Artículo de método

Purificación de trofoblastos extravillosos HLA-G+ de tejidos placentarios humanos para fenotipado y análisis funcional

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DOI:

10.3791/69545

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13 de marzo de 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo permite la purificación, caracterización y cultivo de trofoblastos extravillosos primarios de HLA-G+ (EVT) de la decidua basal y la membrana coriónica de placentas humanas a término. Los cultivos primarios de EVT mantienen la viabilidad durante 96 horas, permitiendo el cocultivo con células inmunitarias maternas emparejadas por muestras y el posterior análisis citométrico y molecular de flujo de sus interacciones.

Resumen

La interfaz materno-fetal humana representa un entorno inmunológico único donde las células inmunitarias maternas y los trofoblastos extravillosos fetales (EVT) mantienen contacto celular directo para establecer y mantener la tolerancia inmune. La EVT presenta un inmunofenotipo distintivo caracterizado por la expresión de moléculas tolerogénicas, incluyendo HLA-G, PD-L1 y PD-L2, que desempeñan papeles fundamentales en la modulación de las respuestas inmunitarias maternas. Además, los EVT humanos expresan HLA-C que pueden ser reconocidos directamente por las células NK y T maternas y promueven su activación. Es importante destacar que no hay ortólogos de HLA-C o HLA-G presentes en modelos animales utilizados para la investigación, y los trofoblastos murinos carecen de expresión de MHC. Por tanto, investigar las propiedades fenotípicas y funcionales de la EVT humana a partir de tejidos placentarios, tanto bajo condiciones fisiológicas como patológicas, es esencial para esclarecer los mecanismos subyacentes al mantenimiento del embarazo y la fisiopatología de la inflamación placentaria asociada a la preeclampsia, el parto prematuro, la restricción del crecimiento fetal y la placenta acreta. Este protocolo describe una metodología integral para el aislamiento y caracterización de la EVT humana primaria a partir de tejido placentario sano a término, así como después del parto prematuro y la preeclampsia. Incluye: (1) disección de tejidos placentarios y de membrana coriónica; (2) digestión enzimática y preparación de suspensiones unicelulares; (3) purificación EVT mediante clasificación FACS; (4) Caracterización fenotípica mediante citometría de flujo de alta dimensión; y (5) cultivo in vitro a corto plazo y cocultivo con células inmunitarias maternas durante hasta 96 horas. Se pone énfasis en obtener EVT altamente pura y viable, adecuada para aplicaciones posteriores como ensayos funcionales inmunológicos y análisis de expresión de proteínas y génicos. La implementación de este protocolo permite una plataforma robusta y reproducible para avanzar en la comprensión de la EVT y las interacciones con las células inmunitarias maternas y sus implicaciones tanto en embarazos sanos como complicados.

Introducción

La placenta humana contiene cuatro grandes categorías de tipos de trofoblastos: células madre de trofoblastos, sincitiotrofoblastos, citotrofoblastos villosos y trofoblastos extravillosos (EVT), cada uno con funciones y características fenotípicas distintas. Entre ellas, la EVT presenta características inmunológicas únicas, incluyendo una alta expresión de moléculas inmunosupresoras, como HLA-G, PD-L1, PD-L2 y miembros de la familia B7, así como HLA-Cpolimórfico 1,2,3,4,5,6. La EVT invade profundamente el tejido decidual materno, las arterias espirales y el miometrio, poniéndolos en contacto directo con las células inmunitariasmaternas 7. Los EVT se caracterizan por una expresión prominente de HLA-C polimórfico, un mediador clave de las interacciones con células T y NK maternas que deben controlarse para preservar la tolerancia inmunitaria durante el embarazo. Como la única molécula clásica de MHC expresada por la EVT, HLA-C también permite la presentación de antígenos a las células T de memoria materna y apoya la proteccióninmunitaria 8. Sin embargo, varios estudios han demostrado que la EVT aumenta directamente las células T CD4 reguladoras y los estados tolerogénicos de las células T CD8 y las células NK para protegerse de la citotoxicidad y el rechazoinmunitario 9,10,11,12,13. Además, algunos estudios informaron de cambios inmunológicos en las células inmunitarias maternas y en la EVT de placentas obtenidas tras preeclampsia, parto prematuro o aborto espontáneo en comparación con controlessanos 14,15,16,17,18,19,20,21 . Varias posibilidades pueden estar detrás de estos cambios inmunológicos, incluyendo i) una anomalía preexistente en las células T maternas; ii) funciones inmunosupresoras deterioradas de la EVT; o iii) interacciones interrumpidas entre los dos tipos celulares. Para aclarar los factores mecanicistas subyacentes, son esenciales los sistemas experimentales de modelado ex vivo que permitan evaluar las células inmunitarias maternas y las interacciones con la EVT.

Los métodos y enfoques presentados aquí tienen varias ventajas respecto a los métodos existentes que utilizan líneas clásicas de trofoblastos, modelos de células madre trofoblastas o organoides. Lo más importante es que las líneas celulares clásicas de trofoblastos y los modelos de células madre trofoblastas no reflejan características esenciales de la EVT primaria, incluidos sus perfiles de expresiónMHC 3,5,22,23. En segundo lugar, los complejos requerimientos de medios de las células madre de trofoblastos humanos (hTSC) y los cultivos organoides que incluyen varios inhibidores moleculares afectan directamente las funciones y el fenotipo de las células inmunitarias, impidiendo una evaluación adecuada de la EVT y las interacciones entre célulasinmunitarias 22,24,25,26,27 . Por último, la diversidad celular de los cultivos de hTSC tras la diferenciación y la naturaleza del interior hacia fuera de las estructuras organoides placentarias permiten interacciones inmunitarias con tipos de trofoblastos que carecen de relevanciain n-vivo, reduciendo la claridad de losestudios 22,27.

Aquí describimos métodos para purificar la EVT primaria HLA-G+ a partir de tejidos placentarios humanos a término, permitiendo cultivar hasta 96 horas en presencia o ausencia de poblaciones de células inmunitarias. El medio carece de inhibidores moleculares que afecten la EVT y las funciones de las células inmunitarias manteniendo su viabilidad. Este enfoque proporciona una plataforma valiosa para estudios directamente ex vivo sobre la EVT y las interacciones de las células inmunitarias en embarazos sanos y complicados. Se espera que contribuya al descubrimiento de los principales factores que impulsan la tolerancia inmune materno-fetal e identifique objetivos terapéuticos para resolver la inflamación placentaria.

Protocolo

La junta de revisión institucional del Hospital Infantil de Cincinnati aprobó este protocolo de investigación (Aprobación #2021-0336), que cumple con los requisitos de consideraciones bioéticas, manejo de información personal, patógenos infecciosos y procedimientos de consentimiento informado conforme a la ley estadounidense. Cada laboratorio debe obtener una aprobación que cumpla con las directrices nacionales de investigación antes de comenzar el experimento.

Este protocolo se centra en el cultivo primario de HLA-G+ EVT que mantienen la viabilidad hasta 96 horas para el ensayo funcional secundario, mejorando nuestro protocoloanterior 2,28. Consulte Hamilton et al.2 para establecer la línea celular tipo EVT HLA-G+ e Ikumi et al.28 para involucrar linfocitos deciduales maternos emparejados.

1. Montar el laboratorio (día 0).

NOTA: Utilice un armario de bioseguridad clase II (BSL2) para manipular muestras.

  1. Prepara dos baños de agua a 39 °C y 37 °C. Montauna incubadora de CO2 humidificada a 37 °C.
  2. Preparar 1x PBS, medio de lavado A, medio de lavado B, medio de cultivo EVT A, B y C (Tabla 1 y Tabla 2).
  3. Descongelar 15 mL de solución de 10 mg/mL de DNasa I (Tabla 1) y 500 mL de tripsina/EDTA al 0,25% en baño maria a 37 °C.
  4. Coloca un recipiente lleno de solución biocida/virucida (por ejemplo, lejía al 10%) en el armario BSL2 para la recogida de residuos líquidos. Prepara un contenedor de residuos con una bolsa de biohazard en el armario BSL2 para residuos sólidos.
  5. Prepara almohadillas absorbentes, herramientas de disección estériles (pinzas de punta curva y tijeras de 6 1/2"), filtros metálicos estériles, bastidores para tubos y tubos cónicos estériles de 50 mL en el armario BSL2.
  6. Prepara tres tubos cónicos de 50 mL (dos con 1 PBS cada uno y uno con medio de lavado A para la recogida de fragmentos de tejido placentario durante la disección).

2. Recogida de muestras (día 0)

NOTA: Utilizar placentas humanas con membranas obtenidas por cesárea entre las 24 y 42 semanas de gestación. Una placenta administrada vaginalmente puede producir menos EVT.

  1. Comienza a procesar la placenta inmediatamente en un gabinete BSL2, idealmente dentro de 1-2 horas tras el parto, para maximizar el rendimiento de células viables. Mantén la placenta a temperatura ambiente en todo momento.
  2. Inspeccionar la placenta y, si es necesario, registrar su tamaño, peso y apariencia morfológica macroscópica.

3. Disección de tejidos (día 0)

  1. Disección de membrana
    1. Coloca la placenta mirando hacia arriba hacia el lado fetal (la parte de inserción del cordón es visible). Eliminar el amnión, que es la capa de membrana más cercana al lado fetal, despegando manualmente la membrana lateral hacia el lugar de inserción del cordón umbilical; Corta y descarta el amnion.
    2. Corta la membrana coriodecidual en tiras de 2 pulgadas empezando desde la base de la placenta hacia arriba, dejando la tira de membrana unida a la placenta.
    3. Coloca la tira de membrana coriodecidual sobre los dos dedos que miran hacia arriba y raspa suavemente la decidua parietal materna del corio usando las pinzas curvas estériles de la punta.
      NOTA: Trabaja de forma eficiente y no dejes que la membrana coriónica se seque.
    4. Recoge la membrana coriónica en un tubo cónico de 50 mL con 20 mL de medio de lavado A.
    5. Recoger la decidua parietalis para aislamiento de linfocitos deciduales en el tubo cónico de 50 mL con 20 mL de PBS y seguir el protocolo descrito por Ikumi et al. para el aislamiento delinfocitos 28.
    6. Corta la membrana coriónica con tijeras en el tubo de 50 mL hasta que se convierta en pequeños trozos de <2mm2.
      NOTA: La cantidad total de la membrana asentada es idealmente de 30 mL tras el corte.
    7. Descarta el Medio de Lavado A y lávate con PBS varias veces hasta que el sobrenadante se despeje.
  2. Disección placentaria
    1. Coloca la placenta mirando hacia arriba hacia el lado materno y elimina los coágulos sanguíneos. Cortar los trozos de la placa basal placentaria (longitud 2 cm, ancho 2 cm, profundidad 0,5 cm) usando tijeras estériles, evitando las partes necróticas, calcificadas o isquémicas.
    2. Coloca el trozo de Decidua basalis sobre los dedos que miran hacia las vellosidades (lado fetal) hacia arriba. Retirar cuidadosamente las vellosidades de la basal de la cidua basal con tijeras para obtener 2-3 mm de membrana, quedando solo una fina capa de vellosidades en la basal de la decídua.
    3. Recoger tejido de la base de la decidua en el tubo cónico de 50 mL con 20 mL de PBS. Pica las caducifolias basales hasta que se conviertan en pequeños trozos de <2 mm2.
      NOTA: La cantidad total de tejido sedimentado es idealmente de 15 mL tras el corte.
    4. Descarta el PBS y lava la basal decidual con PBS varias veces hasta que el sobrenadante se despeje sin sangre visible.
    5. Dividir 15 mL de suspensión tisular en dos tubos cónicos de 50 mL (7,5 mL en cada tubo).
      NOTA: El protocolo de aislamiento de linfocitos de la decidua basalis es distinto de este protocolo. Consulte el protocolo proporcionado en Hamilton et al.2.

4. Digestión de tejidos (día 0)

  1. Tras el lavado final de membrana coriónica y decidua basalis en la sección 3, llena todos los tubos con 1x PBS, centrifuga a 200 × g durante 1 minuto y vierte el sobrenadante.
  2. Prepara el cóctel de enzimas para digestión tisular (Tabla 1). Añade 150 mL de cóctel enzimático de digestión tijidual tibia a una botella de cristal de 300 mL, luego añade 30 mL de membrana coriónica a la botella.
  3. Añade 20 mL de DMEM/F20 tibio y 80 mL de cóctel enzimático de digestión tijidual tibia a dos botellas de cristal de 300 mL y luego añade 7,5 mL de Decidua basalis en cada botella.
  4. Incubar la botella con membrana coriónica en el baño María a 39 °C y las dos botellas con decidua basalis en el baño María a 37 °C. Durante los 15 minutos de incubación, agita todos los biberones cada 3-4 minutos (primera digestión).
  5. Tras la digestión, filtra el tejido digerido a través de tamices metálicos (malla tamaño 40). Añade Wash Medium B a los pajidos para enjuagar y disolver la sustancia gelatinosa.
  6. Filtra las suspensiones celulares sobre un filtro de 100 μm en tubos de 50 mL etiquetados con tipo de tejido y número de digestión.
  7. Procede con la segunda digestión transfiriendo el tejido no digerido de nuevo a los frascos medianos de 300 mL, añade el Cóctel de Enzimas de Digestión Tisular como se describe en el paso 4.2, y repite los pasos 4.2-4.6.
    NOTA: Todos los tejidos de Decidua basalis se transfieren a una botella de 300 mL. Mantén separadas las células obtenidas tras la primera digestión y la segunda.
  8. Gira la suspensión de la celda a 650 × g durante 8 minutos y descarta el sobrenadante.
  9. Combina los pellets (pero mantén la primera y la segunda digestión separadas) del mismo tipo de tejido y número de digestión en un solo tubo. Llena con Wash Medium B hasta 25 mL.

5. Gradiente de densidad de Ficoll (día 0)

  1. Prepara cuatro tubos cónicos de 50 mL etiquetados con el tipo de tejido y el número de digestión. Vierte 12 mL de Ficoll en los tubos.
  2. Carga cuidadosamente las suspensiones de celda en el Ficoll. Centrifuga los tubos a 800 × g durante 20 minutos (temperatura ambiente) sin freno.
  3. Transfiere cuidadosamente la capa celular en la interfaz Ficoll-medio a tubos cónicos limpios de 50 mL, marcados por tipo de tejido y número de digestión tras la centrifugación.
    NOTA: Recoge cuidadosamente la capa sin alterar la interfaz usando una pipeta de transferencia estéril.
  4. Llena los tubos con Wash Medium B y centrifuga a 650 × g durante 8 minutos.
  5. Descarte el sobrenadante y vuelva a suspender los pellets celulares con el medio restante (aproximadamente 0,5 mL). Si es necesario, mantén aproximadamente el 10% de la suspensión celular separada para el fenotipado y usa el 90% para la clasificación celular. Cuenta las celdas para determinar el número de celdas y la viabilidad.

6. Clasificación de EVT (día 0)

  1. Coloque los pellets de células resuspendidos en tubos FACS estériles etiquetados con el tipo de tejido y el número de digestión. Añadir anti-CD45-BV785 (1:100), anti-HLA-G-APC (1:125) y anti-EGFR1-BV711(1:160) (Tabla 3). Incuba los tubos durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  2. Añade 1 mL de Wash Medium B y centrifuga a 650 × g durante 8 minutos.
  3. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender los pellets de celda con el Medio de Lavado B para obtener aproximadamente 1 × 1010 células de 6 celdas / mL.
  4. Filtrar las células a través de un colador celular de 40 μm, justo antes de la clasificación celular, y clasificar CD45-HLA-G+EGFR+ EVT en tubos con 1 mL de Medio de Cultivo EVT A según la estrategia de compuerta descrita en la Figura 1A.
    NOTA: Para una viabilidad óptima de trofoblastos, se debe usar un clasificador de celdas a chorro en aire (por ejemplo, Bigfoot o MoFlo) con una boquilla de 100 μm. Los clasificadores basados en fluídica (por ejemplo, DB S6 o Sony Nano) pueden reducir la viabilidad de los trofoblastos, mientras que las estrategias de clasificación de células magnéticas (por ejemplo, Easysep o MACS) pueden preservar la viabilidad pero tener baja pureza, lo que resulta en un sobrecrecimiento de células estomales en los cultivos.
  5. Centrifuga los tubos FACS con las celdas clasificadas, descarta el sobrenadante y vuelve a suspender los pellets celulares con el Medio de Cultivo EVT B.
    NOTA: Proceda a la siguiente sección para preparar las placas de cultivo mientras se clasifican las células.

7. Cultivo primario de HLA-G+ EVT para ensayo secundario (días 0 - 1)

  1. Recubre los pozos de las placas de cultivo celular de fondo plano y 96 pozos con 50 μL de fibronectina de 20 μg/mL (Tabla 2) a temperatura ambiente durante 45 minutos.
  2. Retira la fibronectina y añade la suspensión celular con medio de cultivo EVT B a los pozos. Apunta a 0,5 × 10 celdasEVT basales de 5 basales/200 μL de medio/pozo y 1,0 × 10 célulasEVT coriónicas /200 μL de medio/pozo. Incubar las placas de cultivo celular durante 12-18 horas en la incubadora humidificada deCO2 a 37 °C (incubación día 0).
  3. El primer día, retirar el medio B, lavar suavemente las células con 1x PBS y añadir el Medio de Cultivo EVT C con o sin células T para un posterior (co)cultivo (véase la sección 8).

8. Co-cultivo de EVT primario HLA-G+ con células T activadas (días 0 - 4)

  1. Estimulación de células CD8+T de un donante tercero (días 0-1)
    1. Durante la clasificación de HLA-G+ EVT (día 0), aísla poblaciones de células inmunitarias de sangre periférica de sangre materna emparejada con muestras o de donantes no emparentados, utilizando el cóctel de enriquecimiento de células T CD8+ humanas referenciadas (véase la Tabla de Materiales) seguido de centrifugación por gradiente de densidad de Ficoll o clasificación FACS.
    2. Preestimular células T o NK con perlas o citocinas anti-CD3/28 (por ejemplo, IL2, IL15, IL12 o IL18) en el Medio de Cultivo Celular de Linfocitos según se desee.
  2. Co-cultivo EVT con células T activadas (días 1-4)
    1. Contar el número de linfocitos y realizar suspensiones celulares con medio de cultivo de linfocitos a una concentración de 0,5 × 106 / mL. Añadir 1 × 1010 linfocitos 5 a los pozos primarios de EVT (el volumen de Medio de Cultivo de EVT C : Medio de Cultivo Celular de Linfocitos = 1:1). Incuba las placas durante 24-72 horas en una incubadora deCO2 humidificada a 37 °C.
    2. Cosechar linfocitos para el análisis de citometría de flujo y recoger los sobrenadantes para el análisis de citocinas.
    3. Extraer EVT mediante tripsinización y recoger EVT en los tubos FACS para el análisis de citometría de flujo en el día 4 (véase la sección 9).

9. Fenotipado del HLA-G+ EVT primario

NOTA: Proceder inmediatamente con la tinción citométrica de flujo y mantener la EVT y todas las soluciones necesarias a temperatura ambiente en todo momento.

  1. Centrifuga los tubos FACS con EVT primario a 650 × g durante 7 minutos y descarta el sobrenadante.
  2. Añade la solución de tinción de caspasa 3/7 (Tabla 3) a los pellets celulares y mézclalos suavemente.
  3. Tiñe las células con anticuerpos (Tabla 3), mézclalas suavemente e incuba durante 20 minutos adicionales (incubación total de 30 minutos).
  4. Añade 1 mL de medio de cultivo EVT C, centrifuga los tubos a 650 × g durante 7 minutos y desecha el sobrenadante.
  5. Resuspende el pellet celular con 0,4 mL de medio de cultivo C de EVT celular. Añade la solución de tinción 7-AAD (5 μL/suspensión de células) en los tubos y analícala inmediatamente con un citómetro de flujo.

Resultados

Rendimientos esperados de la celda

A partir de 15 mL de basal de la hoja de caduca, la EVT esperada de HLA-G+ da entre 0,1 y 0,3 × 106 células en la primera digestión y entre 0,1 y 0,6 × 106 celdas en la segunda digestión (total 0,2-0,8 × 106 células). A partir de 30 mL de membrana coriónica, los rendimientos esperados de EVT HLA-G+ son 0,4-1,0 × 106 células en la primera digestión y 0,4-1,5 × 106 células en la segunda digestión (total 0,8-2,5 × 106 células). Se espera que la proporción de caspasa 3/7-7-AAD-EVT viva en los aislados sea del 90-95%.

Cultura primaria de EVT HLA-G+

El análisis de citometría de flujo de marcadores de linaje (HLA-G, HLA-C, EGFR) y marcadores de muerte celular mostró que este protocolo proporciona un cultivo primario viable de EVT hasta el día 4 (96 horas después de colocar el EVT clasificado) (Figura 1B-D). Se muestran imágenes representativas de microscopía óptica de la TRV coriónica primaria y d.basalis HLA-G+ tras 24, 48 y 72 horas de cultivo (Figuras 2A-F).

Cocultivo de EVT primaria HLA-G+ con células T

Este protocolo mejoró la viabilidad de la EVT primaria 96 horas después del aislamiento de la placenta, una mejora respecto a nuestro informeanterior 1, 2 y 10. Por ello, permite el análisis de las respuestas de la EVT tras el co-cultivo con linfocitos preestimulados, lo que simula la inflamación aguda en la interfaz materno-fetal. EVT expresa HLA-C polimórfica así como moléculas coinhibitorias inmunosupresoras, como PD-L1, PD-L2, PVR (también conocido como CD155), B7H3 y HLA-E, según lo determinado por tinción por citometría de flujo extracelular (Figuras 3A, B). La EVT aumentó la expresión de HLA-C, así como de PD-L1, PD-L2 y HLA-E, pero no incrementó la expresión de PVR y B7H3 cuando se co-cultivó con linfocitos activados durante 72 horas según la sección 8 del protocolo (Figura 4A,B). Además, no se observó un aumento en la muerte por EVT, como se mostró en la 7AAD y la tinción de caspasa 3/7 (Figura 4C,D).

Figura 1
Figura 1. La estrategia de acceso para la clasificación de células EVT y la citometría de flujo se traza tras cultivar EVT ordenado. (A) La estrategia representativa de gating para clasificar la EVT de decidua basalis y la EVT coriónica. R1 es la puerta de celda viva en el gráfico de dispersión del lado delantero. R2 es la puerta para la exclusión de leucocitos CD45+. R3 es la puerta HLA-G+EGFR+EVT. R4 es el 7-AAD-caspasa 3/7- EVT en vivo. Aunque la compuerta R4 no es necesariamente necesaria para la clasificación, aquí se muestra para demostrar la viabilidad de la EVT primaria. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo de HLA-G+EGFR+EVT ordenados, tras 96 horas de cultivo in vitro. (C,D) Frecuencias de caspasa 3/7-7-AAD - EVT vivas durante el proceso de cultivo (día 0) y 96 horas de cultivo (día 4). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La morfología de la EVT durante el cultivo in vitro . Imágenes representativas de microscopía óptica de la EVT coriónica tras (A) 24 h, (B) 48 h y (C) 72 h de cultivo y EVT de la base de la decidua después de (D) 24 h, (E) 48 h y (F) 72 h de cultivo. Barra de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Fenotipos inmunológicos de la EVT primaria. (A) Los gráficos de flujo representativos de HLAs y moléculas coinhibitorias en EVT primaria determinados por tinción de citometría de flujo extracelular (día 0). (B) Los diagramas de líneas emparejadas muestran MFI puro del control IgG y la tinción completa de cada marcador desde d. basalis EVT (azul) y EVT coriónica (verde) en el día 0. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Fenotipos inmunológicos de la EVT primaria con o sin linfocitos activados (día 4). (A) Gráficos de flujo representativos de EVT tras el cultivo de 72 horas (día 4) con o sin linfocitos de terceros activados. (B) Los gráficos de líneas emparejadas muestran IMF de EVT con o sin linfocitos de terceros activados. Las parcelas azules representan la EVT de la caja de cidua basal, y las parcelas verdes representan la EVT coriónica. (C) Gráficos representativos de citometría de flujo para caspasa 3/7-7-AAD-EVT viva con o sin linfocitos de terceros activados en el día 4. (D) Los diagramas lineales emparejados muestran frecuencias de caspasa 3/7-7-AAD-EVT en vivo con o sin linfocitos de terceros activados. Las parcelas azules representan la EVT de la caja de cidua basal, y las parcelas verdes representan la EVT coriónica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1. Reactivos clave para la disección y digestión de tejidos. Véasetambién 1,2,24. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2. Reactivos clave para el cultivo de EVT y el cocultivo con células T. Véasetambién 1,2,24. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3. Anticuerpos y reactivos clave para la clasificación y el análisis de citometría de flujo. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Pasos críticos del protocolo

Para obtener una EVT viable, es fundamental comenzar el aislamiento celular de la placenta inmediatamente después del parto, y realizar todos los procedimientos, desde el aislamiento hasta la clasificación, a temperatura ambiente. Dado que los EVT son más grandes y más adhesivos que los linfocitos, deben tomarse las siguientes precauciones para la clasificación y evitar obstrucciones: i) pasar la suspensión celular por un colador de 40 μm antes de clasificar, ii) usar un medio que contenga DNasa para la suspensión celular, iii) evitar sobreconcentrar las suspensiones celulares (idealmente ~1 × 10⁶ células/mL), e iv) usar una boquilla de al menos 100 μm. Un clasificador Jet-in-Air (por ejemplo, Bigfoot, MoFlo) logra un rendimiento EVT viable mayor en comparación con los clasificadores de celdas basados en fluidica (por ejemplo, clasificadores BD, Sony Nano).

Modificaciones y resolución de problemas del método

Sobredigerido o poco digerido tras la primera digestión de la EVT de Decidua basalis

La eficiencia digestiva del tejido de la hoja cacidua basal varía entre placentas. Los tejidos sobredigeridos forman grandes agregados pegajosos que son difíciles de pasar a través del tamiz metálico. Normalmente, añadir entre 10 y 30 mL de Medio de Lavado B ayuda a dispersar estos agregados durante la filtración. Si esto no resuelve el problema, añade 1-2 mL de DNasa directamente a los tejidos. Si la primera digestión resulta en sobredigestión, reduce la concentración del Cóctel de Enzimas de Digestión Tisular del 80% al 70% para la segunda digestión. Tras la filtración de la primera digestión, el volumen residual del tejido debe reducirse aproximadamente a menos de la mitad. Si el volumen residual del tejido permanece sin cambios, aumentar la concentración del Cóctel de Enzimas de Digestión Tisular del 80% al 90-100% para la segunda digestión. Los tejidos de la membrana coriónica se digieren de forma constante a través de las placentas. Por lo tanto, ajustar la concentración del cóctel enzimático de digestión tisular generalmente no es necesario.

Para la digestión de volúmenes tisulares mayores que los descritos en el protocolo anterior

Para digestiones de más de 30 mL de membrana coriónica o más de 15 mL de tejido basal de la hoja de ciduca, utilice botellas adicionales con el Cóctel de Enzimas de Digestión Tisular. Aumentar el volumen de tejido en una sola botella suele provocar una digestión insuficiente.

Limitaciones del método

Se esperan rendimientos más bajos de EVT a partir de las placentas administradas por vía vaginal. La EVT no puede ser criopreservada ni antes ni después de la clasificación, ya que son sensibles al estrés de congelación y descongelación, lo que limita significativamente su viabilidad y función. Por tanto, este protocolo no incluye ningún punto de detención.

La importancia del método respecto a los métodos existentes

Anteriormente informamos del protocolo para establecer líneas celulares similares a HLA-G+ EVT a partir de placentas a término utilizando Medio B de Cultivo de Tejidos y placas recubiertas de colágeno. Sin embargo, varios inhibidores en el medio y el colágeno pueden afectar potencialmente la función de las células T en el sistema decocultivo 2. Otro informe previo que no utilizó el Medio B de Cultivo de Tejidos permitió la evaluación de células T en cocultivo, pero no de EVT debido a la variabilidad celular 1,10. La ventaja del protocolo actual es que minimiza la influencia del medio de cultivo mientras permite el cultivo de EVT primario viable. Este protocolo proporciona una plataforma experimental para investigar la función inmunológica de la EVT y sus cambios funcionales en respuesta a las células inmunitarias circundantes, un área que ha sido poco investigada.

Divulgaciones

No existe ningún conflicto de intereses relacionado con este estudio.

Agradecimientos

Queremos agradecer a Sherry Thornton y al Research Flow Cytometry Core de la División de Reumatología del Cincinnati Children's Hospital Medical Center por toda su ayuda con la citometría de flujo y la clasificación celular; Todas las enfermeras y médicos de los hospitales participantes por sus esfuerzos en la recogida de materiales placentarios; Todos los miembros del laboratorio de Tilburgs y el profesorado de inmunología de CCHMC por sus útiles debates; Este trabajo contó con el apoyo del NIH R01HD116852 (T.T.); Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati (T.T.); Premio Burroughs Wellcome Fund al Embarazo Next Gen #NGP10115 (T.T.); y la subvención colaborativa March of Dimes Ohio (T.T.). S.T. cuenta con el apoyo de las subvenciones JSPS KAKENHI 22KK0287 y 25K12697.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
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Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Referencias

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