Generación de organoides alveolares A549/MRC-5 embebidos en colágeno 3D utilizando un biorreactor mecánico de estiramiento celular

Resumen

Este protocolo describe la generación de organoides a partir de células epiteliales alveolares A549 y fibroblastos pulmonares MRC-5 sobre un andamiaje de hidrogel de matriz extracelular, seguida de la inserción en geles de colágeno 3D y la exposición a la tensión mecánica mediante un biorreactor de estiramiento celular para investigar la mecanobiología alveolar.

Resumen

Aunque la dinámica respiratoria y la tensión mecánica desempeñan papeles críticos en la biología alveolar, sus contribuciones a la patogénesis de las enfermedades respiratorias suelen pasarse por alto. Para abordar esta brecha, desarrollamos un modelo organoide en el que organoides fibroblastos epiteliales alveolares son sometidos a una tensión mecánica controlada mediante un biorreactor de estiramiento celular. Esta plataforma replica la organización espacial y la complejidad multicelular del tejido alveolar y permite investigar cómo la comunicación célula-célula y la mecanotransducción influyen en la estructura y función tisular en salud y enfermedad. En este protocolo, describimos métodos para generar y cultivar organoides epiteliales-fibroblastos utilizando líneas celulares de fibroblastos alveolares A549 y MRC-5 en un hidrogel de matriz extracelular de membrana basal. Los organoides se aíslan entonces de forma no enzimática e incrustan en geles de colágeno 3D en placas especializadas del biorreactor. Describimos procedimientos para aplicar la tensión equibiaxial para imitar patrones patológicos de respiración observados en exacerbaciones respiratorias. Finalmente, presentamos un flujo de trabajo estándar de caracterización, que incluye inmunotinción para marcadores específicos de cada célula y inmunoensayos para perfilar la liberación de mediadores inmunitarios. En conjunto, estos análisis apoyan la evaluación de la estructura y función organoide. Este protocolo proporciona una plataforma fácil de usar, reproducible y adaptable para estudiar la biología alveolar bajo estrés mecánico, con parámetros fácilmente modificables para cumplir diversos objetivos experimentales y avanzar en la investigación sobre los mecanismos de enfermedades pulmonares.

Introducción

Los alvéolos son los sacos terminales del sistema respiratorio y sirven como el principal lugar de intercambio de gases. Están compuestos principalmente por células epiteliales alveolares tipo I y II, responsables del intercambio gaseoso, funciones inmunitarias y mantenimiento de la integridad estructural, y fibroblastos dentro de las paredes, que mantienen la homeostasis de la matriz^{extracelular 1}. Estas y otras células residentes están continuamente expuestas a estrés cíclico de estiramiento y cizalladura durante la^{respiración 2}. Estas señales mecánicas se transducen en señales bioquímicas que influyen en la estructura celular, la diferenciación y la comunicación³.

Se observa tensión mecánica patológica en enfermedades pulmonares como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La EPOC es una condición progresiva caracterizada por la destrucción parénquimatosa, inflamación crónica y estrechamiento de las pequeñas vías^{respiratorias.} En esta enfermedad, la destrucción de las paredes alveolares, la pérdida de elastina, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) que conduce a la fibrosis y la inflamación crónica afectan colectivamente la capacidad del pulmón para soportar daños^{estructurales 5,6}. Esto provoca una deformación alveolar heterogénea y anormal durante la respiración, que se agrava aún más durante los brotes de la^{enfermedad 7,8}.

Aunque se han utilizado varios enfoques in vitro para estudiar la biología alveolar, cada uno presenta limitaciones notables. Los sistemas de cocultivo 2D facilitan la investigación de las interacciones célula-célula, pero no capturan la arquitectura tisular ni la dinámica de la matriz extracelular, reduciendo la relevancia fisiológica. Las culturas 3D estáticas preservan mejor la organización estructural y las interacciones matriciales, pero no incorporan señales mecánicas dinámicas presentes in vivo. Las plataformas microfluídicas y órgano-em-chip pueden imitar el flujo de fluidos y la tensión mecánica, proporcionando alta fidelidad fisiológica, pero a menudo son técnicamente complejas, de bajo rendimiento y^{costosas 9}. En contraste, el modelo organoide 3D tensado mecánicamente presentado aquí combina complejidad estructural, heterogeneidad celular y estimulación mecánica controlada, un aspecto a menudo pasado por alto en modelos existentes, dentro de una plataforma reproducible y escalable que ofrece un equilibrio entre relevancia fisiológica y accesibilidad^{experimental 10,11}.

Para comprender los complejos mecanismos que contribuyen a enfermedades como la EPOC y descubrir objetivos terapéuticos, se han establecido modelos de enfermedades. A pesar de su importancia, la tensión mecánica suele pasar por alto en los modelos alveolares in vitro utilizados para estudiar los mecanismos y la patogénesis de enfermedades pulmonares como la EPOC. Para cubrir esta brecha, presentamos un método para cultivar organoides de fibroblastos epiteliales alveolares en una matriz basal, recuperarlos e incrustarlos en geles de colágeno 3D, aplicar deformación mecánica cíclica mediante un biorreactor de estiramiento celular y evaluar resultados estructurales y funcionales clave. Estos modelos organoides mecánicos 3D capturan mejor las interacciones celulares y el microambiente del nicho alveolar humano, permitiendo el estudio de la diafonía epitelial-mesenquimalesa¹².

El biorreactor aplica deformación equibiaxial con parámetros configurables, permitiendo hasta un 30% de elongación y frecuencias de hasta 5 Hz para modelar tanto condiciones fisiológicas como patológicas. En este estudio, generamos modelos organoides incrustados en hidrogeles de colágeno-I sometidos a una tensión del 18% a 0,4 Hz durante 24 horas para simular la respiración patológica. Establecimos un flujo de trabajo estandarizado de caracterización que incluye inmunotinción para marcadores específicos de cada célula y inmunoensayos para cuantificar la liberación de mediadores inmunitarios tras una tensión mecánica. El objetivo de este estudio es proporcionar una plataforma fisiológicamente relevante, fácil de usar y adaptable para investigar la biología alveolar bajo estrés mecánico.

Protocolo

Todos los pasos requieren técnica aséptica, materiales estériles y reactivos, y se realizan en un gabinete de bioseguridad para reducir la exposición del personal a materiales biopeligrosos y la contaminación de cultivos. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo celular y establecimiento de stocks celulares

1. Antes de la formación de organoides, cultivar células A549 y MRC-5 en matrazas plásticas tratadas con cultivo de tejidos estándar (T75^{cm 2}) hasta una confluencia aproximada del 70%-80% utilizando el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% penicilina-estreptomicina, denominado "DMEM completo".
2. Para A549 y MRC-5, semilla en 2 x 10⁴ células/cm², en un volumen total de 10 mL de DMEM completo. Cultivar células a 37 °C con un 5% de_CO2 en un ambiente humidificado hasta alcanzar aproximadamente un 70%-80% de confluencia.
3. Sustituye el medio de cultivo cada 48 horas para asegurar condiciones óptimas de crecimiento.
4. Subcultivo aspirando todo el medio del matraz una vez que confluye al 70%-80%, lava una vez con solución salina tibia tamponada con fosfato (PBS), y luego añade 4 mL de tripsina-EDTA.
5. Incubar a 37 °C durante 5 minutos y visualizar los frascos con un microscopio de campo claro para asegurar el desprendimiento completo. Neutraliza añadiendo 4 mL de DMEM completo.
6. Cuenta las células utilizando la técnica que prefieras, como el conteo de exclusión de tripán azul.
7. Centrifuga la suspensión de celdas a 200 x g durante 5 minutos.
8. Aspira el sobrenadante para dejar un pellet celular en la parte inferior del tubo cónico. Resuspende el pellet celular en un volumen adecuado de DMEM completo triturando suavemente.
9. Para congelar, resuspende en un medio completo que contenga un 10% de DMSO para obtener un 1 x 10⁶ celdas/mL. Para la formación de organoides, resuspende para obtener 1 x 10⁶ células/mL.

2. Establecimiento y caracterización de la maduración de un modelo organoide de fibroblastos epiteliales alveolares 3D

NOTA: La matriz del sótano debe descongelarse sobre hielo durante la noche y mantenerse en hielo durante estos pasos. Las temperaturas más altas pueden provocar la solidificación de la matriz.

1. Prepara una mezcla 2:3 de matriz basal y DMEM avanzado. Añade 300 μL de esta solución a cada pozo de una placa de 24 pozos, asegurando que el fondo de cada pozo quede recubierto de manera uniforme. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada durante 1 hora para permitir que la matriz se solidifique.
2. Preparar una solución matricial basal al 5% en DMEM completo, que será el medio de cultivo para los organoides. Para cada pozo, se obtienen 1,2 mL de esta solución diluyendo 60 μL de matriz basal en 1.140 μL de DMEM completo.
3. Durante el tiempo en que la mezcla de la matriz basal se solidifica, mezcle 300.000 celdas A549 con 30.000 celdas MRC-5 en 200 μL de la solución matriz basal al 5% elaborada en DMEM completo descrito en el Paso 2.2.
4. Una vez que la mezcla basal 2:3 se ha solidificado, se pipetea 200 μL de la mezcla A549/MRC-5 sobre la matriz gelificada, y luego se devuelve la placa de 24 pozos para incubar a 37 °C, 5% de CO₂ durante 21 días para permitir el crecimiento y diferenciación de los organoides alveolares.
5. Visualiza los cultivos bajo un microscopio óptico durante las siguientes 48 horas. Las células deberían agregarse dentro de este periodo de tiempo.
6. Sustituye la matriz basal al 5% de solución DMEM cada 48 horas por 200 μL de medio fresco al 5%. Para evitar alterar los organoides incrustados en el hidrogel, inclina suavemente la placa para que la solución antigua se acumule a lo largo de la pared del pozo antes de la aspiración.
7. En los días 3, 9 y 21 de maduración, se pueden fotografiar los organoides a una ampliación objetiva de 10 veces y tomar cuatro imágenes representativas o campos de visión de cada pozo. Imágenes representativas de la morfología temprana de los organoides en los días 3, 9 y 21 se muestran en la Figura 1.
8. Para cada campo de visión, cuenta todos los organoides mayores a 50 μm de diámetro. Utilizando el área conocida del campo de visión, extrapola el número medio total de organoides por pozo a partir del conteo medio por campo, asumiendo una superficie de placas de 24 pozos de 1,9 cm².
   NOTA: Estos análisis pueden realizarse utilizando software de análisis de imágenes como Fiji¹³.
9. También se puede medir el diámetro y el área promedio de los organoides para obtener información cuantitativa sobre las características de crecimiento de los organoides en cultivo.

3. Extracción de organoides fibroblastos epiteliales alveolares 3D

NOTA: Todos los pasos para extraer los organoides deben realizarse sobre hielo.

1. Tras 21 días de maduración, aspira el sobrenadante y lava suavemente con aproximadamente 1-2 mL de PBS bien frío.
2. Añade 1-2 mL de solución fría para la extracción de organoides y incuba la placa a 2-8 °C durante 30-90 minutos con agitación moderada.
   NOTA: Detener la incubación cuando se vean los organoides flotando en el fondo del pozo.
3. Monitoriza la disociación usando microscopía de campo brillante. La disociación se considera completa una vez que la matriz del basamento en el fondo del pozo ya no es visible y los organoides están en suspensión. Un raspador de celdas puede utilizarse para desalojar suavemente el hidrogel de la matriz organoide-basal y así acelerar el proceso.
4. Agrupa el contenido de todos los pozos en un tubo cónico de 50 mL sobre hielo.
5. Centrifugar a 500 × g durante 5 minutos a 2-8 °C. Aspira el sobrenadante, lava el pellet organoide con 1-2 mL de PBS bien frío y luego centrifuga de nuevo para obtener un pellet. Aspira el PBS.

4. Establecimiento de organoides alveolar-fibroblastos embebidas en colágeno en 3D y aplicación de deformación mecánica

NOTA: Utiliza placas circulares de cultivo de espuma con anclajes de espuma compatibles con un biorreactor de estiramiento celular. La placa de cultivo utilizada en este protocolo tiene un área de crecimiento de ~6,6^cm2.

1. Prepara una solución funcional de 2 mg/mL de gel de colágeno I. La solución debe contener 1× PBS, 11,4 mM de NaOH y 2 mg/mL de colágeno I, con el volumen final ajustado con agua estéril. Prepara 2 mL de esta solución de colágeno I por pozo de la placa circular de espuma de 6 pozos.
2. Añade 1 mL de la solución de colágeno I de 2 mg/mL a los anclajes de espuma en la periferia de la placa, asegurando una saturación completa.
   NOTA: Los anclajes de espuma deben estar completamente saturados con solución de colágeno I para asegurar una adherencia adecuada. La saturación incompleta puede provocar el desprendimiento del gel de colágeno durante la aplicación de la tensión mecánica, lo que lleva a una reducción de la tensión efectiva en comparación con el objetivo previsto.
3. Resuspende el pellet organoide en 6 mL de 2 mg/mL de colágeno de cola de rata y pipete 1 mL de la suspensión en el centro de una placa circular de espuma de 6 pozos, asegurando que la mezcla de colágeno infundida con organoides se mezcle con el colágeno inicial libre de organoides añadido a los anclajes circulares de espuma.
   NOTA: Evita generar burbujas al añadir la suspensión organoide en cada pozo.
4. Polimeriza el colágeno-I durante 1 hora dejando las placas en una incubadora (37 °C, 5% CO_2). Tras la polimerización, el gel debería verse turbio.
5. Añade 2 mL de DMEM completo sobre organoides A549/MRC5 incrustados en colágeno 3D y devuelve la placa a la incubadora durante 24 horas.
6. Sustituye el medio de cultivo por DMEM + 1% FBS e incuba durante la noche antes de la exposición a la deformación mecánica.

5. Montaje del biorreactor de estiramiento celular y exposición a deformación mecánica

1. Inserta estaciones de carga en cada pozo de la base. Estos contienen seis postes de carga de 25 mm de diámetro, que permiten que la membrana flexible de las placas de Tren de Tejidos se deforme a su alrededor y exponga el cultivo 3D a la deformación equibiaxial.
2. Aplica una capa fina de grasa de silicona en la parte superior de los postes de carga.
3. Coloca juntas rojas en la parte inferior de cada placa de 6 pozos.
4. Inserta las placas preparadas en la base encima de los postes de carga.
5. Traslada este aparato a una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂ y conecta los conectores de desconexión rápida a la placa base. Repite los pasos 5.1 a 5.6, pero omitiendo las conexiones para crear un control sin tensión.
   NOTA: Opcionalmente, se puede aplicar un tapón de sellado de tubos, que evita la aplicación de presión de vacío en el fondo de un solo pozo BioFlex, permitiendo la generación de un cultivo de control no tensado en la misma placa.
6. Cubre con una lámina de Plexiglás y añade ~5-10 libras de peso para asegurar un sellado hermético.
7. Enciende el compresor de aire y abre la válvula de salida del compresor de aire.
8. Enciende la bomba de presión de vacío y abre la válvula del depósito de presión conectada a la salida del tanque de vacío. Asegúrate de que la presión de vacío esté en torno a 90 kPa.
9. Abre la válvula de entrada del compresor de aire situado cerca del controlador del biorreactor. Ajusta la presión para que no supere los 15 PSI en el puerto de ventilación.
10. Inicia el software a bordo y configura los parámetros de deformación mecánica cíclica deseados. Para este estudio, se utilizó un régimen de amplitud de deformación del 18% a 0,4 Hz durante 24 horas. Para configurarlo, crea un nuevo régimen, establece la elongación mínima en 0%, la máxima en 18% y comienza el protocolo.
11. Observa la placa y la membrana para asegurarte de que el movimiento sea visible durante toda la sesión de tensión. La membrana debería deformarse alrededor de los postes de carga.
12. Revisa periódicamente la trampa de agua en busca de humedad y observa la pantalla del ordenador para ver el tiempo de funcionamiento, el progreso y la morfología adecuada del régimen de deformación de la ventilación.
13. Desconectar el conjunto de la placa base al finalizar el régimen de deformación y devolver los cultivos filtrados a incubar durante 24 horas antes de los análisis de caracterización aguas abajo.
14. Apaga y desmonta el sistema en orden inverso al arranque: cierra o cierra la válvula de entrada del compresor de aire, luego la válvula del depósito de presión, la bomba de presión de vacío, la válvula de salida del compresor de aire y finalmente el compresor de aire, en ese orden.
15. Recoger el sobrenadante tras 24 horas de incubación tras la exposición a la tensión mecánica. Guárdalos a -80 °C hasta su uso.

6. Caracterización morfológica de organoides mediante inmunofluorescencia

1. Lava el modelo organoide-gel de colágeno tres veces con PBS añadiendo suavemente 1 mL de PBS, incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Aspira cuidadosamente el PBS y repite el proceso de lavado un total de tres veces.
3. Fijar el modelo incubando 2 mL de paraformaldehído al 4% durante 1 hora a 4 °C.
4. Lava los modelos tres veces con PBS como se ha descrito antes.
5. Utiliza un bisturí para cortar suavemente los anclajes circulares de espuma en los pozos flexibles con el gel de colágeno adherido y colócala en una placa de Petri.
6. Permeabiliza los organoides incubándolos con 2 mL de Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Lava los modelos tres veces con PBS.
8. Bloquear la unión inespecífica incubando los modelos con 3 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Retira la solución bloqueante y pasa al siguiente paso.
9. Incubar los modelos durante la noche a 4 °C con un cóctel de tinción que contiene occludens-1 anti-humano zonula conjugado con Alexa Fluor 594 a una dilución 1:100, faloidina conjugada con Alexa Fluor 488 a una dilución 1:1000 para la evaluación de F-actina, y la tinción nuclear, DAPI a una dilución 1:4000. El diluyente es de 1 mL de BSA al 1% en PBS. Cinta los bordes de la placa antes de la incubación a 4 °C.
10. Aspira la solución de cóctel de manchas al día siguiente y lava los modelos tres veces con PBS.
11. Fotografía usando un microscopio confocal y toma pilas Z a 5 μm de organoides representativos a 40x de aumento objetivo.
12. Analizar la intensidad de fluorescencia usando software de análisis de imágenes Fiyi. Normaliza la intensidad media de fluorescencia con el área del organoide para asegurar una comparación precisa entre diferentes condiciones ambientales.

7. Caracterización funcional de organoides mediante ELISA y ensayo de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa (LDH)

1. Descongelar los supernacionantes sobre hielo y evaluar la secreción de interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) utilizando kits ELISA disponibles comercialmente según el protocolo del fabricante.
2. Evalúa la liberación de LDH, un marcador de citotoxicidad, utilizando un ensayo comercial de absorción de LDH.
3. Genera una curva estándar usando proteína LDH recombinante a concentraciones de medio logarítmic desde 0,5 μg hasta 0,5 ng. Interpola las concentraciones de LDH de cada muestra usando la curva estándar.

8. Opcional: Aislamiento de muestras para análisis de ARN o proteínas

1. En lugar de añadir un 4% de paraformaldehído para la tinción por inmunofluorescencia, se añade un tampón RLT preparado que contiene β-mercaptoetanol a 10 μL por 1 mL de RLT.
2. Usa 300 μL por modelo y haz una pipete arriba y abajo para desprender y lisar completamente las celdas.
3. Transfiere el lisato a un tubo microcentrífuga libre de RNasa y coloca los tubos sobre hielo seco para que se congelen rápidamente. Transfiere a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Alternativamente, se puede usar el tampón RIPA para la extracción de proteínas preparando: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4-7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40 o Triton X-100; 0,5% desoxicolato sódico; 0,1% SDS en agua desionizada. El buffer RIPA prefabricado también está disponible comercialmente.
4. Añade 200 μL por modelo, pon piedra sobre hielo durante 5 minutos y luego recoge el lisato.
5. Centrifuga a 15.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para pelletar los restos de la celda y transfiere a -80 °C para almacenamiento a largo plazo.

Resultados

Se establecieron y cultivaron organoides alveolares de fibroblastos epiteliales derivados de líneas celulares durante más de 21 días. Se observaron cambios morfológicos durante todo este tiempo, evaluándose el número, área y diámetro organoides en los días 3, 9 y 21 para monitorizar el crecimiento y desarrollo. El número medio de organoides por pozo disminuyó significativamente en los días 9 y 21 en comparación con el día 3 (Figura 2A). En cambio, el área y ...

Discusión

Los organoides alveolares fibroblastos epiteliales tridimensionales (3D) representan una plataforma altamente relevante fisiológicamente para modelar la estructura y función pulmonar bajo tensión mecánica. A diferencia de los sistemas de co-cultivo 2D o incluso 3D, los organoides preservan características críticas del microambiente pulmonar in vivo, incluyendo la organización espacial, la diafonía epitelio-mesenquimal y las interacciones con la matriz extracelular

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	0030 125.215
Tubo cónico de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-53A
16% de paraformaldehído	Thermo Fisher Scientific	28908
2-mercaptoetanol	Millipore Sigma	M3148
Tubo cónico de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Placa circular de espuma Tissue Train de 6 pozos (membrana flexible)	Flexcell International	TTCF-5001
Celdas A549	Colección de Cultura de Tipo Americano (ATCC)	CCL-171
Compresor de aire	Herramientas Aerodinámicas de California	10020DSPCAD
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	A9418
Buffer RLT	Qiagen	79216
Incubadora CO2	PHCBI	MCO-170AICUVL-PA
Solución de extracción de organoides Cultrex	Bio-Techne	3700-100-01
Kit de ensayo de citotoxicidad CyQUANT LDH	Thermo Fisher Scientific	C20300
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dimetilsulfóxido	Sigma Aldrich	D2650-100ML
Dulbecco' s modificado Eagle' s medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11965092
Microscopio EVOS XL Core	Thermo Fisher Scientific	AMEX1200
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	A5209501
Software de análisis de imágenes en Fiyi	Institutos Nacionales de Salud
Sistema de tensión y tejido Flexcell FX-6000 (incluye controlador de tensión Flexlink FX-6000, depósito de presión, placa base, ventana de acrílico, estaciones de carga cilíndricas de 25 mm de diámetro, sifón de agua, software FlexSoft FX-6000 V1.0 y varios tubos)	Flexcell International	FX6000T
Interleucina-6 Duoset Humano ELISA	Bio-Techne	DY206
Interleucina-8 Duoset Humano ELISA	Bio-Techne	DY208
Microscopio confocal Leica DMi8	Leica Microsystems	11889122
Matriz de membrana basal Matrigel	Corning	356237
Células MRC-5	ATCC	CCL-185
Parafilm	Millipore Sigma	P7793
Penicilina/estreptomicina (Pen/PTREP)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Sondas de marcaje de faloidinas, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A12379
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Colágeno de cola de rata I	Sigma-Aldrich	C3867
Proteína recombinante de lactato humano deshidrogenasa (activa)	Abcam	Ab93699
Búfer de lisis RIPA	Thermo Fisher Scientific	89901
Tubos microfugados sin RNasa	Thermo Fisher Scientific	AM12400
Matraz de cultivo T75 cm2	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-5ML
Anticuerpo monoclonal ZO-1 (ZO1-1A12), Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	339194