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Artículo de método

Enfoques experimentales para el análisis bioquímico de la proteína ácida fibrilar glial y sus variantes asociadas a enfermedades

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DOI:

10.3791/69523

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28 de noviembre de 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

En este artículo

Resumen

Este estudio describe métodos experimentales para caracterizar bioquímicamente el GFAP y sus mutaciones causantes de enfermedades, centrándose en el ensamblaje, agregación y modificación postraduccional de filamentos. Se analizaron proteínas GFAP de alta pureza, lo que reveló conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad de Alexander que podrían proporcionar un marco para estudiar posibles objetivos terapéuticos y comprender las mutaciones y trastornos relacionados con GFAP.

Resumen

La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) es una proteína clave del filamento intermedio fundamental para mantener la integridad estructural y la función de los astrocitos en el sistema nervioso central. Las mutaciones en GFAP son la causa raíz de la enfermedad de Alexander (AxD), un trastorno neurodegenerativo raro y a menudo fatal caracterizado por la elevación de los niveles de GFAP y la acumulación de GFAP en forma de fibras de Rosenthal. Aquí, esbozamos un conjunto completo de enfoques experimentales para la caracterización bioquímica del GFAP y sus variantes causantes de enfermedades. Utilizando técnicas de expresión optimizada y purificación avanzada, logramos altos rendimientos y pureza tanto de proteínas GFAP salvajes como mutantes. Se emplearon ensayos bioquímicos para evaluar los efectos de mutaciones patógenas sobre el ensamblaje, solubilidad y agregación de filamentos. Además, exploramos el papel de las modificaciones postraduccionales aberrantes en la agregación GFAP y su impacto en las propiedades del filamento. Este trabajo avanza nuestra comprensión del papel de GFAP en AxD y sienta las bases para desarrollar estrategias terapéuticas que aborden la disfunción GFAP. Además, las metodologías aquí presentadas sirven como herramientas valiosas para investigar las consecuencias bioquímicas de las mutaciones GFAP y avanzar en intervenciones para trastornos relacionados con GFAP.

Introducción

La enfermedad de Alexander (AxD) es un trastorno genético resultante de mutaciones dominantes en el gen que codifica la proteína ácida fibrilar glial (GFAP)1, una proteína de filamento intermedio (FI) tipo III que se encuentra predominantemente en astrocitos maduros. AxD se caracteriza por la regulación al alzade GFAP 2, astrogliosisreactiva 3 y la acumulación de fibras de Rosenthal, que son inclusiones proteicas compuestas principalmente de GFAP junto con proteínas asociadas como αB-cristalina4 y ubiquitina5. Las mutaciones en el gen GFAP alteran el ensamblaje normal delfilamento 6, lo que conduce a una agregación anormal, inducción de respuestas al estréscelular 7 y una mayor desestabilización mediante modificaciones postraduccionales aberrantes (PTMs) como fosforilación8,oxidación 9 yubiquitinación 10.

A pesar del papel central del GFAP en la patología del AxD, los mecanismos moleculares por los cuales el GFAP mutante interrumpe el ensamblaje de filamentos, promueve la agregación e induce estrés celular siguen siendo poco comprendidos. Esta brecha de conocimiento dificulta el desarrollo de terapias dirigidas para abordar la agregación y toxicidad de GFAP. Estudiar las propiedades bioquímicas del GFAP y sus variantes asociadas al AxD es fundamental para descubrir los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la enfermedad. Sin embargo, la propiedad propensa a la agregación del GFAP y su comportamiento alterado de ensamblaje en variantes asociadas a enfermedades presentan desafíos únicos para el análisis experimental. Los estudios bioquímicos controlados requieren GFAP purificado, obtenido ya sea de modelos animales o mediante expresión recombinante, para investigar los efectos de las mutaciones de AxD sobre el ensamblaje, agregación y modificaciones patológicas de filamentos.

Los enfoques experimentales presentados en este estudio ofrecen varias ventajas frente a técnicas alternativas. Por ejemplo, aunque los modelos basados en células11 y los estudios inmunohistoquímicos12 proporcionan valiosas ideas sobre la expresión y localización de GFAP, a menudo no logran captar los mecanismos bioquímicos precisos de ensamblaje y agregación de filamentos debido a la complejidad de los entornos celulares. En contraste, los métodos aquí descritos, como los ensayos de ensamblaje de filamentos in vitro , análisis de sedimentación y caracterización de PTM, permiten una investigación controlada de las propiedades bioquímicas intrínsecas del GFAP y sus variantes asociadas a enfermedades. Estos enfoques permiten a los investigadores diseccionar el comportamiento de ensamblaje y agregación de filamentos en un sistema simplificado, facilitando la identificación de mecanismos moleculares subyacentes a la disfunción del GFAP. Estudios previos han demostrado la utilidad de estas técnicas bioquímicas para analizar proteínas de FI, incluyendo desmina13 yqueratinas 14, subrayando su aplicabilidad a la investigación GFAP.

Además, este manuscrito proporciona información para ayudar a los lectores a determinar si los métodos descritos son apropiados para sus aplicaciones específicas. Los investigadores interesados en estudiar las propiedades bioquímicas del GFAP, su comportamiento de ensamblaje, o PTMs, encontrarán estas técnicas especialmente útiles para investigar variantes asociadas a enfermedades y sus efectos patológicos. Integrando estos enfoques bioquímicos con otros sistemas experimentales, como estudios basados en células o modelos animales, los investigadores pueden lograr una comprensión más completa de la disfunción GFAP en la astrocitopatía AxD y otras relacionadas.

El objetivo general de este método es presentar enfoques experimentales para el análisis bioquímico de GFAP y sus variantes asociadas a AxD, incluyendo técnicas de purificación de proteínas, ensayos de ensamblaje in vitro de filamentos, análisis de sedimentación y caracterización de PTM. Estos métodos proporcionan conocimientos fundamentales sobre la base molecular de la disfunción GFAP en AxD, allanando el camino para el desarrollo terapéutico. Además, la aplicación de estas técnicas experimentales avanzará en nuestra comprensión de la bioquímica GFAP en AxD y contribuirá al campo más amplio de la investigación en FI.

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Protocolo

Los animales utilizados en este estudio son ratas modelo AxD con la mutación de knock-in R237H11. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal de la Facultad de Ciencias de la Vida y Medicina de la Universidad Nacional Tsing Hua (Aprobación NTHU IACUC nº 109088 y 111060) y de acuerdo con las directrices de la Guía Agrícola para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Purificación de GFAP recombinante a partir de bacterias (Figura 1)

  1. Transformar la cepa pLysS BL21(DE3) de E. coli por el vector pET 23b que contiene ADNc de GFAP WT o mutante.
  2. Cultivar bacterias en 1 L de medio Luria-Bertani suplementado con 100 μg/mL de ampicilina y 34 μg/mL de cloroanfenicol a 37 °C hasta OD600 de ~0,2.
  3. Añadir isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, 0,5 M) a una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión de GFAP a 37 °C durante 4 horas.
  4. Cosechar bacterias mediante centrifugación a 6.371x g durante 30 minutos a 4 °C.
  5. Lysis bacteriana en 50 mL de tampón TEN (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) suplementada con 0,2 mM de fluoruro de phnenilmetanosulfonil (PMSF) mediante homogeneización en un homogeneizador Dounce.
  6. Centrífuga lisa bacteriana a 22.045 xg durante 20 minutos a 4 °C, y luego extrae el pellet en el tampón Triton X-100 (DIEZ con 1% (v/v) Triton X-100).
  7. Tras la centrifugación en las mismas condiciones, extrae el pellet resultante en el tampón de alta sal (TEN con 1% (v/v) Triton X-100 y 1,5 M KCl).
  8. Después de la centrifugación en las mismas condiciones, lava el pellet con buffer TEN.
  9. Disuelva el último pellet en 10 mL de tampón de urea (8 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA y 0,2 mM PMSF) removiendo durante 3 horas a temperatura ambiente.
  10. Extractos de urea en centrifugadora a 80.000x g en una ultracentrífuga de mesa a 4 °C durante 20 minutos.
  11. Añadir polietilenemina (1% (v/v)) a la fracción soluble en urea hasta una concentración final del 0,06% (v/v) y incubar en hielo durante 5 minutos.
  12. Centrifugar a 80.000x g a 4 °C durante 20 minutos, y luego diálisis la fracción sobrenadante contra el tampón A (6 M urea, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-mercaptoetanol).
  13. Dializa de carga sobre una columna de intercambio iónico CM-Sepharose pre-equilibrada en el buffer A de un sistema de cromatografía NGC.
  14. Proteínas elutas con un gradiente lineal de 0-0,5 M de NaCl en el tampón A durante 1 hora a un caudal de 1 mL/min.
  15. Agrupar fracciones que contienen GFAP y diálisis contra el tampón B (6 M urea, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) y 1 mM EDTA).
  16. Carga diálisa sobre una columna de intercambio aniónico preequilibrada en el tampón B. Elute proteínas con un gradiente lineal de 0-0,5 M NaCl en tampón B durante 1 hora a un caudal de 1 mL/min.
  17. Analizar fracciones de columna mediante la tinción azul SDS-PAGE y Coomassie. Recoja los que contienen GFAP purificado y guárdalos a -80 °C.
    NOTA: La lisis bacteriana puede facilitarse mediante varios ciclos de congelación y deshielo. La concentración final de polietilenemina no debe superar el 0,06% (v/v), por encima de la cual también precipitan las proteínas. Al trabajar con materiales peligrosos como PMSF y β-mercaptoetanol, es fundamental incluir directrices y directrices claras de seguridad para la eliminación de residuos peligrosos. El PMSF es altamente tóxico y puede causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias. Prepara soluciones de PMSF frescas en una campana extractora y evita el contacto directo. Utiliza β-mercaptoetanol en una zona bien ventilada, ya que emite vapores fuertes y tóxicos.

2. Ensamblaje in vitro y ensayo de sedimentación (Figura 2)

  1. Diluir WT purificado o GFAP mutante a 0,3 mg/mL en 6 M de urea en un tampón bajo en sal (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA y 14,4 mM β-mercapetanol).
  2. Diálisa muestras contra el tampón bajo en sal que contiene 4 M y luego 2 M de urea durante 4 horas a temperatura ambiente.
  3. Dialisa muestras contra el tampón bajo en sal sin urea durante la noche a 4 °C.
  4. Diálisis muestras contra el tampón de ensamblaje (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl y 14,4 mM β-mercapetanol) a temperatura ambiente durante 12-16 h.
  5. Transfiere las mezclas del conjunto a la parte superior de un cojín de sacarosa que contiene 0,2 mL de sacarosa 0,85 M en el tampón de ensamblaje.
  6. En el ensayo de sedimentación a alta velocidad, centrifugar las mezclas a 80.000x g durante 20 minutos a 20 °C utilizando una micro-ultracentrífuga de mesa.
  7. Concentrar GFAP no ensamblado en la fracción sobrenadante realizando precipitación de metanol/cloroformo 15. La resuspensión precipita en 0,2 mL de tampón de muestra de Laemmli (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (p/v) dodecil sulfato (SDS), 12,5% (v/v) glicerol, 0,01% (v/v) azul de bromofenol y 355 mM β-mercaptoetanol).
  8. Resuspende el GFAP ensamblado en la fracción de pellets en el tampón de muestras de Laemmli.
  9. Procesa fracciones de sobrenadante y de pellet en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% (p/v) y tiñe con 10 mL de azul Coomassie.
  10. En el ensayo de sedimentación a baja velocidad, el ensamblaje de la centrifugadora mezcla a 3.000x g durante 5 minutos a 20 °C utilizando una centrífuga de mesa.
  11. Añadir 0,2 mL de tampón de muestra de Laemmli a las formas no agregadas de GFAP en la fracción sobrenadante.
  12. Resuspende el GFAP agregado directamente en la fracción de pellets en el buffer de muestras de Laemmli en un volumen proporcional a la fracción sobrenadante.
  13. Analizar tanto fracciones de sobrenadante como de pellets con gel SDS-PAGE al 10% (p/v), seguido de la tinción azul Coomassie.
    NOTA: El metanol y el cloroformo son disolventes tóxicos y pueden causar graves efectos en la salud. Evita el contacto con la piel e inhalación. Manipula con cuidado en una campana extractora para evitar derrames.

3. Tinción negativa y microscopía electrónica (Figura 2)

  1. Descarga por glow las rejillas de cobre recubiertas de carbono Formvar durante 45 s a 20 mA en un sistema de limpieza por descarga glow.
  2. Entregar las mezclas de ensamblaje a la rejilla con descarga incandescente y permitir que las muestras se unan a la película de soporte durante 60 s.
  3. Elimina el exceso de líquido absorbiendo el borde de la rejilla con un trozo de papel secante.
  4. Lava las rejillas con agua destilada y luego tiñe con 20 μL de acetato de uranilo al 1% (p/v) durante 60 s.
  5. Elimina el exceso de solución de tinción y deja que la rejilla se seque al aire durante 30 segundos.
  6. Examina las rejillas bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) H-7600 usando modo de alta resolución a un voltaje acelerado de 100 kV.
    NOTA: Descargar las rejillas con glow en un evaporador de vacío antes de añadir la muestra de proteína mejora la adsorción de la muestra en la rejilla. El acetato de uranilo es un químico radiactivo y altamente tóxico comúnmente utilizado en microscopía electrónica para la tinción negativa. Su manipulación requiere cumplir estrictamente con protocolos de seguridad e instrucciones para la eliminación de residuos peligrosos para minimizar los riesgos de exposición para el personal y el medio ambiente. Prepara soluciones de acetato de uranilo solo en una campana extractora para evitar la inhalación de partículas o vapores en suspensión.

4. Modificación oxidativa (Figura 3)

  1. Diluir GFAP a 0,3 mg/mL en 6 M urea en un tampón bajo en sal (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA y 14,4 mM β-mercapetanol) a temperatura ambiente durante 2 h.
  2. Diálisa contra el tampón bajo en sal que contiene 4 M de urea durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Remueve suavemente el tampón usando un agitador magnético para mantener una distribución uniforme y evitar gradientes de concentración.
  3. Después de 2,5 horas, transfiere la membrana de diálisis al tampón bajo en sal que contiene 2 M de urea durante otras 2,5 horas a temperatura ambiente, asegurando una suave agitación durante todo el proceso.
  4. Diálisa contra el tampón bajo en sal sin urea a 4 °C durante 18 horas.
  5. Tratar muestras diabalizadas con 10 mMH 2O 2 durante 15 minutos, seguido de un tratamiento con 10 o 100 mM de ditiotreitol (DTT) durante 15 minutos adicionales a temperatura ambiente.
  6. Analizar muestras de proteínas mediante SDS-PAGE estándar al 10% (p/v) sin β-mercapetanol y tiñir con 10 mL de azul Coomassie.
    NOTA: Al usarH2O2, trásalo con precaución, ya que es un agente oxidante fuerte y puede causar quemaduras. Lleva equipo de protección individual para evitar el contacto con la piel y los ojos. La TDT puede causar irritación en la piel, los ojos y el sistema respiratorio. Al trabajar con TDT y H2O 2, es esencial seguir los protocolos de seguridad adecuados para minimizar riesgos.

5. Purificación de GFAP del cerebro de ratas AxD (Figuras 4A,B)

  1. Extrae tejidos cerebrales con 10 mL de TEN buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl y 5 mM EDTA) usando un homogeneizador Douce.
  2. Centrifuga el cerebro homogenea a 76.000x g a 4 °C durante 20 minutos, y luego extrae el pellet resultante con 10 mL de tampón Triton X-100 (1% (v/v) Triton X-100 en tampón TEN).
  3. Centrifugar a 76.000x g a 4 °C durante 20 minutos, y luego extraer el pellet resultante con 10 mL de tampón de sacarosa (0,85 M de sacarosa y 0,5% (v/v) de Triton X-100 en un tampón TEN).
  4. Centrifugar a 76.000x g a 4 °C durante 20 minutos, y luego extraer el pellet resultante con 10 mL de tampón alto en sal (1,5 M KCl y 0,5% (v/v) Triton X-100 en tampón TEN).
  5. Centrifugar a 76.000x g a 4 °C durante 20 minutos, y luego extraer el pellet final con 10 mL de tampón de urea (8 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 y 5 mM EDTA).
  6. Recoger la fracción sobrenadante y dialisar contra el tampón de columna Q (6 M urea, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA y 14,4 mM β-mercaptoetanol).
  7. Carga los diálisados en una columna de intercambio aniónico en un Sistema de Cromatografía NGC.
  8. Eluir la proteína unida con un gradiente lineal de 0-0,5 M de NaCl en un tampón Q a un caudal de 1 mL/min.
  9. Agrupar fracción que contenga GFAP y diálisis contra el tampón de columna S (6 urea M, 20 mM MES, pH 6 y 14,4 mM β-mercaptoetanol).
  10. Aplicar diálisatos a una columna de intercambio catiónico y luego eluir las proteínas unidas con un gradiente lineal de 0-1 M NaCl en un tampón S a un caudal de 1 mL/min.
  11. Analizar fracciones eluídas mediante tinción azul SDS-PAGE y Coomassie, y recoger aquellas que contienen GFAP purificado.

6. Análisis de la ubiquitinación de GFAP mediante inmunoabsorción (Figura 4C)

  1. Aplica GFAP purificado con gel SDS-PAGE al 10% (sin usar).
  2. Transfiere las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa.
  3. Bloquea la membrana incubándola con 10 mL de albúmina sérica bovina al 3% (p/v) en solución salina con Tris-buffer (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) que contenga 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente.
  4. Incubar la membrana con 5 μL de anti-GFAP y 5 μL de anticuerpos primarios anti-ubiquitina diluidos en 5 mL de TBST a 4 °C durante la noche. Lava la membrana tres veces con TBST.
  5. Incubar la membrana con 5 μL de anticuerpos secundarios conjugados con colorantes fluorescentes, diluidos en 5 mL de TBST, a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Lava la membrana tres veces con TBST.
  6. Adquiere imágenes usando un sistema de detección de imágenes fluorescentes.
  7. Analizar el ensamblaje in vitro de GFAP nativo mediante ensayos TEM y de sedimentación (Figura 5) utilizando el mismo procedimiento descrito en los pasos 2.1 a 2.13 y 3.1 a 3.6.

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Resultados

Para investigar cómo las mutaciones causantes de AxD afectan a las propiedades de ensamblaje de GFAP, producimos proteínas recombinantes en bacterias utilizando un sistema de expresión basado en PET. Detallamos los protocolos para expresar y purificar GFAP, usando WT GFAP como ejemplo. Tras la inducción del IPTG (Figura 1A, carril 2), el GFAP se purificó mediante un proceso de tres pasos que incluyó la preparación del cuerpo de inclusión (Figura 1B) y cromatogra...

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Discusión

Este protocolo establece un marco experimental integral para la caracterización bioquímica del GFAP y sus mutantes asociados a enfermedades. Al proporcionar un enfoque fiable y estandarizado, este método es un recurso valioso que mejora nuestra comprensión de los roles biológicos de la GFAP y sus implicaciones patológicas, especialmente en el contexto de la AxD. En esta sección, discutimos varios aspectos críticos del protocolo, incluyendo posibles modificaciones y estrategias de solució...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dra. Tracy Hagemann (Waisman Center, Universidad de Wisconsin-Madison) por proporcionar las ratas knock-in R237H. Se agradecen mucho la sugerencia y el apoyo del Prof. Albee Messing (Waisman Center, Universidad de Wisconsin-Madison) sobre este estudio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (111-2320-B-007-008 y 112-2320-B-007-006 a N.-H. L. y M.-D.P.). También agradecemos a BioTEM de la Universidad Nacional Tsing Hua (MOST-104-2731-M-007-002) el uso del equipo en este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución 30% de acrilamida/Bis 37,5:1Biorad1610158
Persulfato de amonio (APS)Biorad1610700
AmpicilinaUSB11259
Anticuerpo anti-GFAPTecnología de señalización celular12389
Anticuerpo anti-ubiquitinaMilliporeST 1200Clon de FK2
Centrífuga Avanti J-26S XPBeckman
CloroanfenicolUSB23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Tinte azul CoomassieUSB32826
Rejilla de cobreTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultracentrfugaHitachiNA
Homogeneizador de dounceWheaton
DTTURDTT
Cepa pLysS de E. coli BL21(DE3)Agilent
EasiGlowTed Pella
Reactivo ECLPerkinElmerNEL 105001
EDTAUSB15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
Columna S de HiResCytiva2927 5877
Columna Q de HiTrapCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB medium (LB Agar)USB75851
Medio LB (LB Broth)BD Difco244620
mercaptoetanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
Sistema de cromatografía NGCBioRad
Optima XE-90 UltracentrífugaBeckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
PolietilenameminaSigma-AldrichP3143
RotorBeckman
S55S RotorHitachi
S80AT3 RotorHitachi
SDSUSB75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 cabras anti-ratón IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 cabra anti-conejo IgG BioRad12004161
SacarosaSigma-AldrichS5391
TEMEDUSB76320
Microscopio electrónico de transmisión H-7700)HitachiNA
TrisUSB75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Acetato de uraniloCiencias del microscopio electrónico  22400
ureaHoneywell15604H

Referencias

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