Artículo de método

Imágenes de células vivas de la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis.

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 de noviembre de 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método de imágenes de células vivas para monitorear la permeabilización de la membrana lisosomal durante la necroptosis, utilizando sondas fluorescentes que detectan cambios en la integridad y acidificación de la membrana lisosomal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La necroptosis, una forma de necrosis regulada, culmina en la ruptura de la membrana celular. Nuestro laboratorio y otros han descubierto que la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP) es un evento temprano y crucial en este proceso, que precede a la ruptura de la membrana. La LMP rápida libera potentes enzimas lisosomales, particularmente proteasas, en el citosol, promoviendo activamente la muerte celular. Las imágenes de células vivas proporcionan una herramienta invaluable para detectar LMP durante la necroptosis en tiempo real. Varios tintes fluorescentes son altamente efectivos: (1) los tintes LysoTracker sensibles al pH rastrean los cambios en el pH lisosomal. Una disminución en la señal de fluorescencia indica una pérdida del gradiente de pH lisosomal, un signo primario de disfunción lisosomal, que puede ser un precursor o consecuencia directa de la FUM. (2) Las perlas de dextrano marcadas con fluoresceína se internalizan y se acumulan en los lisosomas. Su liberación en el citosol señala una fuga completa de LMP y carga. Aquí, observamos una pérdida progresiva de fluorescencia de Lysotracker, con difusión de fluorescencia de dextrano en el citosol después de la inducción de necroptosis. Por lo tanto, la metodología de imágenes de células vivas permite a los investigadores rastrear con precisión el momento y el alcance de la disfunción lisosomal, lo que contribuye a una comprensión más completa de los mecanismos de necroptosis y arroja luz sobre posibles intervenciones terapéuticas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La necroptosis, es una forma de muerte celular regulada independiente de las caspasas implicada en muchas enfermedades inflamatorias, trastornos neurodegenerativos, enfermedades pulmonares, hepáticas y cardíacas 1,2,3. Esta vía está mediada por una compleja cascada de reacciones que culminan en la activación de la proteína quinasa 1 que interactúa con el receptor (RIPK1), que interactúa con la proteína quinasa 3 que interactúa con el receptor (RIPK3) a través de sus dominios homotípicos de motivo de interacción RIP (RHIM) 4,5,6. RIPK3, a su vez, recluta proteínas similares a quinasas de linaje mixto (MLKL) para formar el necrosoma 7,8. La fosforilación de MLKL por RIPK3 conduce a su oligomerización y posterior polimerización. Los polímeros MLKL luego se translocan a las membranas celulares, lo que eventualmente conduce a la ruptura de la membrana celular y la muerte celular 9,10,11. Sin embargo, los mecanismos por los cuales los polímeros MLKL se translocan a los compartimentos de la membrana e inducen la ruptura de la membrana no se comprenden completamente.

Los lisosomas son orgánulos responsables de la degradación y el reciclaje de los materiales celulares. En su lumen, hay proteasas, lipasas, nucleasas e hidrolasas que son responsables de digerir las macromoléculas, manteniendo así la homeostasis celular12,13. Por lo tanto, el mantenimiento de la integridad lisosomal y la función adecuada es esencial para garantizar una eliminación celular efectiva, adaptaciones al estrés y supervivencia celular general 14,15,16. Estudios recientes indican una asociación entre la necroptosis y la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP)17,18,19.

Nuestras observaciones recientes han demostrado que la LMP es un evento temprano y significativo en el proceso de necroptosis, que precede a la ruptura final de la membrana celular19. Específicamente, la polimerización de MLKL en la membrana lisosomal induce LMP rápida para liberar potentes enzimas lisosomales, particularmente proteasas, incluida la catepsina B, en el citosol. Estas proteasas luego escinden proteínas vitales para promover la muerte celular. Es importante destacar que la inhibición de la actividad de CTSB protege fuertemente contra la muerte celular19,20. Estos datos sugieren que LMP es un modulador crucial de la vía de necroptosis. Por lo tanto, monitorear el momento de LMP durante la necroptosis es esencial para comprender los mecanismos moleculares e identificar posibles objetivos terapéuticos.

Muchos métodos convencionales de detección de LMP, como la inmunotinción, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o la citometría de flujo, requieren muestras fijas o proporcionan solo información de punto final 21,22,23, sin capturar el proceso dinámico de la disrupción lisosomal, particularmente en el contexto de una rápida progresión de la necroptosis. Por el contrario, el método de imágenes de células vivas permite la visualización en tiempo real de alta resolución de LMP durante la necroptosis. En este protocolo, combinamos dos marcadores lisosomales complementarios e inducimos necroptosis en células HT-29 para analizar la integridad de la membrana lisosomal en tiempo real19. Esta técnica proporciona una plataforma robusta y adaptable para estudiar la LMP no solo en la necroptosis sino también potencialmente en otras formas de estrés celular donde la integridad lisosomal está comprometida, particularmente en el contexto de enfermedades o el uso de terapias dirigidas a los lisosomas 24,25,26.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cultivo celular - día 0

  1. Coloque 5,000 células en 2 ml de DMEM (medio de águila modificado de Dulbecco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina y estreptomicina (P / S) en un plato estéril con fondo de vidrio.
  2. Incubar las células a 37 °C con un 5% deCO2 durante la noche.

2. Carga de perlas de dextrano - día 1

  1. Diluya las perlas verdes de dextrano a 25 μg/ml en DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S añadiendo 20 μl de la solución madre de 2,5 mg/ml.
  2. Retire el medio viejo y reemplácelo con 2 ml de DMEM que contiene perlas suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S.
  3. Incubar la célula durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2 para permitir la internalización de las perlas en lisosomas.

3. Tinción con Lysotracker - día 2 (día del experimento)

  1. Prepare el medio de tinción añadiendo 2 μL de solución madre de Lysotracker de 1 mM a 2 mL de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S para obtener una concentración final de 1 μM. Sustituya el medio antiguo por esta solución de tinción.
  2. Incubar a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 h, siguiendo el tiempo de incubación recomendado (30 min a 2 h) previsto en las Directrices de Uso de Sondas Moleculares de Life Technologies27. En nuestros experimentos, 2 h de incubación en células HT-29 dieron como resultado una tinción robusta de puncta con una fuerte colocalización con perlas de dextrano, lo que indica una fluorescencia estable del colorante.
    NOTA: Encienda el microscopio confocal 30 minutos antes de la obtención de imágenes de células vivas.

4. Configuración del microscopio confocal

  1. Encienda los componentes del sistema confocal en el siguiente orden: microscopio de PC; potencia del escáner; potencia láser; emisión láser; Potencia Leica.
  2. Encienda los controles ambientales: El cubo - controlador de temperatura; El controlador mezclador de gas Brick - CO2 . Abra el suministro deCO2 y O2 .
  3. Establecer parámetros de gas:
    1. Ajuste el controlador de temperatura (el cubo) a 37 °C.
    2. Ajuste el controlador de gas y humedad (el ladrillo) al 5% de CO2 y al 95% de humedad.
  4. Ensamble la cámara de imágenes como se muestra en la Figura 1.
  5. Configure el objetivo confocal:
    1. Utilice un objetivo de inmersión en aceite de 63x/1,40 NA.
    2. Ajuste los láseres de excitación a 488 nm (fluoróforo verde) y 555 nm (fluoróforo rojo).
    3. Para el láser de 488 nm, seleccione un detector híbrido (HyD) y para el láser de 555 nm, seleccione un detector PMT.
      NOTA: La diafonía de fluorescencia se minimizó mediante el uso de puertas predefinidas en el software confocal, lo que confirmó que no había interferencias entre los canales.

5. Preparación posterior a la tinción (después de la incubación de LysoTracker)

  1. Lave las células cuidadosamente tres veces con 2 ml de PBS.
  2. Agregue 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S.
  3. Aplique una gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo antes de la imagen.
  4. Monte el plato en la platina del microscopio.
  5. Ajuste la intensidad y el fondo del láser.
    1. Ajuste la intensidad del láser hasta un 3%, pero no más del 5%.
    2. Ajuste la ganancia del detector en el software del microscopio para optimizar la señal.
    3. Para minimizar el fondo, ajuste la barra de contraste.
  6. Adquiera imágenes de referencia de células no tratadas (antes de la adición de T / S / Z), que sirven como condición de control.
  7. Regrese la placa a la campana de flujo laminar y agregue 1 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S, que contenga 100 ng/ml de TNF-α (T), 500 nM de mimético SMAC (S) y 100 μM de Z-VAD-FMK (Z).
  8. Continúe las imágenes en el microscopio confocal.
    NOTA: T/S/Z se agregaron intencionalmente a concentraciones más altas que los protocolos estándar. Esta elección se tomó para acelerar la LMP y la muerte celular, lo que permite capturar los primeros eventos de manera más confiable en imágenes en tiempo real.

6. Configuración de adquisición de imágenes

  1. En el software de adquisición, configure los parámetros de la siguiente manera: modo: xyt; formato: 512 x 512; velocidad: 400; zoom: 3; Promedio de línea: 1; acumulación de líneas: 3; acumulación de marcos: 1; intervalo de tiempo: 3 min; duración: 8 h; Habilite el enfoque automático.
  2. Haga clic en Iniciar para comenzar la adquisición de lapso de tiempo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los procedimientos descritos en este protocolo permiten la adquisición de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal para monitorizar la LMP en tiempo real. La Figura 1 ilustra una representación esquemática del protocolo experimental, desde la siembra celular hasta la adquisición de imágenes. En el día 0, se sembraron 5.000 células HT-29 y se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5% de CO2. Después de 24 h (día 1), las células se incubaron con perlas de dextrano marcadas con fluoresceína (25 μg / mL) durante 24 h adicionales en las mismas condiciones. Estas perlas se internalizan por endocitosis y se trafican a los lisosomas, donde se acumulan y aparecen como puntos brillantes. El día 2 (día del experimento), las células se trataron con colorante LysoTracker sensible al pH (1 μM) durante 2 h a 37 °C y 5% de CO2. LysoTracker concentra y exhibe una fuerte fluorescencia dentro de compartimentos ácidos, como endosomas tardíos y lisosomas. Treinta minutos antes de la obtención de imágenes, el sistema de microscopio confocal se encendió y estabilizó, incluidos los controladores de temperatura, gas y humedad, como se describe en el paso 4 del protocolo. Se ensambló la cámara de imágenes, como se muestra en la Figura 2. Se utilizaron los láseres de 488 nm (verde) y 555 nm (rojo).

Después de la incubación con LysoTracker, las células se lavaron cuidadosamente tres veces con PBS y se agregaron 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S. La placa se transfirió al microscopio y se aplicó una gota de aceite de inmersión en el objetivo de inmersión en aceite 63x/1.40 NA. La intensidad del láser y los niveles de fondo se ajustaron para optimizar las condiciones de imagen, como se describe en el paso 5.5. del protocolo. Nuestras imágenes iniciales confirmaron la presencia de puntos estables del Lysotracker y dextrano marcado con fluoresceína, lo que indica lisosomas intactos (Figura 3). Las imágenes de referencia se adquirieron antes de T/S/Z y se utilizaron como control. No se aplicó ningún vehículo.

Después de establecer la configuración inicial de imágenes y microscopía, la placa se devolvió a la campana de flujo laminar y se agregó 1 ml de DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de P / S, que contenía 100 ng / ml de TNF-α (T), 500 nM mimético SMAC (S) y 100 μM Z-VAD-FMK (Z). Las imágenes continuaron en el microscopio confocal utilizando el parámetro de adquisición de imágenes descrito en el paso 6 del protocolo. Como se muestra en la Figura 3, película complementaria S1 y película complementaria S2, la disminución progresiva de la fluorescencia de LysoTracker en células tratadas con T / S / Z sirvió como un indicador temprano del cambio lisosomal. Esta pérdida fue seguida por la salida de dextrano marcado con fluoresceína de los lisosomas al citosol (desplazamiento de punteado a difuso), lo que indica FUM. A las 8 h, casi toda la señal de Lysotracker desapareció, sin embargo, muchas células aún conservaban puntos verdes con señal verde citosólica, lo que sugiere que la pérdida del gradiente de pH lisosomal precede a la liberación completa de LMP y carga.

Figura 1
Figura 1: Representación esquemática del protocolo experimental. (Creado en BioRender.com) Inicialmente, se sembraron 5.000 células (0 h) y se incubaron durante 24 h; después de eso, se agregaron perlas de dextrano (25 μg / ml) y se incubaron durante 24 h adicionales. A las 48 h, se agregó LysoTracker (1 μM) y se incubó durante 2 h. Las células se lavaron tres veces con PBS (paso 1), seguido de la adición de 2 ml de DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de P/S (paso 2). Se ajustaron los ajustes de microscopía (paso 3) y las células se trataron con TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMZ (Z) (paso 4), antes de la adquisición de imágenes de células vivas (paso 5). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Diagrama de la configuración de la cámara de imágenes. (A) El portamuestras, (B) la cámara de incubación de gas y (C) la tapa superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Imágenes representativas de las células HT29 antes y después del tratamiento T/S/Z. Las células se tiñeron con perlas rojas de Lysotracker y verde de dextrano y se trataron con TNF-α (T), mimético de SMAC (S) e inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMZ (Z). Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película complementaria S1: Lapso de tiempo de células HT29 incubadas con perlas verdes de dextrano y tratadas con T / S / Z. Las células fueron monitoreadas durante más de 6 h para evaluar la respuesta celular. Haga clic aquí para descargar esta película.

Película complementaria S2: Lapso de tiempo de células HT29 incubadas con rojo LysoTracker y tratadas con T / S / Z. Las células fueron monitoreadas durante más de 6 h para evaluar la respuesta celular. Haga clic aquí para descargar esta película.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demostró que la combinación de LysoTracker y las perlas de dextrano marcadas con fluoresceína permite el monitoreo simultáneo del pH lisosomal y la liberación de carga en tiempo real. Los resultados representativos (Figura 3, Película complementaria S1 y Película complementaria S2) confirman que las células no tratadas mantienen una señal de puntuación estable para ambos marcadores. Por el contrario, el tratamiento T/S/Z indica una pérdida progresiva de la intensidad de Lysotracker y un cambio de dextrano de la distribución citosólica puntual a la difusa, consistente con la FUM.

Un primer paso crítico en este protocolo es seleccionar las celdas para la adquisición de imágenes. Nuestros datos anteriores demuestran que el tratamiento T/S/Z causa la muerte de aproximadamente el 80% de las células HT-29 en 24 h, y el 20% restante sobrevivea 19. Dado que LMP no está presente al comienzo del experimento, las células se seleccionan inicialmente en función de la morfología y su señal positiva dual para las perlas de LysoTracker y Dextrano. Aunque este método no puede predecir qué células específicas se someterán a FUM, observamos consistentemente que aproximadamente el 60% de la población monitoreada finalmente exhibe FUM durante el período de imágenes de 8 h. Otro desafío se deriva de la naturaleza inherente de las imágenes secuenciales. Una ligera deriva en la posición Z de la célula, que ocurre durante la adquisición de imágenes cada 3 minutos, impide el seguimiento continuo de la misma señal puntual durante todo el experimento. Además, las células migran y sufren cambios morfológicos en respuesta al tratamiento T/S/Z28. En consecuencia, es imposible seguir la dinámica de los lisosomas individuales durante todo el período de imagen. En las imágenes de células vivas a largo plazo, la contribución potencial de la fototoxicidad como mediador de la muerte celular es una consideración importante. La excitación continua durante sesiones prolongadas puede generar especies reactivas de oxígeno y afectar la viabilidad celular29, interfiriendo potencialmente con la respuesta necroptósica genuina. Para minimizar este efecto, aplicamos baja potencia láser y tiempos de exposición cortos. Además, se administró una concentración cinco veces mayor de T/S/Z para acelerar el proceso de muerte celular. Sin embargo, no podemos excluir por completo la contribución del estrés inducido por la luz a los cambios lisosomales observados.

Una ventaja importante de este protocolo de imágenes de células vivas es su capacidad para monitorear el cambio de pH lisosomal y LMP en tiempo real, capturando eventos dinámicos que se pasan por alto en los análisis de puntos finales, como TEM, citometría de flujo e inmunotinción. Si bien TEM ofrece información estructural de alta resolución, no puede capturar la progresión temporal de LMP. Los métodos alternativos de células vivas, como los ensayos de reubicación de naranja de acridina30 o la formación de galectina-puncta31, también son herramientas valiosas para monitorear la integridad lisosomal, pero cada uno tiene limitaciones cuando se usa de forma aislada. El ensayo de naranja de acridina informa la redistribución del colorante de los orgánulos ácidos al citosol, que está influenciado tanto por los cambios de pH lisosomal como por la permeabilización de la membrana y, por lo tanto, no se correlaciona directamente con la liberación de carga. De manera similar, la formación de galectina-puncta refleja la exposición de glicanos luminales al citosol y, por lo tanto, marca el daño de la membrana lisosomal31,32, pero no discrimina entre permeabilización parcial y ruptura lisosomal completa.

La fortaleza central de este protocolo radica en la combinación de LysoTracker y perlas de dextrano, lo que permite la investigación simultánea de la acidificación lisosomal y la fuga de carga. Esto proporciona una lectura dual única tanto de la funcionalidad lisosomal como de la integridad estructural. El desvanecimiento de LysoTracker actúa como un indicador de un cambio en el pH lisosomal, mientras que la liberación de dextrano informa directamente de la fuga física del contenido lisosomal. Al usar estos dos marcadores juntos, mejoramos significativamente la detección de LMP parcial y completa. Por lo tanto, esta estrategia de imágenes de células vivas es ampliamente aplicable. Los investigadores pueden adaptarlo para su uso con otros tipos de células y diferentes sondas fluorescentes para estudiar la integridad lisosomal en diversas condiciones experimentales, incluidas perturbaciones farmacológicas o genéticas. Esta capacidad es clave para avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos de necroptosis e identificar posibles intervenciones terapéuticas.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La investigación en el laboratorio del Dr. Zhigao Wang cuenta con el apoyo de subvenciones de los NIH R35GM158455 y R01GM147474.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Celdas HT-29ATCCHTB-38Células del cáncer de colon
Plato de fondo de cristal de 35 mmCorporación MatTekP35G-1.5-14-C-GRD
Incubadora de CO2PHCBIMCO-170AICUVL
Microscopio ConfocalLeicaSP8WLL
Cuentas verdes DextranThermoFisherD1820Dextran, fluoresceína, 10.000 MW, aniónica, lisina fijable
Eagle Medium Modificado (DMEM) de DulbeccoCorning 10-013-CV
Suero fetal bovino (FBS)Cytiva SH30910.03
LysoTracker Rojo DND-99InvitrogenL7528
Tipo HF de inmersión en aceiteCiencias de la Microscopía Electrónica16915-01
Penicilina y estreptomicina (P/S) Sigma-AldrichP4333
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Smac mimético (S)BV6, ApexBio, CatálogoB4653Concentración final, 1 mM
El Ladrillo y la Piedra;Servicios de imagen de la vida13685Controlador de CO2 del mezclador de gases
El CuboServicios de imagen de la vidaCBO2AMicroscopios de cámara de control de temperatura
Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-&alfa; - T)Peprotech30001A100UGConcentración final, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Concentración final, 20 mM

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Necroptosis MechanismsLysosomal DysfunctionFluorescent ProbesLysoTracker DyesDextran BeadsConfocal MicroscopyTime Lapse ImagingCell Death Induction

Artículos relacionados