Artículo de método

Muestreo en tiempo real del líquido intersticial arteriovenoso advential de rata femoral mediante la colocación de una sonda de microdiálisis

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DOI:

10.3791/69551

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30 de diciembre de 2025

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1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio introduce una técnica de microdiálisis que facilita el muestreo en tiempo real y anatómicamente preciso del líquido intersticial adventicial (AISF) en ratas anestesiadas, revelando variaciones metabólicas distintas y afirmando su importancia fisiológica única. En comparación con los métodos existentes de muestreo de fluidos intersticiales (ISF), este enfoque proporciona una mayor resolución molecular y estabilidad del muestreo.

Resumen

El fluido intersticial (ISF) es un elemento vital del microambiente extracelular, facilitando el intercambio metabólico y la comunicación intercelular. No obstante, la profundidad anatómica y la proximidad a las estructuras vasculares hacen que el ISF adventicial (AISF) sea especialmente difícil de muestrear sin introducir contaminación o causar alteraciones tisulares. En este estudio, introducimos un método en tiempo real y mínimamente invasivo para la recogida de AISF mediante el uso de microdiálisis en ratas anestesiadas. Se implantaron quirúrgicamente sondas dobles de corte de 20 kDa en la adventitis arteriovenosa femoral y en la vena yugular para permitir un muestreo continuo de ISF y sangre, respectivamente. La perfusión con fluido extracelular artificial permitió la difusión selectiva de metabolitos de bajo peso molecular. Mediante el análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA), se observó una divergencia metabólica clara entre la AISF y la sangre, identificando 146 metabolitos significativamente diferenciales. Los patrones de enriquecimiento de lactato y serotonina confirmaron la especificidad anatómica y la fiabilidad funcional del método. Es importante destacar que el AISF se enriqueció con metabolitos sintetizados localmente que estaban ausentes en el plasma, lo que pone de manifiesto su singular significado fisiológico. En comparación con las metodologías actuales de muestreo de fluidos intersticiales (ISF), como microagujas, ampollas de succión e iontoforesis inversa, la microdiálisis proporciona una mejor resolución molecular, mayor estabilidad de muestreo y menor invasividad. Esta técnica constituye una plataforma fiable para el análisis in vivo de analitos en líquido intersticial (AISF) y muestra un potencial significativo para avanzar en el descubrimiento de biomarcadores y la investigación en fisiopatología vascular.

Introducción

El fluido tisular, o fluido intersticial (ISF), constituye un elemento crucial del microambiente celular, con investigaciones académicas que se remontan a finales del siglo XIX. En 1896, Starling introdujo la teoría de filtración-reabsorción capilar, que caracterizó por primera vez el ISF como un fluido homogéneo generado mediante ultrafiltración por plasma, desempeñando un papel vital en el transporte de nutrientes y la eliminación de residuosmetabólicos 1. En las dos últimas décadas, los avances en tecnología de imagen microscópica y biología molecular han mejorado la comprensión de los investigadores sobre la considerable diversidad en la distribución, composición y función anatómica deISF 2.

La investigación sobre el líquido intersticial (ISF) en diversos sitios anatómicos ha esclarecido sus funciones distintivas dentro de distintos tejidos. Por ejemplo, en el tejido cerebral, la ISF facilita la eliminación de metabolitos neurotóxicos, como el β-amiloide, durante el sueño a través del sistema glymphático3. Por el contrario, el líquido intersticial tumoral (TIF) contribuye a la invasión tumoral y a la evasión inmune al promover un microambiente ácido mediante la acumulación de ácidoláctico 4. Estos hallazgos sugieren que la ISF funciona no solo como mediador del intercambio metabólico, sino también como regulador activo de los procesos fisiopatológicos específicos de cada tejido. En este contexto, el Fluido Intersticial Advential (AISF) presenta un desafío único de investigación debido a su localización anatómica específica y complejidad funcional. La AISF se encuentra en la intersección entre la adventitia y los tejidoscircundantes 5, desempeñando un papel crucial en la interacción entre la pared vascular y los sistemas nervioso e inmunitario. Sin embargo, su ubicación anatómica profunda y su proximidad a la sangre y a los fluidos linfáticos han planteado importantes desafíos técnicos para el muestreo in situ y el análisis composicional.

Las técnicas tradicionales para muestrear ISF, incluyendo el método de mecha y el drenaje quirúrgico, enfrentan importantes dificultades para obtener muestras de AISF de alta pureza debido al riesgo de contaminación sanguínea y daño tisular. Por ejemplo, la extirpación quirúrgica del epitelio vascular puede causar lesiones en nervios periféricos o vasos linfáticos, resultando en la mezcla de biomoléculas no objetivo6. Además, estos métodos están limitados por bajas tasas de muestreo, inestabilidad, susceptibilidad a interferencias y baja reproducibilidad, a menudo atribuible a la inflamación inducida por la inserción subcutánea demechas 7 y daño celular durante la implantación muscular. El desarrollo de la microdiálisis presenta un enfoque más eficaz para los estudios ISF. Esta técnica permite la captura in situ y dinámica de pequeñas moléculas, como metabolitos y citocinas, dentro del ISF sin comprometer la estructura vascular mediante el uso de una sonda de membrana semipermeable. La sonda puede posicionarse con precisión dentro del espacio epitelial vascular, reduciendo así el riesgo de contaminación por sangre o fluidos linfáticos. Además, facilita el muestreo continuo, lo que permite monitorizar en tiempo real los cambios dinámicos en el metabolismo de los ISF bajo diversas condiciones. Garantizar un seguimiento continuo y estable de estos procesos metabólicos durante el experimento.

Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron tras la aprobación del Comité de Ética Animal del Pekín Union Medical College. Todos los procedimientos se respetan estrictamente con protocolos establecidos. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación experimental

  1. Ilustrar el sistema de muestreo de microdiálisis y los instrumentos quirúrgicos asociados como se muestra en la Figura 1.
  2. Preparar líquido extracelular artificial (ECE) que contenga 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl y 1,25 mM de glucosa, y ajustar el pH a 7,4.
  3. Prepara dos sondas mD de 20 kDa y designalas como Sonda 1 (sonda de fluido tisular) y Sonda 2 (sonda de sangre). Coloque la sonda 1 en agua desionizada filtrada estéril (dH₂O) y la sonda 2 en heparina sodiosa al 1%, asegurando que las puntas de la sonda permanezcan continuamente húmedas.
  4. Establece dos pares de vías (Vías 1 y 2) para "entrada" y "salida". Conecta dos segmentos de tubería FEP de 1 m usando tubería PE50, minimizando el espacio muerto. Conecte cada tubo de entrada a una jeringuilla Exmire de 1 mL: llene la Jeringuilla 1 con dH₂O y la Jeringuilla 2 con heparina sódica al 1%. Conecta las microjeringas a las sondas y prepárate para la infusión de ECF tras colocar las sondas en la vena yugular.
  5. Activa la bomba mD y ajusta el caudal a 1,5 μL/min hasta que el fluido salga del tubo de salida. Conecta el tubo de salida a la línea de recogida de muestras.
  6. Llena dos microjeringas con aECF filtrado e inicia el bombeo a 1 μL/min.

2. Preparación animal

  1. Selecciona ratas Sprague-Dawley adultas que pesan 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Inducir anestesia usando isoflurano al 3% y mantenerla con un 1,8%-2,2% de isoflurano en una mezcla aire/oxígeno mientras se monitoriza la actividad cardíaca (siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados). Confirma la anestesia profunda evaluando la ausencia de respuesta al dolor y observando una frecuencia cardíaca reducida (340-390 lpm). Coloca a la rata sobre una manta termostática e inmoviliza las extremidades.
  3. Aplica crema depilatoria en el cuello y la extremidad trasera izquierda, extendiéndose hasta el abdomen inferior izquierdo. Desinfecta las zonas depiladas dos veces con iodóforo y elimina el yodo residual usando alcohol medicinal al 75%.

3. Colocación de sonda en doble sitio (adventitio femoral y vena yugular)

  1. Utilice una sonda con una ventana de diálisis activa de 10 mm (CMA-20, corte de 20 kDa, diámetro de eje de 0,5 mm) como se muestra en la Figura 2A.
  2. Prepara la aguja guía y el tubo desmontable (Figura 2B).
  3. Extiende la extremidad posterior de la rata de modo que la línea que conecta la articulación de la rodilla y el punto medio del pliegue inguinal sea perpendicular al eje longitudinal del cuerpo. Mide un segmento de 2 cm a lo largo de la piel de la región inguinal en dirección a la extremidad posterior para definir el área quirúrgica emblemática (Figura 2C). Identifica el punto medio de esta región inguinal como el punto de posicionamiento de la microventana. Marque el punto de punción 2 cm lateralmente a este punto de posicionamiento (Figura 2D).
  4. Coloca al animal bajo un estereomicroscopio.
  5. Realizar una incisión de 0,5-0,8 cm en el punto medio del pliegue inguinal para facilitar la visualización y asegurar una colocación precisa de la sonda dentro de la membrana perivascular. Disecciona de forma directa el tejido subcutáneo para exponer la arteria y vena femoral, la vena safena y la vena superficial de la pared abdominal (Figura 2E).
  6. Encierra la capa exterior de la aguja punzante en un tubo rompible para crear una aguja guía.
  7. Confirma que no hay vasos sanguíneos bajo la piel en el lugar de la punción. Introduce la aguja verticalmente a través de la piel y luego ajusta el ángulo a 45° para entrar en el espacio tisular que rodea la vena safena.
  8. Avanza la aguja en dirección al flujo sanguíneo dentro de la vena safena, manteniendo un contacto cercano con la pared del vaso durante todo el proceso. Utiliza un estereomicroscopio para monitorizar la posición de la aguja en tiempo real y prevenir lesiones vasculares o contaminación sanguínea. Posteriormente, guía la aguja hacia la adventicia de la vena femoral (Figura 2F).
  9. Retira la aguja de punción dejando el tubo desgarrador en su lugar dentro del tejido (Figura 2G).
  10. Insertar la sonda de fluido tisular en el catéter rompible y abrir cuidadosamente el catéter para exponer el lugar de muestreo y extraer la muestra de tejido (Figura 2H). Asegúrese de que la sonda esté posicionada con precisión dentro de la adventicia de la arteria y vena femoral (Figura 2I). Fija la sonda a la piel antes de suturar (Figura 2J). Realizar todos los procedimientos bajo condiciones asépticas estrictas, cuidando de evitar alteraciones de la adventitis vascular y de prevenir inflamaciones tisulares o reacciones de cuerpos extraños que puedan comprometer la recogida de líquido tisular.
  11. Verifica la posición de la sonda fotografiando una regla quirúrgica junto con la sonda fija para documentar la longitud expuesta, y presenta esta imagen tal como se muestra en la Figura 2I.
  12. Realizar una incisión cutánea de 2 cm aproximadamente 0,5 cm lateral a la línea media del cuello, comenzando 1 cm por encima de la muesca esternal.
  13. Se disecciona de forma directa a través del músculo esternocleidomastoideo para exponer la vena yugular, que se sitúa lateral a la arteria carótida y se identifica por su coloración azul oscuro. Utiliza un hisopo de algodón humedecido para separar suavemente la fascia, teniendo cuidado de evitar el contacto con el nervio vago.
  14. Utilizando pinzas microscópicas, eleva suavemente la membrana externa de la vena yugular y retira cuidadosamente el tejido conectivo circundante para obtener al menos 1 cm de longitud de vaso libre. Coloque una sutura de seda 4-0 proximalmente para servir como ligadura de respaldo (Figura 2K).
  15. Para la punción venosa, realiza una incisión oblicua en un ángulo de 45°, aproximadamente un tercio del diámetro del vaso. Utiliza micropinzas para abrir suavemente la incisión y crear una entrada para la inserción de la sonda.
  16. Inserta cuidadosamente la punta de la sonda en la vena y avanza lentamente hasta una profundidad de 3,5-4,0 cm, asegurando que la punta llegue a la entrada de la aurícula derecha (Figura 2L).
  17. Asegura la sonda apretando la ligadura de seda proximal con un doble nudo. Cierra la capa muscular usando suturas 4-0 de Vicryl y luego sutura la piel con puntos interrumpidos. Fija la parte externa de la sonda a la superficie de la piel para evitar el desplazamiento.

4. Recogida de muestras y recuperación de la sonda

  1. Recogida de muestras: Evalúa la relación entre la diálisis tisular y la transferencia de la muestra al tubo de recogida. Mantener un volumen total de 20 μL entre la sonda y el colector.
    1. Deja un periodo de 20 minutos para que la muestra atraviese la sonda y la tubería y llegue al final de la tubería para su recogida a un caudal de 1 μL/min. Recoge un volumen adecuado para alcanzar la concentración requerida para el ensayo. Recoge 30 μL de diálisado por tubo de recogida.
  2. Almacenamiento de muestras: Preenfriar tubos de recogida de polipropileno de 0,5 mL a 4 °C. Inmediatamente después de la recogida, tapa los tubos, congela rápidamente en nitrógeno líquido durante 30 segundos y transfiere a un congelador a -80 °C en menos de 2 minutos.
  3. Muestra de referencia: Equilibrar completamente la muestra antes de iniciar la recogida. Recoger tres muestras por rata bajo anestesia para establecer una línea base de medición estable.
  4. Extracción de la sonda: Retirar la sonda de la cabeza del animal al completar la recogida de la muestra y colócala en un vial de almacenamiento que contenga heparina sodiosa al 1%. Eutanasia al animal inhalando un exceso de isoflurano.
  5. Conservación de la sonda: Enjuaga la sonda a fondo con solución salina y guárdala en un vial que contenga solución salina. Enjuaga los tubos con solución salina usando una jeringuilla para evitar el crecimiento microbiano. Reutiliza la sonda solo si mantiene un flujo suficiente y la membrana permanece intacta.

5. Análisis de datos

  1. Realizar análisis de componentes principales (PCA), análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) y análisis estadísticos adicionales utilizando MetaboAnalyst 6.0. Utiliza OPLS-DA específicamente para determinar la Importancia Variable en Proyección (VIP).
  2. Aplicar pruebas no paramétricas, incluyendo evaluaciones de valores P y análisis de cambio de pliegues, para examinar metabolitos diferenciales. Establezca umbrales críticos para el cribado de metabolitos diferenciales como VIP > 1, FC ≥ 2 o FC ≤ 0,5, y P < 0,05.
  3. Anota los metabolitos identificados utilizando la Base de Datos de Compuestos KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. Realizar cuantificación de metabolitos utilizando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo AB Sciex 6500+ equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) operada en modo de iones positivos.
  2. Ajustar los parámetros del instrumento de la siguiente manera: gas cortina, 40 psi; gas de colisión, 10 psi; gas fuente iónica 1 (GS1), 50 psi; gas fuente iónica 2 (GS2), 55 psi; voltaje de pulverización iónica, 4500 V; y la temperatura de origen, 550 °C.
  3. Operar el sistema en modo de monitorización de múltiples reacciones (MRM). Optimizar las transiciones MRM, los potenciales de desagrupamiento y las energías de colisión individualmente para cada metabolito. Realizar adquisición de datos usando el software Analyst 1.7.1 y análisis cuantitativo usando MultiQuant 3.0.3.
  4. Para la separación cromatográfica, se utiliza una columna C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) mantenida a 45 °C. Preparar las fases móviles como (A) 0,1% de ácido fórmico en agua y (B) 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo. Ajusta el caudal a 0,35 mL/min y el volumen de inyección a 6 μL. Mantén la temperatura del automuestreador a 4 °C antes del análisis.
    NOTA: En este estudio, cada partida duró aproximadamente 25 minutos en total.

Resultados

El conjunto de datos se normalizó aplicando transformaciones de suma y logarítmicas, y luego se sometió a un conjunto exhaustivo de análisis estadísticos. Se realizó un Análisis de Componentes Principales (PCA) (Figura 3A), que reveló separaciones distintas y destacó diferencias metabólicas. Posteriormente, se desarrolló un modelo de Análisis Discriminante de Mínimos Cuadrados Parciales Ortogonales (OPLS-DA), cuyas puntuaciones resultantes se muestran en la Figura 3B, demostrando la efectividad discriminatoria del modelo. En la evaluación de 618 metabolitos, los gráficos volcánicos comparando AISF y muestras de sangre identificaron 146 metabolitos diferenciales, con el líquido tisular que mostró metabolitos tanto bajos como alza (Figura 3C). Además, se creó un mapa de calor para ofrecer una visión comparativa de los 50 principales metabolitos diferenciales (Figura 3D).

Para evaluar la fiabilidad del método de muestreo, se utilizaron serotonina y ácido láctico como controles positivos que representan componentes del fluido tisular y la sangre, respectivamente. Los resultados coincidieron con los patrones de distribución establecidos de estos componentes en diversos fluidos corporales, como se ilustra en la Figura 4. La Figura suplementaria 1 muestra la estabilidad del lactato y la serotonina en las alícuotas de microdiálisis almacenadas a -80 °C.

Los 146 metabolitos diferenciales se clasificaron sistemáticamente en varias categorías: nucleósidos, nucleótidos y sus análogos; ácidos grasos y sus derivados; aminoácidos, péptidos y sus análogos; los carbohidratos y los conjugados de carbohidratos; ácidos orgánicos y sus derivados; aminas biogénicas; purinas y pirimidinas; vitaminas y esteroides; así como otros compuestos (Figura 5A). La Tabla Suplementaria 1 muestra metabolitos diferenciales detectados en sangre. Los análisis de mapas de calor aclaran aún más los patrones de enriquecimiento de aminas biogénicas y aminoácidos, péptidos y sus análogos a través de diversos fluidos corporales (Figuras 5B,C). El análisis de enriquecimiento diferencial de metabolitos se presenta en la Figura 6. La Tabla Suplementaria 2 muestra el coeficiente de variación (CV) para quince metabolitos seleccionados al azar en tres muestras consecutivas de tejido perivascular y fluido.

Figura 1
Figura 1: Imágenes del aparato experimental. (A) Colector de fracciones refrigerado. (B) Bomba de jeringuilla. (C) Microjeringas. (D) Instrumentos quirúrgicos, incluyendo tijeras vasculares y pinzas, etc. (E) Máquina de anestesia. (F) Sondas de microdiálisis. (G) Sondas de microdiálisis, aguja guía de tejido y un tubo rompible. (H) Conjuntos de agujas guía de tejido. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Los pasos clave del estudio. (A) Una representación esquemática que representa un diagrama que ilustra la posición del sitio quirúrgico y la orientación de la sonda. (B) Identificación de uniones vasculares críticas para asegurar una observación precisa de los sitios de colocación de la sonda. (C) Inserción de la aguja guía que penetra la piel y avanza hacia el espacio tisular. (D) Se retira la retracción de las agujas guía para alfiler, dejando el tubo rasgable dentro del tejido. (E) La sonda de microdiálisis se introduce en el tejido a través del canal establecido. (F) Retracción suave del tubo que se puede romper. El tubo rompible se retrae suavemente tras asegurar la sonda en su lugar. (G) Visualización de sondas posicionadas en el epitelio de los vasos femorales, arteriales y venosos. (H) Separación del tejido de la vena yugular. (I) Colocación de la sonda en la vena yugular. (J) La sonda de microdiálisis se fija en la superficie de la piel. (K) aislamiento de la vena yugular. (L) Inserción de la sonda en la vena yugular. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Análisis estadístico multivariante del líquido intersticial (ISF) y la sangre. (A) Los datos se han reducido para enfatizar separaciones significativas, demostrando diferencias claras entre ISF y componentes sanguíneos. (B) Las puntuaciones del modelo de análisis discriminante ortogonal parcial de mínimos cuadrados (OPLS-DA) indican valores R2Y y Q2 de 0,925 y 0,811, respectivamente. (C) El gráfico volcánico muestra 146 metabolitos diferenciales, con 85 metabolitos regulados a la baja y 61 regulados al alza en ISF. (D) Correspondientemente, los mapas de calor que contrastan los 30 principales metabolitos en ISF y sangre revelan una clara distinción entre los dos conjuntos de componentes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: La presentación de una serie de diagramas de caja aclaró los niveles de enriquecimiento de lactato y serotonina en ISF y sangre. Todos los puntos de datos representan la media ± SEM; Las barras de error se muestran para todos los paneles cuantitativos. El panel (A) ilustra que las muestras de ISF presentan un enriquecimiento significativamente mayor de lactato en comparación con las muestras de sangre. En contraste, el panel (B) demuestra que la serotonina está más enriquecida en muestras de sangre, que presentan simultáneamente niveles más bajos de lactato. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Se muestra el cuadro de anillos de clasificación de metabolitos diferenciales y el mapa térmico de aminoácidos, péptidos y análogos, así como aminas biogénicas. (A) Cada bloque de color corresponde a una clase distinta de metabolitos. Los aminoácidos, péptidos y análogos representan la categoría más grande, comprendiendo el 19,29% del total, seguidos de nucleósidos, nucleótidos y análogos (15%), ácidos grasos y derivados (12,86%), carbohidratos y conjugados de carbohidratos (7,86%), ácidos orgánicos y derivados (10%), aminas biogénicas (7,14%), purinas/pirimidinas (5,71%), vitaminas y esteroides (8,57%) y otros compuestos, incluyendo indoles, azepinas, piridinas y bencenos, con un 13,57%. (B) En el líquido intersticial (ISF), los niveles de enriquecimiento de compuestos como la desoxicarnitina y la espermidina dentro de la categoría de aminas biogénicas están significativamente elevados en comparación con los de la sangre, mientras que los niveles de serotonina (D4), serotonina, triptamina y compuestos relacionados se reducen significativamente. (C) En ISF, la mayoría de los metabolitos asociados a aminoácidos, péptidos y análogos son notablemente menores que los observados en sangre. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6
Figura 6: El análisis de enriquecimiento de conjuntos de metabolitos (MSEA) de líquido intersticial normal reveló que la actividad metabólica se distribuye predominantemente a través de vías relacionadas con la producción de energía, la homeostasis redox y la renovación de aminoácidos. Las vías más enriquecidas incluyen el metabolismo del butanoato, el metabolismo de las purinas y el metabolismo del glutatión, que reflejan el mantenimiento del suministro energético mitocondrial y la capacidad antioxidante bajo condiciones fisiológicas. Además, se representan varias vías relacionadas con aminoácidos, como el metabolismo de la arginina y la prolina, el metabolismo del triptófano y el metabolismo de la cisteína y la metionina, lo que indica la interconversión activa de aminoácidos y la regulación del equilibrio de nitrógeno en el microambiente extracelular. Estos hallazgos sugieren que el metaboloma intersticial normal mantiene un equilibrio dinámico entre procesos bioenergéticos, defensa oxidativa y metabolismo de aminoácidos, apoyando la homeostasis tisular y la estabilidad microcirculatoria. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Estabilidad del lactato y la serotonina en las alícutas de microdiálisis almacenadas a -80 °C. Los datos son una media ± SEM (n = 6 réplicas por punto temporal). Ningún analito se desvió >5% de la línea base durante 72 horas. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Metabolitos diferenciales detectados en la sangre y en el microdiálisis del líquido intersticial advential. Esto incluye el nombre del metabolito, el cambio de pliegue (FC), el valor P de la prueba t de Student y VIP (OPLS-DA). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Coeficiente de variación (CV) para quince metabolitos seleccionados al azar en tres muestras consecutivas de tejido perivascular y fluido. Todos los CVs son <20%. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El líquido intersticial (ISF) es el microambiente acuoso que envuelve cada célula tisular y constituye aproximadamente el 75% del compartimento extracelulardel fluido 8,9. Generado por filtración capilar del plasma, el ISF carece del contenido celular y de alto contenido proteico de la sangre, pero retiene electrolitos, solutos pequeños y agua9. Esta composición sitúa la ISF como la interfaz central entre los mundos vascular y celular. Funcionalmente, la ISF es un medio de transporte dinámico. Transporta oxígeno, glucosa, aminoácidos y micronutrientes del torrente sanguíneo a las células, mientras recoge simultáneamente dióxido de carbono, urea y otros desechos metabólicos para su regreso a lacirculación. El fluido también actúa como lubricante y amortiguador, estabilizando la presión osmótica intersticial, el pH y el equilibrioiónico 11. Más allá del metabolismo, la ISF apoya la vigilancia inmunitaria transportando leucocitos, anticuerpos y citocinas a través de espacios tisulares y actúa como una vía de comunicación para hormonas y señalesparacrinas 12,13. En comparación con la sangre, el ISF es esencialmente un filtrado libre de células y bajo contenidoproteico 14. La sangre, confinada al árbol vascular, contiene glóbulos rojos y blancos, plaquetas y altas concentraciones de albúmina y factores de coagulación. Los niveles de oxígeno y nutrientes son más altos en sangre y progresivamente más bajos en ISF debido a la captación celular, mientras que los residuos se acumulan en ISF antes de entrar en el retorno linfáticoo venoso 10. La ausencia de proteínas y células grandes en la ISF normal minimiza la presión oncótica y permite una rápida difusión, pero los estados inflamatorios pueden alterar este perfil de formatransitoria 15.

Sin embargo, el estudio de la ISF sigue siendo limitado debido a la ausencia de metodologías de muestreo sencillas, rápidas y fiables. Los métodos actuales incluyen parches de microaguja (MN), ampollas de succión, iontoforesis inversa, ablación térmica y microdiálisis. Los parches de MN crean microcanales para la extracción de ISF a través de la piel, con variantes de núcleo que extraen ISF en menos de 30 s y MNs hidrogel osmóticos en unos 3 minutos. Estos pueden combinarse con sensores para el análisis en el parche, pero están limitados por el volumen y requieren un equilibrio entre resistencia e hinchazón. Las ampollas de succión proporcionan ISF puro con mínima contaminación sanguínea, pero son invasivas, dolorosas ylentas 16,17,18. La iontoforesis inversa (RI) utiliza corrientes eléctricas bajas para transportar analitos cargados, como la glucosa y los iones de litio, a la superficie de la piel para un monitoreo no invasivo. Sin embargo, se enfrenta a desafíos como bajo rendimiento, variabilidad entre individuos y posible irritacióncutánea 19,20. La administración transdérmica (TA) interrumpe el estrato córneo con un calentamiento localizado para permitir que el ISF entre pasivamente en los microcanales hidrofílicos. Aunque el diseño del dispositivo es más sencillo, recoge menos de 5 μL de fluido, lo que requiere detección altamente sensible y una gestión térmica cuidadosa para evitarquemaduras 21,22. En contraste, la microdiálisis (DM), que se basa en la difusión a través de sondas semipermeables implantadas, ofrece una selectividad molecular única mediante membranas de corte de peso molecular ajustable (MWCO), como 10 kDa para glucosa y 100 kDa para proteínas ycitocinas 23,24. Esta técnica permite muestreo continuo y mínimamente invasivo. Sin embargo, la MD es operativamente complejo, requiere calibración in vivo y muestra tasas variables de recuperación para especies hidrofóbicas. Cabe destacar que la MD es la única técnica capaz de aislar por tamaño de grandes biomoléculas25. Estudios comparativos de diálisis recogidos adyacentes a la adventitis vascular frente a la sangre demuestran perfiles distintos de lactato y serotonina, validando así la estabilidad y especificidad del enfoque de la DM.

Estudios en animales han demostrado que, regulado sinérgicamente por el corazón y los pulmones, el ISF puede fluir en la adventicia asociada a arterias, venas y nervios periféricosgrandes 5,9. Normalmente, ISF contiene metabolitos que se derivan directamente del plasma y que se sintetizan localmente en lostejidos 26,27,28. Por tanto, es plausible que las superposiciones y diferencias identificadas de los metabolitos en la AISF y el plasma representen la implicación del sistema circulatorio de la ISF en el transporte y eliminación de nutrientes y metabolitos en los tejidos a lo largo de la vasculatura. La técnica basada en microdiálisis introducida aquí para el muestreo del AISF mejorará significativamente los estudios de la circulación sistémica del ISF en la regulación del metabolismo en múltiples órganos y tejidos de todo el cuerpo.

La membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 20 kDa utilizada en este estudio está diseñada de forma óptima para la recuperación cuantitativa de pequeños metabolitos, incluyendo glucosa, lactato, piruvato y aminoácidos. Sin embargo, consistentemente submuestra o excluye por completo numerosas macromoléculas biológicamente significativas, como citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y enzimas extracelulares. Las revisiones clínicas y metodológicas han destacado que los catéteres estándar de 20 kDa son eficaces para recoger pequeños metabolitos hidrofílicos, pero presentan bajas tasas de recuperación para proteínas y mediadoresinflamatorios 29. En consecuencia, son necesarias membranas con MWCOs más altos (por ejemplo, 100 kDa) o estrategias alternativas de muestreo para una cuantificación precisa decitocinas 30,31. Por lo tanto, futuras investigaciones realizadas por nuestro grupo emplearán membranas con MWCOs más grandes para caracterizar la composición macromolecular del fluido intersticial periférico. En este estudio, se recogieron diálisis bajo anestesia general. La microdiálisis ha sido validada previamente en animales despiertos y en movimiento libre, y varias técnicas de microperfusión de "flujo abierto" se han adaptado para su uso en modelosconscientes 32. Sin embargo, adaptar nuestro diseño de sonda y protocolo de implantación para su uso en animales despiertos requerirá abordar los desafíos relacionados con el anclajación, el estrés animal, la estabilidad de la sonda, los artefactos de movimiento y la patencia a largo plazo. Actualmente estamos en proceso de desarrollar un sistema ligero de giratorio de cable y planeamos realizar muestreos conscientes en nuestro estudio posterior.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés financieros que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2025YFC3507601) y los Fondos de Investigación Fundamental para los institutos centrales de investigación en bienestar público (Nº ZZ-YC2023007).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de monitorización ECGAD Instruments, AustraliaPowerLabEquipamiento
PinzasF.S.T. (Fine Science Tools) Alemania11252-00Instrumentos quirúrgicos
Heparina sódicaSigma-Aldrich, EE. UU.9041-08-1Material
Cromatografía líquida de alto rendimiento espectrómetro de masas en tándem (HPLC-MS/MS)SCIEX, EE. UU.ExionLC-20ACEquipamiento
Tijeras estándar IRISF.S.T. (Fine Science Tools) Alemania14060-09Instrumentos quirúrgicos
IsofluranoCiencias de la Vida de la Tracción Trasera, RPCR510-22-10Material
Sistema de anestesia de bajo flujoKent Scientific, EE. UU.SomnoSuiteEquipamiento
Fluido de perfusión de microdiálisis T1Microdiálisis CMA, SueciaP000034Material
Sonda de microdiálisis, 20 EliteMicrodiálisis CMA, Suecia8010436Material
Jeringuillas de microdiálisis 1 mL GastightMicrodiálisis CMA, Suecia8309020Material
Colector de fracciones refrigeradoMicrodiálisis CMA, Suecia470Equipamiento
Tubo partido para sondas CMA 20Microdiálisis CMA, Suecia8309019Material
Microscopio estereoscópicoOlympus, JapónSZ61Equipamiento
Bomba de jeringuillaCMA MD AB, Suecia800310Equipamiento

Referencias

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

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