Artículo de método

Microfabricación de sustratos con gradientes de rigidez a microescala para guiar la migración de células estromales de la médula ósea

DOI:

10.3791/69473

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14 de noviembre de 2025

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education, Hubei Key Laboratory of Stomatology, School & Hospital of Stomatology, Wuhan University, 2School of Power and Mechanical Engineering, The Institute of Technological Science, Wuhan University, 3Department of Oral Implantology, School and Hospital of Stomatology, Wuhan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla la fabricación de un sustrato de polidimetilsiloxano bicapa (PDMS) mediante litografía blanda. El método utiliza microestructuras moduladas geométricamente en una capa inferior rígida combinada con una capa superior plana y blanda para generar gradientes de rigidez efectivos a microescala, lo que permite estudios de mecanobiología celular sin interferencias topográficas.

Resumen

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Comprender cómo responden las células a las señales mecánicas es crucial para dilucidar los mecanismos involucrados en el desarrollo de tejidos y la progresión de la enfermedad. Sin embargo, los sustratos de cultivo celular in vitro existentes a menudo no logran replicar los gradientes de rigidez fisiológica a escala celular y, al mismo tiempo, eliminan las señales topográficas confusas. En este estudio, presentamos un modelo de rigidez desacoplado utilizando un sustrato de polidimetilsiloxano bicapa (PDMS). Este sustrato consiste en una película superior suave y plana suspendida sobre una capa inferior rígida con microestructuras de cresta y ranura. La capa superior transmite eficazmente las variaciones de rigidez en la estructura subyacente mientras mantiene una topografía y química uniformes en la superficie de contacto celular. La modulación de la rigidez se logra variando el ancho de las crestas y ranuras alternas, que están espaciadas por igual. La microscopía electrónica de barrido confirmó la morfología de la superficie plana y la topografía de contacto consistente. La microscopía de fuerza atómica demostró que las variaciones de rigidez dependían de la microestructura: para patrones de 20 μm, los módulos elásticos eran de aproximadamente 950 kPa para crestas y 850 kPa para ranuras; para patrones de 50 μm, estos valores fueron de alrededor de 1070 kPa y 950 kPa, respectivamente. Las células primarias de médula ósea de ratón se adhirieron bien y se extendieron sobre el sustrato, mostrando una preferencia por la localización nuclear hacia las regiones de cresta más rígidas en el patrón de 50 μm (61,49%, p < 0,05), confirmando así la percepción celular efectiva del gradiente mecánico. En resumen, este protocolo ofrece un método reproducible para construir un sustrato de cultivo celular con gradientes de rigidez a microescala, minimizando la interferencia química o topográfica, lo que permite investigar la mecanotransducción celular.

Introducción

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Las células tienen la capacidad de detectar y responder a estímulos mecánicos dentro de su microambiente externo 1,2,3, que son cruciales para regular varios procesos celulares, incluida la adhesión, la migración, la proliferación y la diferenciación4. In vivo, las propiedades mecánicas del microambiente tisular exhiben una heterogeneidad espacial significativa, con variaciones en la rigidez de la matriz observadas tanto en contextos fisiológicos, como en las uniones del hueso y el músculo, como en condiciones patológicas, como dentro de los tumores 5,6,7. Una investigación exhaustiva de estos factores mecánicos es esencial para comprender los mecanismos reguladores que rigen el comportamiento celular. Estos mecanismos son fundamentales en procesos como el desarrollo de tejidos, la progresión de la enfermedad y el proceso de regeneración y reparación 8,9.

Para simular este complejo microambiente mecánico in vitro, los hidrogeles o elastómeros se utilizan ampliamente para crear sustratos con rigidez variable ajustando el grado de reticulación o la relación de componentes 3,10,11,12,13. Sin embargo, estos métodos a menudo dan como resultado cambios discretos de rigidez que no logran reproducir los gradientes de rigidez continuos a microescala que imitan con precisión las condiciones fisiológicas 13,14,15,16,17. Estudios recientes han explorado técnicas como la reticulación óptica (por ejemplo, el uso de una fotomáscara para regular la exposición a los rayos UV)18, la mezcla multicanal microfluídica19,20 y los medios impulsados por difusión21 para construir gradientes de rigidez. Desafortunadamente, estos enfoques pueden ser técnicamente complejos e introducir variables adicionales, como el tamaño de malla22, la hinchazón23,24 y la topografía25. La introducción de factores de alteración complica la interpretación de las respuestas celulares a la rigidez. Se ha adoptado un sistema PDMS bicapa, que utiliza matrices de micropilares o patrones de tablero de ajedrez como estructura de soporte, para crear sustratos de cultivo celular con gradientes de rigidez26,27. Estos enfoques se basan en soportes subyacentes discretos debajo de una membrana químicamente homogénea para lograr la modulación de la rigidez isotrópica, proporcionando plataformas valiosas para investigar la adhesión y propagación celular. Sin embargo, el microambiente celular nativo in vivo suele ser altamente anisotrópico en sus propiedades mecánicas28,29. Se postula que esta señalización mecánica direccional influye profundamente en los eventos biológicos fundamentales. Por lo tanto, las estrategias actuales de biofabricación están limitadas en su capacidad para replicar las sutiles interacciones de rigidez celular observadas in vivo, que dependen de imitar con precisión los gradientes de rigidez a microescala y la heterogeneidad espacial dentro de los sustratos cargados en células.

Investigaciones anteriores han demostrado que las células pueden percibir la rigidez efectiva de los objetos rígidos incluso cuando no están en contacto celular directo30. Con base en este estudio, presentamos un nuevo sustrato de cultivo celular de polidimetilsiloxano bicapa (PDMS) que genera gradientes de rigidez controlados a escalas espaciales que van de 5 a 50 μm, alineándose con el rango de tamaño relevante para la mecanosinización subcelular y unicelular. El sustrato consta de dos capas distintas: una capa inferior rígida de PDMS con microestructuras geométricas sintonizables y una capa superior de PDMS suave y plana uniforme que sirve como superficie de contacto celular. Este diseño permite la modulación mecánica únicamente a través de variaciones en la geometría de la subestructura, al tiempo que mantiene una química y topografía de superficie consistentes. En consecuencia, desacopla eficazmente la señal de rigidez de otras señales físicas y químicas, ofreciendo un sistema biológicamente más relevante para la modulación de la rigidez.

A diferencia de los sustratos tradicionales a base de hidrogel, nuestro enfoque permite estudios mecánicos de una sola variable sin interferencia de hinchazón, tamaño de malla o topología de superficie. El sustrato es fácil de fabricar utilizando litografía blanda estándar y es altamente reproducible31. También es compatible con la microscopía de alta resolución, lo que lo hace particularmente adecuado para imágenes en tiempo real y estudios cuantitativos de respuestas celulares a señales de rigidez a microescala. Este manuscrito presenta el protocolo de fabricación completo, detalla la estrategia de control de parámetros y demuestra la utilidad del sustrato con experimentos representativos de cultivo celular. En última instancia, este enfoque proporciona una herramienta in vitro robusta y accesible para explorar las respuestas celulares a un gradiente de rigidez a microescala.

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Protocolo

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Se aislaron células estromales primarias de médula ósea de ratón (mBMSC) de la tibia y el fémur de ratones (No. WP20230204, aprobado por el Comité de Ética del Centro de Experimentación Animal de la Universidad de Wuhan).

1. Domine la preparación del molde

NOTA: Nuestros protocolos son específicos para la fotorresistencia negativa basada en epoxi utilizada durante esta investigación.

  1. Coloque dos obleas de silicio limpias (50,8 ± 0,2 mm, <100> orientadas, 525 ± 25 μm) en la placa calefactora durante unos minutos para deshidratar.
  2. Tome una oblea de silicona de la placa calefactora y enfríela a temperatura ambiente antes de continuar con el recubrimiento giratorio. Aplique 3-5 ml de fotorresistente en el centro de la oblea.
  3. Para obtener una altura de característica de 20 μm, aplique el siguiente protocolo de espín: centrifugado durante 10 s a 7,1 × g, seguido de centrifugado a 410 × g durante 30 s. Para obtener una altura de característica de 30 μm, aplique el siguiente protocolo de espín: centrifugado durante 10 s a 7,1 × g, seguido de centrifugado a 170 × g durante 30 s. Use un bisturí con cuidado para eliminar cualquier cordón de borde que pueda formarse durante el recubrimiento de centrifugado.
  4. Hornee suavemente de la siguiente manera: coloque la placa calefactora a 95 °C, deje reposar la oblea en la placa caliente durante 13 min. Retire la oblea de la placa calefactora y déjela enfriar a temperatura ambiente de forma natural, evitando una caída repentina de temperatura.
  5. Alinee la fotomáscara en la oblea recubierta de fotorresistencia y exponga a la luz ultravioleta con una dosis total de 120 mJ/cm2.
  6. Hornee después de la exposición de la siguiente manera: con dos placas calefactoras (65 °C y 95 °C), deje reposar la oblea recubierta de fotorresistencia sobre la placa calefactora a 65 °C durante 1 min antes de transferirla a la placa calefactora a 95 °C y dejarla allí durante 5 min. Mueva la oblea sobre una pila de pañuelos de microfibra y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
  7. Desarrolle la oblea transfiriéndola a una placa de Petri llena de PGMEA y sumerja toda la oblea en el revelador. Acelerar el desarrollo mediante agitación manual.
    NOTA: El PGMEA es inflamable e irritante para los ojos y las vías respiratorias. Deséchelo como "desecho orgánico inflamable" en contenedores dedicados.
  8. Después del desarrollo, saque la oblea del revelador y lávela con isopropanol. Si se forma un flujo blanco lechoso en el isopropanol cerca de la superficie de la muestra (el desarrollo no está completo), vuelva a sumergir la muestra en el revelador nuevamente para completar el proceso de desarrollo. Lave la muestra revelada en isopropanol hasta que no se forme un flujo blanco lechoso cerca de la superficie de la muestra. Una vez que esté completamente desarrollado, hornee la fotorresistencia colocando la oblea en una placa calefactora a 150 ° C durante 15 min.
  9. Fluorar la oblea para los siguientes procesos de litografía blanda: exponer la oblea al plasma de oxígeno al vacío durante 30 s (100 W) para activar la superficie y luego colocarla en un desecador al vacío. Deje caer 30 μL de silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluoro-n-octilo) en un portaobjetos de vidrio colocado dentro del desecador al vacío. Evacue el desecador durante 2 min y mantenga la condición de vacío durante 30 min. Hornear la oblea a 90 °C durante 1 h para completar el proceso de silanización.
    NOTA: Controle estrictamente la humedad relativa ambiental por debajo del 60% durante todo el proceso. La humedad excesiva puede inducir una rápida hidrólisis del silano, lo que genera precipitados blancos de polisiloxano no volátil. Los precipitados perjudicarán la uniformidad de la distribución del vapor de silano, lo que resultará en una silanización fallida. Realice el tratamiento en una campana ya que el silano de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-tridecafluoro-n-octil) reacciona violentamente con el agua, liberando vapores tóxicos de HCl. Neutralizar con álcali diluido antes de desecharlo como residuo orgánico fluorado/clorado. El proceso de silanización logra una tasa de éxito del 90%.

2. Fabricación

NOTA: El proceso de litografía blanda utilizado para fabricar el sustrato de polidimetilsiloxano bicapa (PDMS) se puede dividir en dos pasos distintos: 1) La preparación tanto de la capa inferior estructurada como de la capa superior, 2) la unión de las dos capas de PDMS. El rendimiento total de fabricación es superior al 80%.

  1. Preparación del PDMS
    1. Para la capa inferior estructurada, prepare el precursor de PDMS mezclando el prepolímero y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso, seguido de la desgasificación al vacío. Vierta 1,5 ml del precursor de PDMS (10:1) en el molde maestro SU8, cubriendo toda la superficie, seguido de desgasificación al vacío y reposando durante 30 min. Trasladarlo con cuidado a un horno y curar a 90 °C durante 1 h. Desmoldar la capa inferior estructurada de PDMS del molde maestro.
    2. Para la capa superior, prepare el precursor de PDMS mezclando el prepolímero y el agente de curado en una proporción de 30:1 en peso y desgasificando al vacío. Vierta el precursor de PDMS en una oblea de silicio fluorado. Para obtener un espesor de 9 μm, aplique el siguiente protocolo de recubrimiento por centrifugación: centrifugado a 7,1 × g durante 10 s, seguido de centrifugado a 2.300 × g durante 60 s.
    3. Después del recubrimiento por centrifugación, inspeccione visualmente la película PDMS bajo la luz ambiental para verificar la uniformidad, examinando específicamente cualquier defecto visible, como rayas, burbujas o acumulación de bordes irregulares. Si la película parece uniformemente transparente con una reflectividad constante en toda la superficie de la oblea, continúe con el siguiente paso; Si no, repita el proceso de recubrimiento giratorio con una oblea nueva. Coloque la oblea recubierta sobre una superficie nivelada para garantizar un espesor homogéneo de la película PDMS. Trasladarlo con cuidado a un horno y curar a 90 °C durante 3 h.
      NOTA: Se obtuvieron películas con un espesor de 9,11 ± 0,34 μm.
  2. Vinculación
    1. Coloque la capa inferior de PDMS estructurada (10:1) con el lado estampado hacia abajo sobre la película de la capa superior de PDMS, asegurando un buen contacto entre las dos capas sin burbujas en la interfaz.
    2. Mueva el conjunto al horno y cure a 90 °C durante 3 h.
    3. Deje que el ensamblaje se enfríe a temperatura ambiente en una pila de pañuelos de microfibra. Separe la estructura final de doble capa de la oblea y guárdela en una placa de Petri para su uso posterior.
      NOTA: Si se forman burbujas entre la capa superior y la capa inferior durante el pelado, generalmente indica una adhesión incompleta entre las dos capas. Asegure una desgasificación completa del precursor de PDMS antes del recubrimiento giratorio y verifique que la superficie de la película esté libre de polvo o contaminantes antes de la aplicación de la capa inferior de PDMS para un contacto completo. Asegúrese de que la oblea de silicio esté nivelada durante el recubrimiento giratorio, el ensamblaje y el curado. El desgarro de la película puede ocurrir debido a la silanización desigual de la oblea o al espesor no uniforme del PDMS. Para resolver el problema, controle estrictamente la humedad ambiental durante la silanización por debajo del 60% de HR. El proceso de silanización logra una tasa de éxito del 90%.

3. Caracterización

  1. Microscopía electrónica de barrido (SEM)
    1. Cortar la muestra con una cuchilla afilada para obtener bordes limpios.
    2. Monte las muestras en etapas SEM de 90° y 0° utilizando cinta de carbono conductora para permitir la caracterización de la sección transversal y de la superficie, respectivamente.
    3. Cubra las muestras con oro durante 120 s para mejorar la calidad de las imágenes SEM y recopilar imágenes SEM de las muestras.
  2. Microscopía de fuerza atómica (AFM)
    NOTA: Seleccione la sonda ScanAsyst-Air para el mapeo nanomecánico cuantitativo del módulo.
    1. Coloque la punta en voladizo de AFM en el centro del campo de visión. Coloque el punto láser en el extremo del voladizo alineando el sistema de palanca óptica.
    2. Antes de las mediciones de mapeo nanomecánico cuantitativo de PeakForce (PeakForce QNM), calibre el voladizo de AFM para determinar los siguientes parámetros esenciales: Constante de resorte en voladizo: 0.40135 N / m; Sensibilidad a la deflexión: 28,993 nm/V (determinada mediante la realización de una curva de fuerza en una muestra de referencia rígida); Radio de la punta: ~21 nm (calibrado usando el método relativo contra una muestra de referencia con módulo conocido).
    3. En el panel Escanear de la lista de parámetros de escaneo, configure los siguientes ajustes de escaneo inicial: Establezca el tamaño de escaneo en 70 μm para muestras con franjas periódicas con un espaciado de 50 μm. Establezca el tamaño de escaneo en 50 μm para muestras con franjas periódicas con un espaciado de 20 μm. Establezca Muestras/Línea y Líneas en 256 (lo que da como resultado una imagen de 256 x 256 píxeles).
    4. Abra Configuración de activación en el microscopio y establezca el punto de ajuste de activación de fuerza máxima predeterminado del instrumento en Parámetros de activación.
    5. Haga clic en el icono Engage en la barra de herramientas del flujo de trabajo y continúe monitoreando las señales en tiempo real durante el enfoque automatizado.
    6. Asegúrese de que ScanAsyst Auto Control esté configurado en modo Individual. Ajuste el punto de ajuste de PeakForce a un valor apropiado para lograr el rango de deformación deseado: para la capa superior, el punto de ajuste de PeakForce es 0,020 nN; para la capa inferior estructurada, el punto de ajuste PeakForce es de 5 nN.
    7. Inicie el escaneo haciendo clic en los botones de arriba hacia abajo o de abajo hacia arriba .
    8. Monitoreo y corrección de la curva de fuerza: Si las curvas de fuerza aparecen distorsionadas o se observan problemas de sincronización (por ejemplo, formas irregulares, líneas de base inconsistentes), haga clic con el botón derecho en la ventana Monitor de fuerza y seleccione Configuración automática para corregir automáticamente la alineación y la sensibilidad de la curva de fuerza.
    9. Dentro de la configuración del canal de cálculo del módulo , seleccione el modelo DMT para ajustar la parte de retracción de la curva de fuerza para el cálculo del módulo elástico.
    10. Haga clic en el botón de captura para adquirir y guardar la topografía de alta resolución y el mapa de propiedades nanomecánicas.
    11. Realice análisis posteriores a la adquisición utilizando el software de procesamiento y análisis de imágenes AFM. Abra los archivos de datos AFM guardados y extraiga los valores de módulo seleccionando regiones en la superficie de la muestra; Calcule el módulo promedio, la desviación estándar y los perfiles de distribución tanto para la capa superior como para la capa inferior utilizando las herramientas de análisis estadístico integradas en el software. Exporte mapas de módulos procesados y datos cuantitativos.
    12. Número de escaneos de AFM por muestra: Realice tres escaneos independientes de área completa para cada muestra. Asegúrese de que cada escaneo cubra una región que coincida con el tamaño de la característica estructural de la muestra, 70 μm × 70 μm para muestras con franjas periódicas espaciadas de 50 μm y 50 μm × 50 μm para aquellas con franjas espaciadas de 20 μm. Para las mediciones de módulo de la estructura subyacente (PDMS 10:1) y la película de la capa superior (PDMS 30:1), implemente la siguiente estrategia de muestreo para garantizar la fiabilidad de los datos.
      1. Película de capa superior (PDMS 30:1): mida el módulo 2x de forma independiente y cada medición consta de dos escaneos no superpuestos de 5 μm × 5 μm.
      2. Estructura subyacente (PDMS 10:1): Dadas sus dos configuraciones de franjas periódicas distintas (espaciado de 20 μm y 50 μm), mida el módulo 2x de forma independiente para cada configuración.

4. Experimento de cultivo celular in vitro

NOTA: El PDMS es un material hidrófobo que debe recubrirse para promover la adhesión celular antes del cultivo celular, y se debe seleccionar el método de recubrimiento adecuado de acuerdo con el tipo de célula. Se debe obtener la aprobación ética si se utilizan células primarias para el experimento celular.

  1. Recubrimiento de poli-D-lisina (PDL)
    1. Esterilice el sustrato por inmersión en alcohol durante 10 min; luego lavar durante 3 x 5 min con PBS.
    2. Disuelva PDL (peso molecular de 150,000 a 300,000 Da) usando PBS a una concentración de 0.1 mg / ml. Para el sustrato del tamaño de placa de 24 pocillos, agregue 1 ml de solución de trabajo PDL y colóquelo en una incubadora a 37 ° C durante 4 h para cubrir completamente la superficie del sustrato.
    3. Una vez completado el recubrimiento, retire la solución de trabajo PDL y elimine cualquier PDL residual lavando 3 veces con PBS. Utilice el sustrato para experimentos celulares posteriores. Si el recubrimiento no se usa inmediatamente, séquelo y guárdelo a 4 °C.
      NOTA: Un recubrimiento exitoso presentó una superficie homogénea y sin rasgos distintivos bajo microscopía de contraste de fase, sin precipitados cristalinos visibles ni artefactos de secado. Se descartaron los sustratos con signos de cristalización o recubrimiento no uniforme.
  2. Aislamiento y cultivo de células estromales primarias de médula ósea de ratón (mBMSC)
    1. Aísle las células estromales primarias de la médula ósea del ratón (mBMSC) de la tibia y el fémur de ratones.
    2. Cultive las células en un medio de crecimiento que consiste en α-MEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de antibiótico-antimicótico y 1% de piruvato de sodio.
    3. Células semilla en el paso 3 sobre los sustratos obtenidos en el paso 4.1.3 a una densidad de 5.000 células/cm2 para minimizar los posibles efectos de confusión del contacto célula-célula.
  3. Tinción de inmunofluorescencia e imágenes
    1. Después de 16 h de cultivo (37 °C, 5% de CO2), fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 10 min a temperatura ambiente y lavar 3 veces con PBS. Luego, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,1% durante 15 min a temperatura ambiente y lave 3 veces con PBS.
    2. Para la visualización del citoesqueleto, tiña la F-actina con faloidina (dilución 1:500) durante 20 min a temperatura ambiente y lava 3 veces con abundante PBS para eliminar cualquier tinte residual.
    3. Monte el sustrato con tinción simultánea de núcleos celulares. Aplique una gota de glicerina con DAPI para cubrir las células. A continuación, coloque con cuidado un cubreobjetos sobre el sustrato y selle los márgenes con esmalte de uñas. Evite las burbujas tanto como sea posible.
    4. Adquiera imágenes de fluorescencia que capturen la morfología celular y el posicionamiento nuclear utilizando un microscopio de fluorescencia invertida.

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Resultados

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La fotolitografía se utilizó para fabricar moldes maestros de silicio reutilizables con microestructuras paralelas de cresta y ranura. Se crearon dos diseños, con un ancho de ranura (el ancho de la cresta es idéntico al ancho de la ranura) de 20 y 50 μm, respectivamente. Cada área estampada medía 7 mm × 7 mm. La precisión y la reutilización de los moldes de silicio simplificaron significativamente el proceso de fabricación repetida de sustratos. Luego, el molde maestro se usó para replicar las microestructuras en PDMS. S...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un enfoque novedoso para diseñar un sustrato bicapa basado en PDMS diseñado para introducir variaciones de rigidez localizadas mientras se mantiene una superficie topográficamente uniforme sin rasgos. Este enfoque permite la modulación mecánica únicamente a través de variaciones en la geometría de la subestructura, al tiempo que mantiene una química y topografía de superficie consistentes. En consecuencia, desacopla eficazmente la señal de rigidez de otras señales f...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado financieramente por los Fondos de Investigación Fundamental de las Universidades Centrales de China (No. 2042024YXB018 a W. Ji).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
  4% de paraformaldehídoTecnología ServicebioG1101
AcetonaShanghai Aladdin10000418
Anti-AntiGibco15240-062Antimicoótico antibiótico
Medio de montaje antifade con DAPIBeyotime BiotecnologíaP0131glicerina con DAPI 
Placa de cultivo celularNIDO70200124 pozos
DesecadorSichuan Shubo (Group) Co., Ltd913354-30SNDiámetro interior=180mm
Suero fetal bovinoHyCloneSV30208.02
Microscopio de fluorescencia invertidaOlimpoDP74
IsopropanolShanghai Aladdin80109218GC≥ 99.7%
Alineador de máscaraSichuan Nanguang Vacuum Technology Co., LtdH94-37
Modificación de MEM AlphaHyCloneSH30265.01
Análisis de nanoscopíaBrukerVersión 3.0Software de procesamiento y análisis de imágenes AFM.
Sistema de Imagen de Alto Contenido Opera Phenix PlusPerkin Elmer2400L23248 Equipado con un objetivo aéreo de 10 veces
PGMEASuzhou NanoMicro Technology Co., Ltd171011-1Revelador Fotorresist Negativo; ESPECIALIZACIÓN: UL; Porcentaje:min99,7%
FaloidinaUelandy YP0052L594-Faloidina
Solución salina tamponada con fosfatoHyCloneSH30256.01
Limpiador de plasmaTecnología de plasma (Alemania)Flecto 10 
Poli-D-lisinaBeyotime BiotecnologíaST508Número CAS 27964-99-4
Microscopio de sonda de barridoBrukerIcono de dimensiónUtiliza software de control de nanoscopos, incluyendo los espacios de trabajo experimentales PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) y Point-and-Shoot Ramping.
Punta de silicio en la palanca de nitruroBrukerSCANASYST-AIRLa sonda cuenta con un solo voladizo en forma de V recubierto de reflex de Al; k = 0,4 N/m (nominal), f0 = 70 kHz.
Obleas de silicioShenzhen Rigorous Technology Co., Ltd-50,8 y más; 0,3 mm de diámetro, (100) orientado, 525 y más de 525 mm; 25 & mu; Grosor m
Piruvato de sodioGibco11360-070
Bobinador de hiladoInstituto de Microelectrónica de la Academia China de CienciasKW-4A
SU-8 3025Suzhou NanoMicro Technology Co., Ltd-Fotorresist negativo; 72,3% sólidos; Viscosidad 4400; Densidad 1,143g/ml
Kit de elastómeros de silicona SYLGARD 184La Compañía Dow Chemical01673921
Tricloro(1H,1H,2H,2H-tridecafluoro-n-octil)silanoShanghai Aladdin78560-45-9
Triton X-100BioFroxx1139ML1000,1% Triton X-100 para permeabilización
Tripsina-EDTAGibco25200-0720,25% Tripsina-EDTA (1x)
Horno de vacíoMemmert (Alemania) y nbsp;VO 200 

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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