El perfilado de RNA-seq de ganglios linfáticos drenantes y metastásicos en cáncer de mama HER2-positivo identifica POSTN como marcador pronóstico

Resumen

Revelamos un programa centrado en la matriz extracelular y PI3K-AKT subyacente a la diseminación de ganglios linfáticos en el cáncer de mama HER2-positivo e identificamos POSTN como un marcador de mal pronóstico, apoyando la estratificación de riesgos y estrategias terapéuticas dirigidas por vías.

Resumen

El cáncer de mama HER2-positivo es clínicamente agresivo y frecuentemente se disemina a ganglios linfáticos regionales, aunque los programas transcriptómicos asociados a la diseminación gandular siguen incompletamente definidos. Aquí, perfilamos ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) emparejados y ganglios linfáticos afectados por tumores metastásicos (TMLN) de seis pacientes con cáncer de mama HER2-positivo mediante secuenciación de ARN (RNA-seq). Se realizó un análisis diferencial de expresión con DESeq2, aplicando la corrección de Benjamini-Hochberg (FDR < 0,05) y un umbral absoluto log2 de cambio de fold (|log2FC| ≥ 1). Identificamos 237 genes expresados diferencialmente (182 regulados al alza y 55 a la baja en TMLN frente a TDLN). Los análisis de enriquecimiento funcional destacaron la interacción entre receptores de matriz extracelular (ECM), la señalización PI3K-AKT, la adhesión focal y el metabolismo del colesterol como vías destacadas asociadas a ganglios linfáticos metastásicos, sugiriendo una remodelación coordinada de la ECM y la activación de señalización durante la diseminación ganglional. Entre los genes más regulados al alza, POSTN emergió como un candidato clave y se vinculó además a características clinicopatológicas adversas. En una cohorte de validación independiente (n = 120), una mayor expresión de POSTN se asoció con una supervivencia libre de enfermedad inferior. En conjunto, estos resultados designan a POSTN como un posible biomarcador pronóstico y apoyan mecanismos centrados en la ECM y relacionados con PI3K-AKT como características biológicas accionables de la metástasis ganglionar en cáncer de mama HER2-positivo.

Introducción

El cáncer de mama (BC) es el cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres y una de las principales causas de mortalidad por cáncer a nivel mundial, con una carga considerable y creciente en China^. Aproximadamente entre el 15% y el 20% de los anticonceptivos son HER2-positivos (HER2+), caracterizados por amplificación/sobreexpresión de ERBB2 y un fenotipo agresivo con mayores riesgos de recurrencia y muerte ^2,3. Aunque la terapia sistémica anti-HER2 ha mejorado notablemente los resultados, una proporción considerable de pacientes sigue recayendo o desarrollando metástasis, lo que subraya la necesidad de una estratificación del riesgo biológicamente informada y nuevas opciones^{terapéuticas.}

La metástasis ganglionar (LNM) es un determinante fundamental de la estadificación, la selección del tratamiento adyuvante y el pronóstico en los anticonceptivos; La implicación axilar presagia una supervivencia inferior y facilita una mayor diseminación a órganos^{distantes 5,6}. Sin embargo, los biomarcadores robustos que capturan la biología de la propagación gandular en la enfermedad HER2+ siguen siendo limitados, y los factores clínicopatológicos actuales solo explican parcialmente la heterogeneidad^{de los resultados 7}.

Los avances en RNA-seq permiten un perfilado de alto rango dinámico a nivel transcriptoma y ahora están ampliamente adoptados en oncología^{traslacional.} Sin embargo, la mayoría de los estudios de expresión en HER2+ BC se centran en tumores primarios o cohortes no emparejadas, mientras que el perfilado comparativo de ganglios linfáticos drenadores tumorales (TDLN) y ganglios linfáticos tumorales metastásicos (TMLN) emparejados es escaso, limitando la comprensión de los programas moleculares que subyacen a la colonización y progresión^{gandular 9}.

Basándonos en la importancia clínica de la metástasis ganglional y en la evidencia previa que implicaba la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la activación de PI3K-AKT en la siembra^{metastásica 10}, planteamos la hipótesis de que, dentro del mismo paciente, los ganglios linfáticos tumor-metastásicos (TMLN) mostrarían un programa transcriptómico distinto en comparación con los ganglios linfáticos que drenan tumores (TDLN) emparejados, y que un subconjunto de genes asociados a ECM estarían consistentemente alterados a características clinicopatológicas adversas y Riesgo de recurrencia. Para poner a prueba esta hipótesis, perfilamos los pares de TDLN y TMLN de seis pacientes HER2 positivos para identificar genes diferencialmente expresados (DEGs) y vías asociadas con la diseminación nodal. Posteriormente priorizamos POSTN y evaluamos su relevancia pronóstica en una cohorte independiente, vinculando la remodelación de ECM y la señalización PI3K-AKT con una estratificación de riesgo clínicamente útil en el cáncer de mama HER2+. Aquí se proporcionan detalles de la evaluación HER2 (según los criterios contemporáneos ASCO-CAP), control de calidad de secuenciación, llamada DEG con DESeq2 y control Benjamini-Hochberg FDR, y procedimientos de validación^{aquí 11,12}.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el comité de ética institucional y realizado de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las normativas locales que regulan el uso de biomuestras humanas. Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Boai de Zhongshan (KY-2020-012-124). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de cualquier procedimiento específico del estudio.

Cohortes de estudio y muestras
La cohorte de descubrimiento comprendió tejidos emparejados de ganglios linfáticos drenantes tumorales (TDLN) y ganglios linfáticos metastásicos (TMLN) recogidos intraoperatoriamente de 6 pacientes con cáncer de mama HER2-positivo. Para cada paciente, el TDLN emparejado se definió como un ganglio linfático drenante sin evidencia histológica de metástasis y sirvió como comparador control dentro del paciente, mientras que el TMLN era tejido metastásico confirmado por patología. Los tejidos frescos se enjuagaban brevemente en solución salina fría amortiguada con fosfato (PBS), se secaban secos, se congelaban rápidamente en nitrógeno líquido en los 30 minutos posteriores a la escisión y se almacenaban a -80 °C hasta la extracción. Los criterios de inclusión fueron carcinoma invasivo de mama confirmado patológicamente, estado HER2-positivo según ASCO/CAP, disponibilidad de ganglios emparejados y ausencia de terapia neoadyuvante. Los criterios de exclusión fueron número de integridad inadecuada del tejido o ARN (RIN) < 7,0. Una muestra inicialmente cribada falló en la QC debido a RIN < 7,0 y fue excluida, por lo que todos los análisis de descubrimiento usan consistentemente n = 6. La cohorte independiente de validación comprendía 120 muestras de ganglios linfáticos FFPE de archivo con seguimiento clínico y se utilizó para qRT-PCR y análisis de resultados. Para la modelización pronóstica, los pacientes fueron comparados por grupos de expresión POSTN (Alto vs. Bajo, con un punto de corte determinado por la tesilla X), siendo el grupo Bajo el comparador de referencia. Los casos con seguimiento ausente o covariables incompletas fueron excluidos de la modelización pronóstica.

Justificación del tamaño de la muestra (Descubrimiento y validación)
La etapa de descubrimiento utilizó un diseño pareado TDLN-TMLN para maximizar el contraste dentro del paciente y reducir la varianza interindividual, controlando la multiplicidad en FDR = 0,05. Para la cohorte de validación (n = 120), la expresión POSTN se dicotomizó en el punto de corte determinado por la tesilla X (Alto/Bajo = 40/80). Dado 48 eventos de supervivencia libre de enfermedad (DFS) y α = 0,05, una aproximación de Schoenfeld indica ≥ 80% de capacidad para detectar razones de riesgo clínicamente relevantes de aproximadamente HR ≥ 2,3 bajo asignación igual; esto es coherente con el tamaño del efecto observado (HR = 2,31, IC 95% 1,41-3,77).

Definición de positividad en HER2
La positividad de HER2 siguió los criterios contemporáneos ASCO/CAP ¹³: inmunohistoquímica (IHC) 3+ definida como tinción uniforme e intensa de membrana en el >10% de las células tumorales, o hibridación in situ amplificada (ISH) definida como una relación HER2/CEP17 ≥2,0 con un número medio de copias HER2 ≥4,0 señales por célula. Los resultados de IHC 2+ se sometieron a ISH reflejo con recuento ciego de ≥20 células tumorales invasivas para confirmar el estado de amplificación.

Procesamiento de tejidos y aislamiento de ARN
Todos los procedimientos se realizaron sobre hielo salvo que se especificara, utilizando consumibles libres de RNasa. Para cada muestra con ≤ tejido de 100 mg, se realizó la homogeneización en 1 mL de reactivo ácido guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo (AGPC), seguida de la adición de 200 μL de cloroformo con una mezcla vigorosa de 15 s y una incubación a temperatura ambiente de 2-3 minutos. La separación de fases se logró mediante centrifugación a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. La capa acuosa se transfirió entonces a un tubo fresco y se precipitó ARN con 500 μL de isopropanol tras una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. El pelletado se completó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El pellet se lavó con 1 mL de etanol al 75% y se centrifugó a 7.500 x g durante 5 minutos a 4 °C, se secó al aire durante 5-10 minutos y se disolvió en agua libre de RNasa. Se utilizó una digestión de DNasa I en columna cuando se sospechaba que había retención genómica de ADN. Los puntos de control visuales incluyeron separación clara de fases tras la extracción con cloroformo y un pellet translúcido intacto tras la precipitación de isopropanol. La solución de problemas incluyó repetir el lavado con etanol para proporciones bajas de A260/230 y extender la precipitación o asegurar el enfriamiento durante el pelletado para obtener bajos rendimientos.

Control de calidad de ARN
La cuantificación utilizó espectrofotometría para monitorizar A260/280 y A260/230 con objetivos alrededor de 1,8-2,1, complementados por mediciones fluorométricas para mayor precisión. Se evaluó la integridad en un sistema de electroforesis microfluídica y requirió un RIN ≥ 7.0. Se utilizaron picos distintos de 18S/28S rRNA y la ausencia de una citología genómica de ADN como criterios de aceptación; Los umbrales de fallo de las muestras se reextrajeron o excluyeron.

Preparación de la biblioteca
Se construyeron bibliotecas de ARNm atrapados con selección de poli(A) para ARN intacto, mientras que se permitió el agotamiento de ARNr para entradas parcialmente degradadas. La entrada típica era ≥ 1 μg de ARN total por biblioteca. La fragmentación se realizó cerca de 94 °C durante 8 minutos; síntesis de ADNc de primera cadena a 50 °C durante 50 minutos; síntesis de segunda cadena a 16 °C durante 60 minutos; ligación de adaptador a 20 °C durante 15 minutos; y la amplificación por PCR utilizaba 10-12 ciclos ajustados para evitar la sobreamplificación. Las limpiezas empleaban relaciones de perlas cercanas a 0,8x-1,0x, y la distribución esperada del tamaño de la biblioteca era de 300 pb, incluyendo adaptadores. La calidad de la biblioteca se verificó mediante electroforesis microfluídica; La contaminación por adaptadores y dímeros provocó una limpieza más estricta, y las distribuciones excesivamente amplias de tamaño se corrigieron acortando modestamente la fragmentación.

Secuenciación
Las bibliotecas indexadas se secuenciaban en modo de extremo emparejado de 150 bp (PE150), con un objetivo de 30 millones de pares de lectura por biblioteca. La calidad a nivel de partida requería Q30 ≥ 90% y densidades estables de clúster con un sesgo mínimo de carril. Las bibliotecas se distribuyeron aleatoriamente entre carriles para mitigar los efectos por lotes, y ejecutar registros, documentar asignaciones de carriles y cualquier control centinela utilizado para monitorizar la contaminación cruzada.

Análisis computacional y expresión diferencial
Los análisis se realizaron en R (v4.3.2) en Linux. La calidad de la lectura en bruto se evaluó con FastQC (v0.11.9). El recorte de adaptadores y calidad se realizó con fastp (v0.23.4) usando detección automática de adaptadores, recorte de ventanas deslizantes (tamaño de ventana 4 pb; media Phred Q ≥ 20), una longitud mínima de lectura de 50 pb, y recorte poli-G cuando se detectaban las químicas relevantes. Las lecturas se alinearon al genoma de referencia GRCh37/hg19 usando HISAT2 (v2.2.1) con parámetros de cadena apropiados para la biblioteca e índices conocidos del sitio de empalme. Los conteos a nivel de gen se generaban con featureCounts (Subread v2.0.3) frente a GENCODE v19 usando conteo de extremos emparejados, manejo de lecturas quiméricas, ajustes multi-mapper y la bandera correcta de cadenas. Los genes de bajo conteo se filtraron requiriendo conteos ≥ 10 en al menos tres muestras. El análisis de expresión diferencial (DE) se realizó utilizando DESeq2 (v1.40.2) bajo un diseño emparejado (diseño = ~ par + condición) para comparar TMLN frente a TDLN, con normalización por factor de tamaño por defecto y contracción por cambio de pliegue log2 mediante apeglm. Los posibles valores atípicos se evaluaron usando la distancia de Cook. La multiplicidad a nivel de transcriptoma se controló utilizando la tasa de falsos descubrimientos de Benjamini-Hochberg (FDR). La significancia se definió como FDR < 0,05 y un umbral absoluto log2 de cambio de pliegue (|log2FC|) ≥ 1. El marco binomial negativo de DESeq2 proporciona un modelado medio-varianza adecuado para los datos de recuento y estabiliza estimaciones de cambio de plegamiento en cohortes pequeñas a moderadas. Como análisis de sensibilidad, volvimos a ejecutar pruebas de DE usando edgeR y limma-voom con los mismos criterios de filtrado y umbrales FDR, lo que produjo señales concordantes de primer nivel, apoyando la robustez de las principales opciones de análisis.

Enriquecimiento funcional (GO y KEGG)
La anotación funcional se realizaba en R usando clusterProfiler (v4.8.3). Los DEGs regulados al alza y a la baja se analizaron por separado. Los identificadores génicos se asignaron a identificadores génicos de Entrez (organismo: Homo sapiens) antes del enriquecimiento. El enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) se realizó utilizando enrichGO (OrgDb: org. Hs.eg.db; ONT = BP/CC/MF; pAdAjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05), y el enriquecimiento de vías KEGG se realizó usando enrichKEGG (organism = "has"; pAdajustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05). El universo de fondo se definió como todos los genes expresados retenidos tras el filtrado de bajo recuento en el análisis de ED. Los términos enriquecidos se filtraron adicionalmente para conservar conjuntos génicos con 10-500 genes anotados (minGSSize = 10; maxGSSize = 500). Las visualizaciones se generaron usando ggplot2 (v3.5.1) y ComplexHeatmap (v2.16.1), incluyendo gráficos de puntos de la proporción génica y valores de -log10 (ajustado P); el término "vías de respuesta inmune" se refiere a módulos GO curados que cubren el procesamiento y la presentación de antígenos, la señalización de interferón y la activación de linfocitos.

Interrogatorio externo de bases de datos
Los genes candidatos fueron interrogados en recursos externos para proporcionar contexto ortogonal. Se consultó la expresión tumor frente a ARNm normal utilizando GEPIA2 (v2.0) con muestras de tumor de carcinoma invasivo de mama TCGA (TCGA-BRCA) comparadas con tejidos mamarios normales (normales GTEx/TCGA, según esté disponible). Se utilizaron valores de expresión reportados por GEPIA2 (log2[TPM+1]) y su marco estadístico predeterminado para comparaciones de grupos para generar diagramas de caja y valores P para cada gen consultado. La localización a nivel de proteína se evaluó utilizando el Atlas de Proteínas Humanas (HPA) revisando imágenes inmunohistoquímicas y anotaciones del Atlas de Tejidos y del Atlas de Patología para tejido mamario/cáncer, y registrando la intensidad de tinción reportada y el compartimento celular (por ejemplo, estromal frente a epitelial) cuando estaban disponibles.

Validación qRT-PCR
Se procesaron tejidos ganglios linfáticos independientes como se mencionó anteriormente para extraer ARN total, y se sintetizó ADN a partir de 1 μg de ARN en reacciones de transcripción inversa de 20 μL. La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizó utilizando química basada en SYBR, con cada reacción conteniendo 1x mezcla maestra y 0,2-0,4 μM de cada ceba. La especificidad del cebador se confirmó mediante perfiles de curva de fusión de pico único, y la eficiencia de amplificación se evaluó utilizando curvas estándar en serie de dilución, con eficiencias aceptables definidas entre el 90% y el 110%. Cada muestra se analizaba en triplicado técnico; las réplicas debían cumplir con un umbral de ciclo (Ct) SD ≤ 0,3. La expresión génica se normalizó a GAPDH (u otro gen de referencia validado, cuando correspondía), y la expresión relativa se calculó mediante el método 2^-ΔΔCt. La normalidad se evaluó mediante pruebas de Shapiro-Wilk; las comparaciones entre grupos usaron pruebas t bilaterales para datos aproximadamente normales o pruebas U de Mann-Whitney en otros casos.

Análisis pronóstico en la cohorte de validación
La supervivencia libre de enfermedad (DFS) fue el objetivo principal y se calculó desde la fecha de la cirugía hasta el primer evento de recurrencia documentado o el último seguimiento (censurado). Para el análisis primario, la expresión de POSTN se dicotomizó en el punto de corte determinado por la loseta X (Alto vs Bajo = 40/80); Los análisis de sensibilidad utilizaban puntos de corte alternativos como los tertiles. Se utilizaron curvas de Kaplan-Meier y pruebas logarítmicas para comparaciones univariables. Se ajustaron modelos de riesgos proporcionales de Cox multivariables para estimar razones de riesgo (HR) e intervalos de confianza del 95%, ajustando a priori por edad, tamaño tumoral, estado ganglionar, grado histológico y estado del receptor. La suposición de riesgos proporcionales se evaluó utilizando residuos de Schoenfeld, se examinó la colinealidad usando factores de varianza-inflación, y las observaciones influyentes se evaluaron usando dfbetas. Se realizaron análisis completos de casos tras excluir los casos con seguimientos faltantes o covariables incompletas, como se describió anteriormente.

Estadísticas generales e informes
Salvo que se indique lo contrario, los datos se resumen en media ± DS o mediana (IQR), se utilizan pruebas bilaterales y p < 0,05 se considera estadísticamente significativo. Para análisis y enriquecimiento a nivel transcriptoma, la multiplicidad se controla con BH-FDR, y los tamaños de efecto se acompañan de intervalos de confianza del 95% siempre que sea factible.

Seguridad y eliminación de residuos
Los reactivos de fenol-guanidinio y disolventes orgánicos se manipulaban en una campana extractora certificada con batas de laboratorio, guantes de nitrilo y protección contra salpicaduras. Los residuos orgánicos y halógenos se segregaron en recipientes etiquetados y se eliminaron conforme a las políticas institucionales. Los residuos biológicos se autoclavaron o desinfectaron químicamente antes de su eliminación, y las superficies y herramientas se descontaminaron con soluciones inactivadoras de RNasa. Peligros específicos de los reactivos, como la corrosividad y la toxicidad, fueron documentados en los procedimientos estándar estándar de laboratorio y observados durante todos los procedimientos.

Resultados

Cohortes y características clinicopatológicas
La cohorte de descubrimiento consistió en 6 muestras emparejadas de TDLN/TMLN, y la cohorte de validación comprendió 120 muestras de ganglios linfáticos de archivo con seguimiento longitudinal. Las características clinicopatológicas basales para ambas cohortes, incluyendo edad, tamaño tumoral, grado, estado receptor y estado ganglionar, se resumen en la Tabla 1.

Calidad de secuenciación y estructura glob...

Discusión

El cáncer de mama HER2-positivo se caracteriza por una mayor invasividad, frecuentes metástasis ganglionadas (LNM) y resultados inferiores a pesar de la terapia sistémica^{moderna 15}. Los factores clínicopatológicos convencionales solo explican parcialmente el pronóstico en este subtipo, dejando un hueco para marcadores biológicamente fundamentados que capturen el riesgo de diseminación^{gandular 16}. Mediante el perfilado comparativo d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bioanalizador	2100-BA	Agilent, EE. UU.	Equipos para evaluar la integridad del ARN y el control de calidad.
DESeq2	N/A	R Bioconductor	Software de análisis de expresión diferencial para datos de RNA-seq.
FastQC Software	N/A	Babraham Bioinformática	Software de control de calidad para datos de RNA-seq para evaluar la calidad de la secuencia.
Línea celular HEK293	ATCC-CRL-1573	ATCC, EE. UU.	Línea celular embrionaria de riñón humana utilizada para experimentos de transfección.
Kit qRT-PCR	4385616	ThermoFisher, EE. UU.	Kit cuantitativo de PCR para validar la expresión génica.
Kit de extracción de ARN	74204	Qiagen, Alemania	Kit de extracción de ARN utilizado para aislar ARN de alta calidad de muestras de tejido.
Kit de secuenciación de ARN	RS-122-2001	Illumina, EE. UU.	Kit de preparación de biblioteca de ARN para secuenciar muestras de ARN.
Plataforma de secuenciación	NovaSeq 6000	Illumina, EE. UU.	Plataforma de secuenciación de ARN de alto rendimiento para secuenciar bibliotecas de ARN.
Equipos de congelación de tejidos	TFE-300	Thermo Fisher, EE. UU.	Equipo para congelar muestras de tejido en nitrógeno líquido.
Termómetro timpánico	55678-TT	ThermoScience, Japón	Termómetro preciso utilizado para medir la temperatura corporal.