Artículo de método

In vitro Reconstitución de la ubiquitinación bacteriana y eliminación mediada por VCP/p97

DOI:

10.3791/69454

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2 de enero de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe un método para ubiquitinar Streptococcus pneumoniae utilizando lisado celular de mamífero o complejo enzimático puro de ubiquitina puro, seguido de un tratamiento con complejo proteico purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para evaluar su actividad bacteriolítica, permitiendo el estudio de efectores inmunitarios dependientes de ubiquitina.

Resumen

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La ubiquitinación es una modificación postraduccional versátil que desempeña un papel fundamental en la inmunidad citosólica. Al invadir las células huésped, las bacterias patógenas quedan inicialmente encerradas dentro de un endosoma, del cual se liberan y escapan al citosol para evitar la degradación lisosomal. Una vez en el citosol, las bacterias son rápidamente marcadas con cadenas de ubiquitina por las ligasas E3 del hospedador, marcándolas para su eliminación a través de múltiples vías efectoras, incluyendo la autofagia y el proteasoma. Para delimitar la contribución de las vías individuales en la eliminación bacteriana, la reconstitución in vitro ofrece un enfoque controlado y sin ambigüedades. Aquí, utilizando Streptococcus pneumoniae (SPN) como patógeno bacteriano modelo, presentamos un protocolo detallado para su ubiquitinación utilizando lisados celulares de mamíferos o complejo enzimático puro de ubiquitina pura, seguido de tratamiento con complejo purificado VCP/p97-UFD1-NPLOC4 para evaluar su actividad bacteriolítica independientemente de otros factores celulares. En conjunto, este procedimiento tiene el potencial de iluminar la función de las ligases y efectores de ubiquitina vinculados a la inmunidad en un contexto libre de células, donde diseccionar estos mecanismos puede ser complicado en células intactas.

Introducción

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La ubiquitina (Ub) es una pequeña proteína de 8,6 kDa que modifica sustratos objetivo al adherirse covalentemente a ellos en su glicina C-terminal, creando un enlace isopeptídico con el grupo ε-amino de los residuos de lisina en un proceso llamadoubiquitinación 1. Este fenómeno está regido por una serie de pasos orquestados que involucran una enzima activadora de ubiquitina E1, una enzima conjugante de ubiquitina E2 y una ligasa ubiquitinaE3 1,2,3. Ub puede unirse como monómero o como cadenas de diferentes longitudes a través de sus siete residuos de lisina (Lineal/M1, K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63)4. Estas cadenas únicas de Ub actúan como marcadores moleculares para diversas funciones celulares, como la degradación proteasómica, el tráfico celular, la reparación del ADN y la autofagiaselectiva 3.

Aunque el papel canónico de la ubiquitinación se ha asociado durante mucho tiempo con el mantenimiento de la homeostasis celular, como degradar proteínas mal plegadas mediante proteasomas o dirigir cargas específicas hacia la autofagiaselectiva 5,6, ahora es evidente que la ubiquitina también funciona como un mecanismo crucial de detección del sistema inmunitario citosólico frente a infecciones bacterianas. Las bacterias intracelulares infiltran frecuentemente las células hospedadoras para evitar la detección por la respuesta inmunitaria extracelular y se reproducen en un entornoprotegido 7,8. Numerosos patógenos emplean sistemas secretores y toxinas para dañar irreparablemente las vacuolas que los transportan, permitiendo la fuga al citosol para obtenernutrientes 9,10. Una vez dentro del citosol, estas bacterias se decoran con cadenas de poliubiquitina por ligasas específicas de E3, actuando como una "etiqueta de muerte" molecular, que las dirige hacia la eliminación selectiva. Por ejemplo, la ligasa E3 SMURF1 interactúa con Mycobacterium tuberculosis iniciando la poliubiquitinación ligada a K48 directamente en su superficie, lo que conduce a su degradación mediante elproteasomo 11. La parkina se acumula en vacuolas que contienen bacterias y forma cadenas de ubiquitina12 vinculadas a K63, mientras que ARIH1 y LRSAM1 modifican las superficies de bacterias con cadenas K48 y K6, respectivamente, inhibiendo así el crecimientobacteriano 13,14. Aunque la mayoría de las ligases E3 se dirigen principalmente a sustratos proteicos del huésped, algunas ligases muestran una especificidad notable para componentes microbianos. RNF213 identifica y ubiquitina lipopolisacáridos (LPS) encontrados en Salmonella enterica serovarTyphimurium 15, y el complejoSCF FBXO2 reconoce glicanos bacterianos presentes en el Streptococcus del Grupo A como sustrato para la ubiquitinación16, facilitando la xenofagia. El complejoSCF FBXW7, por otro lado, reconoce motivos de degrón dentro de las proteínas superficiales de Streptococcus pneumoniae (SPN). Entre ellas se encuentran β-galactosidasa A (BgaA) y la proteína de superficie neumocócica A (PspA), que, tras ser marcadas con cadenas de poliubiquitina vinculadas a K48, se confirmaron usando anticuerpos específicos de Ub ligados a K48, presumiblemente atraen el sistema proteasomal, permitiendo la eliminación bacterianaefectiva 17.

Aunque el proceso de marcado de estos invasores citosólicos con ubiquitina está bien comprendido, el mecanismo posterior por el cual el sistema proteasómico elimina tales entidades microbianas grandes sigue siendo dudoso. Investigaciones recientes han revelado que la ATPasa AAA+ del huésped, VCP/p97 (proteína que contiene Valosina), desempeña un papel crucial en este proceso. En colaboración con cofactores como UFD1 y NPLOC4, el VCP puede identificar bacterias marcadas con poliubiquitina y extraer físicamente proteínas ubiquitinadas de la membrana bacteriana, rompiéndolas y facilitando su eliminación del entorno citosólico sin depender de la maquinariaproteasómica 18.

El citosol huésped contiene una compleja red de vías inmunitarias que funcionan en paralelo y de forma infalible para garantizar la eliminación de patógenos. Esta redundancia es crucial para una defensa sólida, pero complica los esfuerzos para identificar y examinar el papel de los factores inmunesindividuales 19. En este sentido, los sistemas de reconstitución in vitro ofrecen una plataforma útil para analizar vías específicas bajo condiciones controladas. Aquí introducimos un sistema libre de células que recapitula el proceso de ubiquitinación y pérdida de viabilidad del SPN utilizando lisados celulares de mamíferos o enzimas E1-E2-E3-Ub junto con complejos efectores purificados del huésped. En este protocolo de dos pasos, primero facilitamos la conjugación de cadenas de poliubiquitina en las bacterias, seguido de evaluar su eliminación mediante VCP/p97 en asociación con UFD1 y NPLOC4. Al reconstituir esta vía in vitro, evitamos las complejidades celulares e investigamos específicamente la capacidad del VCP para neutralizar el patógeno. Esta configuración precisa permite una exploración detallada del reconocimiento de sustratos, la especificidad de cadenas, el modo de acción del efector y los componentes esenciales necesarios para iniciar una respuesta efectiva.

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Protocolo

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1. Preparación de cultivo celular y lisado

  1. Descongela las células de A549 y hazlas crecer en un matraz de T25 usando DMEM completo con suero fetal bovino al 10% (FBS). Incubar a 37 °C en un ambiente humidificado con 5% de CO2. Pasar las células por tres conductos para mantenimiento, luego transfiere 2 × 106 celdas a un matraz T75. Continúa el cultivo hasta que la densidad celular alcance 8-10 × 106 células.
  2. Raspa las células del matraz T75 a 4 °C usando un tampón de reacción que contiene 200 mM de HEPES, 100 mM deMgCl 2, 1 M de KCl y 5% de glicerol a pH 7,4. Centrifugar las celdas raspadas a 120 × g durante 10 minutos para pelletarlas, luego resuspenderlas en el buffer de reacción para lograr un volumen final de aproximadamente 0,6 mL en un tubo centrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: La muestra completa debe procesarse en hielo.
  3. Sonica la suspensión de la celda usando una sonda estrecha (punta de diámetro, 2 mm) a una amplitud de 40 μm con 2 segundos de pulsos encendido/apagado durante una duración de 2-2,5 minutos, manteniendo la mezcla en hielo. Centrifugar las muestras sonicadas a 21.000 × g durante 45 minutos, recoger el sobrenadante resultante y añadir 2-3 veces el cóctel inhibidor de la proteasa 50x.
    NOTA: O bien se utiliza el lisato inmediatamente para la reacción de ubiquitinación el mismo día o se congela rápidamente usando nitrógeno líquido y se almacena a -80 °C; Sin embargo, asegúrate de usarlo en un plazo máximo de 3 días para una ubiquitinación efectiva. La concentración de lisato, que oscila entre 2 y 4 mg/mL, es adecuada para la ubiquitinación.

2. Cultivo bacteriano

  1. Cultivar la bacteria Streptococcus pneumoniae (SPN) cepa R6 (Serotipo II) durante la noche a 37 °C con 5% de CO2 en un medio THY compuesto por polvo de caldo Todd Hewitt (3,7 g/100 mL) y polvo de extracto de levadura (1,5 g/100 mL).
    NOTA: Evita inocular las bacterias si el medio ha cambiado a un color marrón oscuro. Streptococcus pneumoniae está clasificado como patógeno de Nivel de Bioseguridad 2 (BSL-2); tomar precauciones y seguir los protocolos correctos de contención BSL-2, incluyendo el uso de un armario de bioseguridad certificado.
  2. Al día siguiente, inocular desde el cultivo nocturno en un medio THY fresco (1:10) a 37 °C con 5% deCO2 y aumentar el SPN hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600 nm) alcance 0,4. Prepara un stock de glicerol de SPN (900 μL de cultivo SPN y 600 μL de glicerol (50%) y guárdalo a -80 °C.
  3. El día del experimento de ubiquitinación, descongela un nuevo stock de SPN desde -80 °C y inocularlo completamente en un medio THY de 5 mL y deja que crezca hasta queel OD 600 nm alcance 0,4.
    NOTA: El cultivo bacteriano se cultivó hasta alcanzar un ODde 600 nm de 0,4, lo que corresponde aproximadamente a10 8 células SPN por mL. Esta correlación se estableció enumerando unidades formadoras de colonias (UFC), determinadas diluyendo en serie el cultivo en 1x PBS para disminuir la concentración de células bacterianas y así obtener colonias numerables y spotting en placas de agar BHI, un medio más enriquecido que el THY.

3. Ensayo de ubiquitinación in vitro a partir de lisado de mamíferos

  1. Toma aproximadamente 10 7células SPN y lávate bien al menos tres veces con el tampón de reacción (200 mM HEPES, 100 mMMgCl 2, 1 M KCl y 5% de glucerol a pH 7,4) resuspendiendo las bacterias en el siguiente tampón, seguido de centrifugación a 21.000 × g durante 5 minutos, para finalmente pelletarlas mediante centrifugación a 21.000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  2. Resuspende el pellet de SPN con lisado celular de mamífero A549 junto con ubiquitina purificada (350 μM) y 1 mM de ATP e incuba durante 1-2 horas a 27 °C.
    NOTA: Evita congelar y descongelar el lisado celular de mamíferos. Es mejor que el lisato se prepare el mismo día del ensayo de ubiquitinación.
  3. Tras la incubación, lava las bacterias con un tampón de reacción que contiene 1 M de urea, seguido de dos lavados solo con tampón de reacción y fijación con paraformaldehído al 1% (PFA). Tras la fijación, incuba las células con PBS que contenga glicina (1 mg/mL) durante 15 minutos, seguido de dos lavados de PBS 1.
    NOTA: Se utiliza un lavado de urea de 1 M para interrumpir ligeramente las interacciones no covalentes, asegurando que solo queden bacterias ubicuquitinadas covalentemente. Después, es importante lavar bien con tampón de reacción para eliminar la urea residual, ya que su presencia puede interferir con el ensayo de muerte in vitro .
    Como control negativo, prepara toda la mezcla de reacción e incubala con bacterias sobre hielo para inhibir la actividad enzimática. Justo después de la incubación, enjuaga la muestra y luego fijala usando PFA al 1% para mantener el estado de la reacción.

4. Ensayo de ubiquitinación in vitro a partir del complejo enzimático E1-E2-E3

  1. Prepara primero una mezcla de reacción que consista en ubiquitina (350 μM), UBE1 (400-800 nM), UbE2C (3-5 μM), complejo Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (500 nM) y 2 mM de ATP en tampón de reacción (200 mM HEPES, 100 mM MgCl2, 1 M KCl y 5% de glicerol a pH 7,4), para obtener el volumen total de reacción de 100-150 μL.
    NOTA: Almacena todas las enzimas a -80 °C. Para evitar perder actividad por múltiples ciclos de congelación-descongelación, crea pequeñas alicuotas y utiliza nuevas para cada reacción de ubiquitinación.
  2. Resuspende las bacterias (10,7 UFC) en esta mezcla de reacción que contiene ubiquitina y incuba durante 2 horas a 27 °C. Posteriormente, lava las bacterias con un tampón de reacción que contiene 1 M urea durante al menos 3 veces, seguido de fijación con paraformaldehído (PFA) al 1%. Tras la fijación, incuba las células con PBS que contenga glicina (1 mg/mL) durante 15 minutos, seguido de dos lavados de PBS 1.
    NOTA: Si hay una pérdida excesiva de células, se puede reducir el número de lavados.

5. Visualización de bacterias ubiquitinadas

  1. Después de fijar la muestra con PFA al 1%, incubarla en BSA al 3% durante 1 hora a 27 °C, y luego realizar dos lavados con 1x PBS.
  2. Resuspender las bacterias ubiquitinadas utilizando un anticuerpo primario a concentraciones superiores a las que normalmente se utilizan en los ensayos de inmunofluorescencia. Utiliza un anticuerpo específico para bacterias junto con un anticuerpo antiubiquitina (1:100), diluido en PBS que contiene 1% de BSA, para teñir a 27 °C durante 1 hora.
    NOTA: Para una tinción óptima de anticuerpos, utiliza un tubo centrífugo de baja unión a proteínas para minimizar la pérdida de anticuerpos o una concentración de anticuerpos más alta para obtener los mejores resultados.
  3. Posteriormente, lava las bacterias dos veces con 1x PBS y luego resuspende con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con Alexa Fluor 488 y 555, respectivamente, durante 1 hora a 27 °C.
  4. Aplica alrededor de 10-20 μL de la muestra bacteriana marcada mediante colada por gota y mezcla 5-10 μL de medio de montaje con o sin DAPI, luego coloca un engobe de cubierta encima y utiliza papel de seda para absorber el exceso de líquido. Finalmente, observa la muestra bajo un microscopio confocal el mismo día.

6. Expresión y purificación de proteínas

  1. Para la expresión de VCP/p97 de tipo salvaje, transformar el plásmido pET28a que contiene VCP en la cepa BL21-DE3 de E. coli mediante un protocolo estándar de transformación de E. coli 20. Las colonias incubadas se formaron tras la transformación durante la noche en el caldo Luria (LB) a 37 °C. Al día siguiente, inocular el cultivo a 1:50 en un matraz bien aireado que contenga LB y dejar que crezca hasta que el diámetro exterior600 nm alcance 0,7-0,8. Añadir 200 μM de IPTG al cultivo e incubar durante 5 horas a 37 °C con agitación a 180 rpm; confirmar la expresión proteica mediante una SDS-PAGE.
    NOTA: Durante toda la etapa de crecimiento y expresión bacteriana, se utilizó Kanamicina (50 μg/mL) como presión de selección.
  2. Para la expresión de UFD1 de tipo salvaje, transformar el plásmido pET41b que contiene UFD1 en la cepa BL21-Rosetta de E. coli mediante el protocolo estándar de transformación de E. coli 20. Las colonias incubadas se formaron tras la transformación durante la noche en el caldo Luria (LB) a 37 °C. Al día siguiente, inocular el cultivo a 1:50 en un matraz bien aireado que contenga LB y dejar que crezca hasta que el diámetro exterior600 nm alcance 0,7-0,8. Añadir 1 mM de IPTG al cultivo e incubar durante 5 horas a 37 °C con agitación a 180 rpm; confirmar la expresión proteica mediante una SDS-PAGE.
  3. Para expresar NPLOC4 de tipo salvaje, introduce el plásmido pET41b que contiene NPLOC4 en la cepa BL21-Rosetta de E. coli utilizando el método estándar de transformación de E. coli 20. Incubar las colonias que surjan de la transformación en el caldo Luria (LB) durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, transfiere una dilución 1:50 del cultivo a un matraz bien aireado lleno de LB, y déjela crecer hasta que la densidad óptica aOD 600 nm alcance 0,7-0,8. Después de eso, añadir 1 mM de IPTG al cultivo y continuar la incubación durante 16 horas a 18 °C agitando a 180 rpm; verificar la expresión proteica realizando un análisis SDS-PAGE.
    NOTA: Durante toda la etapa de crecimiento y expresión bacteriana realizada en la cepa E. coli BL21-Rosetta, se utilizaron kanamicina (50 μg/mL) y cloranfenicol (20 μg/mL) como presión de selección. Las secuencias de pET28a-p97 y pET41b-NPLOC4 se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
  4. Tras la expresión proteica, centrifugar las células bacterianas a 21.000 × g durante 10 minutos y volver a suspender el pellet en un tampón de lisis que contiene 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 1 mM de PMSF, 5% de glicerol y pH 8.
  5. Sonica las celdas durante 1 hora usando una sonda estrecha (diámetro de punta, 6 mm) a una amplitud de 50 μm, y con un pulso de 20 segundos encendido/apagado a 4 °C. Pelleta los restos usando 15.000 × g durante 1 hora y recoge el sobrenadante.
    NOTA: La sonicación total se realizó durante 1 hora (30 min ON y 30 min OFF como pulsos de 20 s), y el proceso continuó hasta que la suspensión de la célula turbia se volvió translúcida a transparente. Se requiere centrifugación a alta velocidad para asegurar que los restos celulares permanezcan en pellets y no se desprendan durante la carga del lisato sobre la columna de purificación de proteínas.
  6. Pasa el sobrenadante por un filtro de 0,4 μm y cárgalo sobre la columna repleta de perlas de Ni-NTA para purificación de afinidad, preequilibrado con tampón de purificación (50 mM Tris-Cl, 300 mM NaCl, 5 mM β-mercaptoetanol, 5% glicerol, pH 8).
  7. Enjuaga la columna rica en proteínas usando un tampón de lavado que contiene 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 5% de glicerol, pH 8 y 30-60 mM de imidazol de aproximadamente 400 mL, y luego eluye la proteína con un tampón de elución que incluye 50 mM de Tris-Cl, 300 mM de NaCl, 5 mM de β-mercaptoetanol, 5% de glicerol, pH 8 y 250 mM de imidazol.
    NOTA: La concentración de imidazol y el volumen de lavado pueden variar según la proteína específica que se esté analizando. Para evaluar la pureza, se debe realizar SDS-PAGE. Es esencial lavar la columna a fondo hasta que el eluente muestre una reacción negativa con el reactivo de Bradford. La fracción eluída muestra una banda prominente y concentrada de la proteína objetivo, que debería representar predominantemente la muestra, con solo trazas menores, si es que hay alguna, de otras proteínas.
  8. Recoge varias fracciones, analízalas con SDS PAGE para identificar qué fracciones contienen las proteínas puras y luego realiza un intercambio de tampón en el tampón de reacción (200 mM HEPES, 100 mMMgCl 2, 1 M KCl y 5% de glicerol a pH 7,4) utilizando una columna PD-10.
    NOTA: Mide la concentración de proteínas usando el reactivo Bradford (Coomassie Brilliant Blue G-250). Todas las proteínas deben congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C.

7. Ensayo in vitro para matar bacterias

  1. Combina 6 μM de VCP/p97 con 1 μM de NPLOC4 y UFD1, luego llena el volumen con buffer de reacción hasta aproximadamente 90 μL. Deja que esta mezcla de reacción se incube sobre hielo durante 2 horas.
  2. Añade 1-2 mM de ATP a la mezcla de reacción que incluye p97-UFD1-NPLOC4, y luego combínalo con el SPN ubiquitinado (107 celdas) durante una duración de 2 horas a 37 °C.
  3. Para evaluar la viabilidad bacteriana, inmediatamente después del tratamiento, toma una aalícuota de 1 μl de la mezcla de reacción, realiza una dilución en serie (1:1, 1:10, 1:100 y 1:1000) y coloca 10-2 μL de cada dilución sobre placas de agar de Infusión Cerebro-Corazón (BHI). Repite este procedimiento usando una aliteracia de 1 μL de la reacción tras 2 horas de incubación.
    NOTA: Localiza todas las diluciones para obtener mejores resultados.
  4. Evalúa las unidades formadoras de colonias (UFC) entre los puntos de tiempo de 0 h y 2 h. Calcular la viabilidad bacteriana (%) dividiendo el recuento de UFC a las 2 h por el recuento de UFC a 0 h, y luego multiplicando el resultado por 100.
    NOTA: Para obtener resultados más fiables, utilice VCP/p97 desnaturalizado por calor, VCP/p97 que careza del complejo cofactor UFD1-NPLOC4, o una variante deficiente en ATPasa de VCP/p97 para comparación como control negativo.

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Resultados

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Nuestro protocolo detalla la utilización de células A549 de mamíferos para producir un lisado celular rico en los componentes necesarios para iniciar un proceso de ubiquitinación (Figura 1A). Este lizado, ya sea en estado concentrado o sustituido por componentes purificados como UBE1 (la enzima activadora de ubiquitina E1), UbE2C (una enzima conjugante de ubiquitina E2) y el complejo Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 (ligasa E3 de ubiquitina), se mezcla con ubiquitina pur...

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Discusión

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Aunque el sistema de reconstitución in vitro detallado aquí ofrece un marco sólido para explorar las complejidades moleculares de la ubiquitinación y eliminación bacteriana, deben considerarse varias limitaciones significativas. La dependencia de concentraciones suprafisiológicas de proteínas purificadas, que comprenden la maquinaria de ubiquitinación (ligasas E1, E2, E3, ubiquitina) y el complejo efector del huésped (VCP/p97, UFD1, NPLOC4), ofrece conocimientos mecanicistas cla...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

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Expresamos nuestro agradecimiento a la Instalación de Bioseguridad Nivel 2 y a la Instalación de Microscopía Confocal del IIT Bombay. Sourav Ghosh. (17/06/2018(i) UE-V), Sumit Rakshit (221610197857) y Udit Kumar Das (24D0061) han recibido becas de CSIR, UGC, Gobierno de India e IIT Bombay, respectivamente. Anirban Banerjee ha recibido financiación para investigación del Science and Engineering Research Board, Gobierno de la India (subvención número SPR/2019/000808) y de la Ignite Life Science Foundation (subvención número IGNITE/FG-OC/2021/004). Los organismos financiadores no participaron en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicarlo ni la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cóctel inhibidor de proteasa 50XPromega G6521
6x-His-UbiquitinUBPBioE1100
Línea celular A549  ATCCATCC CCL-185
Alexa Fluor 488InvitrogenA21202 
Alexa Fluor 555InvitrogenA-31572   
Anticuerpo antiubiquitinaEnzoBML-PW8810-0100
Anti-ubiquitina K48, anticuerpo clon Apu2Sigma AldrichZRB2150
ATPSigma AldrichA6419
BHIHiMedia M210
DMEM (glucosa alta)HiMedia AL251
FBSGibco (origen estadounidense)38220090
GlicerolPureSynth PSR37325
HEPESSigma AldrichH4034-100G
KClSigma AldrichP3911
MgCl2Sigma AldrichTC006
Paraformaldehído Sigma AldrichE6148
Plásmido pET28a-p97Nuestro laboratorioPlásmido disponible bajo petición
Plásmido pET41b-NPLOC4Nuestro laboratorioPlásmido disponible bajo petición
Plásmido pET41b-UFD1AddgenePlásmido #117107
Rbx1-Skp1-Cul1-Fbxw7 Sigma Aldrich23-030
Cepa R6 de Streptococcus pneumoniaeATCCATCC BAA-255Patógeno del Grupo de Riesgo -2, que se manejará en la instalación BSL-2
Polvo de caldo Todd HewittHiMedia M313
UBE1UBPBioB1100
UbE2CUBPBioC1300
UreaHiMedia MB032
Polvo de extracto de levadura  HiMedia RM027

Referencias

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