Aislamiento primario, cultivo y verificación fenotípica de condrocitos articulares de rodilla de rata

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de condrocitos articulares primarios de rodilla de rata mediante digestión enzimática secuencial. El método produce condrocitos con características fenotípicas validadas, lo que proporciona a los investigadores un enfoque confiable para aplicaciones de investigación de cartílago.

Resumen

El daño del cartílago resultante de un traumatismo, envejecimiento o afecciones inflamatorias sigue siendo un desafío clínico importante debido a la capacidad regenerativa inherentemente limitada del tejido. Los condrocitos, al ser el único componente celular del cartílago, son responsables de mantener la estructura y función de la matriz extracelular, lo que los hace esenciales para comprender la fisiología, patología y regeneración del cartílago. El presente estudio presenta un protocolo completo y estandarizado para el aislamiento, cultivo y verificación fenotípica de los condrocitos articulares primarios de rata de la articulación de la rodilla. El procedimiento utiliza ratas jóvenes lactantes para garantizar la máxima viabilidad celular y emplea digestión enzimática secuencial con tripsina y colagenasa tipo II para una extracción celular eficiente. El fenotipo de los condrocitos se verifica mediante inmunofluorescencia de colágeno tipo II, análisis de citometría de flujo y ensayos de estimulación de interleucina (IL)-1β para confirmar la identidad celular y la respuesta inflamatoria. Este flujo de trabajo optimizado y reproducible permite la generación de cultivos de condrocitos de alta pureza adecuados para el cribado de fármacos, las investigaciones mecanicistas y las aplicaciones de ingeniería de tejidos, lo que permite avanzar en la investigación de la biología del cartílago.

Introducción

El cartílago es un tipo especializado de tejido conectivo que realiza múltiples funciones cruciales, incluyendo proporcionar soporte, amortiguación y absorción de impactos¹. Desempeña un papel vital en el mantenimiento de la estabilidad estructural y en la garantía de la movilidad dentro del sistema esquelético ^2,3. Las lesiones mecánicas, los cambios degenerativos, la inflamación o las anomalías metabólicas pueden causar daño al cartílago ^4,5,6. Debido a su in....

Protocolo

El uso de sujetos animales en este estudio fue aprobado por el comité de ética de cuidado y bienestar animal experimental del Hospital de la Amistad China-Japón (No. zryhyy21-21-05-16). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Animales de experimentación y trabajos preparatorios

NOTA: El cartílago de las articulaciones de ratas, conejos y humanos después de una artroplastia total de rodilla se puede usar para el aislamiento de condrocitos. Sin embargo, debido a su mayor viabilidad, en este estudio se utilizaron ....

Resultados

La tinción de inmunofluorescencia para el colágeno tipo II demostró que los condrocitos aislados eran fuertemente positivos (Figura 1A). El análisis de citometría de flujo demostró además que más del 98% de las células eran positivas para el colágeno tipo II (Figura 1B), mientras que las células SW1353 de control negativo eran negativas (Figura 1C). Tras la estimulación con 10 ng/ml de IL-1β durante 24 h, el Western blot demostró un.......

Discusión

El protocolo descrito aquí ofrece varias ventajas clave para el aislamiento y cultivo de condrocitos articulares primarios de rata. El uso de ratas lactantes es fundamental para lograr un rendimiento celular y una viabilidad óptimos, ya que el cartílago de animales jóvenes contiene más condrocitos proliferativos y menos matriz mineralizada en comparación con el cartílago adulto. Esta selección de edad mejora significativamente la eficiencia de la digestión enzimática y la posterior recup.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4% de paraformaldehído	Solarbio	P1110
5 y veces; Búfer de carga	Solarbio	P1040
Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbit IgG	Zhongshan Jingqiao Biotecnología	ZF-0511
Solución de bloqueo libre de animales	Tecnología de señalización celular	15019
Anticuerpo anticolágeno II	Abcam	ab34712
Kit de ensayo de proteínas de ácido bicinquinínico (BCA)	Solarbio	PC0020
Colagenasa II	Yeasen Biotechnology	40508ES60
Medio de montaje fluorescente que contiene DAPI	Zhongshan Jingqiao Biotecnología	ZLI-9556
Eagle Medium Modificado de Dulbecco	Solarbio	11995
Suero fetal bovino (FBS)	Solarbio	S9010
Peroxidasa de rábano picante (HRP) - Anti-Conejo IgG conjugado de cabra	Zhongshan Jingqiao Biotecnología	ZB-2301
IL-1 y beta;	Peprotech	400-01B
MMP13 Rabbit mAb	ABclonal	A11148
MMP3 Rabbit mAb	ABclonal	A11418
Leche seca desnatada	Solarbio	D3840
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Solarbio	P1020
Membrana PVDF	Thermo Fisher Scientific	88518
Rat MMP-13 ELISA Kit	Nouvs	NBP3-06931
Rat MMP-3 ELISA Kit	Nouvs	NBP3-06894
Kit de transcripción inversa	Promega	A3500
Búfer de Lisis RIPA	Solarbio	R0010
Agua libre de RNasa	Solarbio	R1600
SDS-PAGE Gel	Epizima	PG112
SYBR Mezcla Master en tiempo real para PCR	Toyobo	QPK-201
Triton X-100	Solarbio	T8200
TRIzol	Solarbio	15596026
Tripsina	Solarbio	T1320
Kit de sustrato quimioluminiscencia ECL ultrasensible	NCM Biotecnología	P10300
β-Conejo actina mAb	ABclonal	AC026