La inducción quirúrgica generalmente utiliza técnicas como la constricción de la arteria renal, la constricción aórtica ascendente o la constricción del arco aórtico para aumentar artificialmente la resistencia al flujo sanguíneo, induciendo así presión arterial elevada⁴. Si bien estos métodos pueden establecer rápidamente estados de hipertensión adecuados para estudiar los procesos de remodelación cardíaca relacionados con la carga de estrés, implican procedimientos complejos con numerosas complicaciones postoperatorias. La inducción farmacológica generalmente utiliza inyección intraperitoneal o administración oral para elevar la presión arterial en animales de experimentación⁵. Si bien la tecnología es relativamente sencilla, la estabilidad del modelo sigue siendo susceptible a la interferencia de la dosis del medicamento, la frecuencia de administración y las respuestas al estrés de los animales. Los modelos transgénicos como las ratas espontáneamente hipertensas y los ratones hipertensos BPH/2J, que exhiben fenotipos de hipertensión estables, se utilizan ampliamente en la investigación de la hipertensión hereditaria. Sin embargo, sus singulares mecanismos patogénicos limitan su capacidad para simular hipertensión clínica inducida por múltiples factores.

Más recientemente, los modelos de hipertensión basados en la infusión continua de Ang II a través de bombas osmóticas subcutáneas han ganado popularidad. Este método permite la liberación sostenida de Ang II a un ritmo constante, manteniendo concentraciones sanguíneas estables durante períodos prolongados para imitar de cerca los procesos patológicos y replicar la fibrosis miocárdica hipertensiva del ratón ^6,7,8. Sin embargo, siguen existiendo limitaciones importantes, particularmente en lo que respecta a la estandarización del protocolo y los resultados fibróticos inconsistentes, que pueden ser influenciados por factores como la técnica de implantación de la bomba y las respuestas específicas de los animales⁹. Para abordar estas brechas, este estudio refina el modelo basado en bombas osmóticas Ang II, estandariza los pasos clave y proporciona un protocolo visualizado. Estas mejoras mejoran la reproducibilidad y la aplicabilidad práctica, ofreciendo una referencia valiosa para futuros estudios sobre fibrosis miocárdica hipertensiva.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las Pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad Médica del Suroeste (número de aprobación SWMU2020317).

1. Preparación de la solución de Ang II y llenado de la bomba osmótica

1. Seleccione 12 ratones machos C57BL / 6J de grado SPF (consulte la tabla de materiales) que pesen 20 ± 1 g seleccionando animales de 8 semanas de edad por su uniformidad de desarrollo para controlar los factores de confusión relacionados con la edad. Divida los ratones en un grupo de cirugía simulada y un grupo modelo utilizando un método de aleatorización simple, con 6 ratones en cada grupo.
2. Mida el peso corporal inicial del ratón y determine la dosis de Ang II (consulte la tabla de materiales) como 1,46 mg / kg / d.
   NOTA: Según el experimento preliminar, 1,46 mg/kg/d es la dosis óptima de Ang II. Esta dosis mantiene de manera confiable la presión arterial sistólica en aproximadamente 160 mmHg, induciendo eficazmente la fibrosis miocárdica patológica al tiempo que garantiza la supervivencia del animal durante el estudio de 4 semanas.
3. Añadir 2,45 ml de solución salina estéril al 0,9%, preenfriada a 4 °C, a 10 mg de polvo liofilizado Ang II. Mezcle bien la solución y manténgala en hielo para su uso inmediato.
4. Realice el procedimiento en hielo usando una jeringa para extraer la solución de Ang II, luego inyecte secuencialmente 200 μL (concentración de 3,91 mmol / L) en cada una de las seis cámaras de la bomba osmótica (consulte la Tabla de materiales).
5. Active el accionamiento de presión osmótica sumergiendo la bomba en solución salina estéril a 37 °C durante 48 h.
   NOTA: Llene las bombas osmóticas para el grupo de cirugía simulada con un volumen igual de solución salina. Como Ang II es fotosensible, el procedimiento debe realizarse bajo una protección completa contra la luz en todo momento.

2. Implantación de las bombas osmóticas y construcción del modelo ⁶

1. Preparación y anestesia de animales
   1. Ayunar a los ratones durante 4 h con acceso libre al agua. A continuación, pesar cada ratón y calcular la dosis anestésica adecuada (80 mg/kg de pentobarbital sódico)¹⁰.
   2. Anestesiar a los ratones mediante inyección intraperitoneal de la dosis calculada de pentobarbital sódico.
      NOTA: El manejo del pentobarbital requiere el cumplimiento de las regulaciones, la operación en una campana extractora, el uso de equipo de protección y el etiquetado del líquido residual para su eliminación por separado.
2. Retire el vello de la piel dorsal sobre la región que se extiende desde la base de la cola hasta el área dorsal media con una navaja de afeitar o crema depilatoria.
3. Desinfecte a fondo el área afeitada tres veces con etanol al 70%¹¹.
4. Con un bisturí, haga una incisión subcutánea de 0,5 cm dentro del área desinfectada.
5. A través de la incisión, use fórceps para separar sin rodeos el tejido subcutáneo hacia la parte posterior del cuello, creando un bolsillo.
6. Oriente el cuerpo de la bomba con la punta del catéter apuntando hacia la cabeza del ratón. Luego, sujete la punta con pinzas hemostáticas e inserte la bomba subcutáneamente en esa dirección.
7. Después de la implantación de la bomba, sutura el tejido subcutáneo con suturas absorbibles 6-0 interrumpidas y cierra la incisión de la piel con suturas quirúrgicas. Luego, coloque el ratón en una esterilla térmica precalentada a 37 ° C hasta que se recupere completamente de la anestesia (aproximadamente 5-10 min).
8. Infundir continuamente la solución de Ang II preparada a la dosis predeterminada (1,46 mg/kg/d) a través de las bombas osmóticas durante 28 días.
9. Al finalizar el período de infusión de 28 días, recopile todos los datos experimentales. Luego, anestesiar a los ratones de la misma manera que se hizo para las anestesias anteriores, es decir, siguiendo los procedimientos descritos en los pasos 2.1.1-2.1.2, y sacrificarlos mediante luxación cervical.

3. Medición de la presión arterial

1. Precalentamiento del equipo (ver tabla de materiales): Ajuste la plataforma de calentamiento a 37-38 °C para asegurar la vasodilatación en los vasos sanguíneos de la cola del ratón.
2. Sujete suavemente el mouse y colóquelo en el soporte de sujeción, asegurándose de que la cola sobresalga libremente a través del orificio trasero. Luego, limpia a fondo la cola expuesta con una bola de algodón empapada en alcohol.
3. Coloque un puño inflable en la base de la cola. Coloque el sensor de pulso aproximadamente a 5-10 mm distal al manguito en la sección de la cola media a inferior.
4. Active el dispositivo y espere a que la forma de onda del pulso se estabilice antes de continuar.
5. Inicie el ciclo de medición. El sistema inflará automáticamente el manguito a una presión superior a 200 mmHg para ocluir el flujo sanguíneo, luego se desinflará lentamente a 2-3 mmHg por segundo. El sensor detecta la reaparición de la onda de pulso a medida que se reanuda el flujo, determinando la presión sistólica.
6. Mida la presión arterial sistólica (PAS) a intervalos de 7 días después del modelado, para un total de cinco mediciones. Para cada ratón en cada punto de tiempo, registre tres lecturas secuenciales, permitiendo un período de descanso de 2 minutos entre mediciones consecutivas.
7. Después de las mediciones, regrese al ratón a su jaula con comida y agua. Limpie el soporte y el manguito de la cola para evitar la contaminación cruzada.

4. Medición de la función cardíaca

1. En el día 28 del modelado, anestesiar a todos los ratones experimentales con pentobarbital sódico (80 mg/kg de pentobarbital sódico).
2. Coloque el mouse en posición supina en una plataforma de temperatura constante.
3. Realice una ecocardiografía transtorácica con un sistema de ultrasonido (ver Tabla de materiales). Conecte las extremidades del ratón a los electrodos de la plataforma para controlar las señales del electrocardiograma (ECG).
4. Obtenga imágenes de eje corto a nivel del músculo mamario mediante ultrasonido en modo M para visualizar el corazón y analizar la función cardíaca. Capture tres imágenes por ratón y promedie los datos para el análisis posterior de la dimensión diastólica interna del ventrículo izquierdo (LVIDd), el diámetro interno sistólico del ventrículo izquierdo (LVID), el acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LVFS) y la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF).
   NOTA: Mantenga el contacto de la sonda con la pared torácica sin comprimir la cavidad torácica; asegurar una línea de muestreo en modo M perpendicular al tabique ventricular; Realice mediciones continuas durante ≥ 3 ciclos cardíacos para obtener valores medios.

5. Tinción de Masson

1. Toma de muestras y fijación cardíaca
   1. Anestesiar al ratón con pentobarbital sódico (80 mg/kg de pentobarbital sódico). Luego, realice una incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 cm en la cavidad torácica con unas tijeras, lime los vasos cardíacos principales y extirpe rápidamente el corazón para evitar lesiones por tracción¹².
   2. Enjuague inmediatamente el corazón extirpado con PBS preenfriado para eliminar la sangre y seque suavemente el exceso de humedad con papel de filtro limpio. Posteriormente, realizar una sección transversal a lo largo del músculo papilar para obtener un corte de tejido de 3 mm de grosor.
   3. Para la fijación, sumerja las muestras de corazón en paraformaldehído al 4% durante más de 48 h, asegurando una relación mínima de volumen de tejido a fijador de 1:10.
2. Retire el tejido cardíaco del fijador de paraformaldehído al 4%. Luego, debajo de una campana extractora, corte finamente el tejido a un grosor de 4 μm con un cuchillo quirúrgico y transfiera los cortes a un casete de deshidratación¹³.
3. Cargue las secciones de tejido en el deshidratador y realice los siguientes pasos: etanol al 70%, etanol al 80%, etanol al 95% durante 1 h cada uno; 100% etanol I & II durante 45 min cada uno; xileno I y II durante 30 min cada uno.
4. Incruste el tejido en parafina y luego solidifique los bloques en una placa fría preenfriada a -20 °C.
5. Utilice un micrótomo de parafina para obtener secciones longitudinales de 4 μm de espesor de los bloques de tejido incluidos en parafina. Luego, sumerja secuencialmente las secciones en las siguientes soluciones durante 5 min cada una para desparafinarlas y rehidratarlas: xileno I, xileno II, etanol absoluto, etanol 95%, etanol 80%, etanol 70% y finalmente agua destilada.
6. Sumerja el tejido en la solución de tinción de hematoxilina de hierro de Weigert preparada durante 8 min. Luego, enjuague repetidamente con agua destilada para eliminar el exceso de solución de manchas. Diferenciar en solución de diferenciación de etanol ácido durante 5 s, seguido de azulado en la solución de azulado de Masson durante 5 min. Finalmente, enjuague con agua destilada¹⁴.
7. Tiña las secciones con rojo carmín durante 10 min, aplicando aproximadamente 200-300 μL por portaobjetos para asegurar una cobertura completa y uniforme del tejido. Luego, enjuague las secciones con ácido acético glacial al 0,2% durante 1 min.
8. Trate las secciones con una solución de ácido fosfomolíbdico durante aproximadamente 5 min, o hasta que las fibras musculares se pongan rojas. Luego, tiñe las secciones con un volumen suficiente de solución de azul de anilina para cubrir el tejido por completo (generalmente 200-300 μL por portaobjetos) durante 5 min. Finalmente, enjuague las secciones con una solución de ácido acético glacial al 0,2%¹⁵.
9. Deshidratar las secciones a través de una serie de etanol graduado. Proceder a limpiar los tejidos con xileno utilizando tres inmersiones de 1-2 min cada una.
10. Monte las secciones aplicando una pequeña cantidad de resina neutra y cubriendo con un cubreobjetos.
11. Examen microscópico (ver Tabla de materiales): Observe los tejidos teñidos con Masson con un aumento del 40×, 20× y 10×. Fotografía cada diapositiva para preservar imágenes representativas.
    NOTA: Deseche todos los desechos de acuerdo con los protocolos de seguridad institucionales. Recoja la solución de diferenciación ácida y el ácido acético glacial en barriles resistentes a la corrosión, neutralice los desechos de alta concentración a pH 6-8 y no mezcle con soluciones alcalinas. Almacene el etanol en barriles a prueba de explosiones en un lugar fresco, lejos de fuentes de fuego. Mantenga el xileno en barriles marrones, opere en una campana extractora con el equipo de protección desgastado y no mezcle ácidos (sustancias) con etanol. Coloque los tejidos animales en recipientes etiquetados, séllelos y guárdelos en condiciones de congelación¹⁶. Finalmente, transfiera todos los desechos a instituciones profesionales calificadas para su eliminación; Prohíba estrictamente mezclar desechos o desecharlos casualmente.

6. Análisis estadístico

1. Recopile todos los datos numéricos y analícelos con GraphPad Prism 9.0.
2. Utilice la prueba t de muestra independiente para analizar las diferencias entre los grupos.
3. Establezca la significación estadística como **P < 0,01 para altamente significativo y *P < 0,05 para significativo.

Results

Doce ratones fueron implantados por vía subcutánea con bombas osmóticas y sobrevivieron. Todos los grupos modelo desarrollaron hipertensión (n = 6). Siete días después del implante, la PAS media en el grupo modelo superó los 160 mmHg (Figura 1A). En los días 14, 21 y 28, la PAS en el grupo modelo se mantuvo constantemente por encima de 160 mmHg. Por el contrario, el grupo de cirugía simulada mantuvo niveles normales de PAS (aproximadamente 90-110 mmHg) durante todo el experimento sin elevaci...

Discussion

Este protocolo optimizó los pasos clave involucrados en la infusión continua de Ang II para inducir fibrosis miocárdica hipertensiva utilizando una bomba osmótica y detalló los aspectos críticos, como el posicionamiento de implantación de la bomba osmótica y el ajuste de la concentración de Ang II. Se eligió la bomba modelo 2004 por su duración de 4 semanas, y la dosis de Ang II se calculó en función de la velocidad de infusión nominal, teniendo en cuenta la mínima variabilidad entre lot...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ang II	Corporación Sigma-Aldrich	Sigma, A9525
Máquina de anestesia animal	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R530
Ventilador para animales	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R415
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Versión 9.0
Monitor inteligente no invasivo de presión arterial	Nippon Soft Dragon Co., Ltd	Softron, BP-98A
Microscopio óptico	Yijingtong Optical Technology (Shanghai) Co., Ltd	OLYMPUS, SZ61TR
Solución y kit de tinción Tricolor Masson	Beijing Soleibao Technology Co., Ltd	Solarbio, G1340
Ratón	Chengdu Dossy Exprimental Animals CO., Ltd	C57BL/6J
Bombas osmóticas	ALZA Corporation	Alzet, Modelo 2004
Sistemas de imagen por ultrasonido	FUJIFILM VisualSonics Corporation, Canadá	FUJIFILM, Vevo 3100