Efectos de los polisacáridos de Cordyceps en la senescencia renal inducida por D-Galactosa

Resumen

Se estableció un modelo de senescencia en ratones y células HK-2 utilizando D-galactosa. Se evaluaron los efectos de los polisacáridos de Cordyceps (CCP) sobre el envejecimiento renal utilizando western blot e inmunofluorescencia, evaluando los cambios mitocondriales mediante la detección de especies reactivas de oxígeno y la tinción con JC-1.

Resumen

La enfermedad renal crónica (ERC) supone una preocupación significativa para la salud global. El envejecimiento de las células epiteliales tubulares renales (RTECs) dificulta la regeneración y reparación renal y promueve la progresión de la ERC mediante la liberación del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP). Cordyceps sinensis, cuyos principales componentes bioactivos incluyen Cordyceps polisacáridos (CCP), está incorporado en múltiples preparaciones clínicas para la ERC y ha demostrado beneficios terapéuticos. Para examinar el papel de la CCP en el envejecimiento renal, se estableció un modelo de senescencia renal inducida por D-galactosa en ratones, con la administración de CCP como intervención. Los resultados del tratamiento se evaluaron mediante tinción relacionada con la senescencia y valoraciones de la función renal. Se estableció además un modelo de envejecimiento inducido por D-galactosa en células HK-2 para investigar los mecanismos celulares subyacentes. Se utilizaron tinciones con JC-1 y detección de especies reactivas de oxígeno (ROS) para evaluar los cambios mitocondriales tras el tratamiento con CCP en condiciones senescentes. Se realizaron inmunofluorescencia, western blot y PCR cuantitativa (RT-PCR) para evaluar los efectos del CCP sobre la fosforilación de MAPK, la translocación nuclear NF-κB y la activación del inflamosoma NLRP3. Los resultados muestran que el CCP atenúa la senescencia de las células tubulointersticiales, la lesión renal y la fibrosis, mientras mejora la función mitocondrial tanto en modelos celulares como animales de senescencia inducida por D-galactosa. Estos efectos están asociados con la modulación de la vía de señalización ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3.

Introducción

La enfermedad renal crónica (ERC) es uno de los trastornos renales más comunes y afecta a una gran población en todo el mundo. Su aparición está estrechamente asociada con el envejecimiento¹. Los túbulos renales son las unidades funcionales principales del riñón, y la senescencia celular dentro de las células epiteliales tubulares renales (RTECs) es un factor importante en el deterioro funcional^{renal 2}. La exposición a fármacos y otros factores estresantes pueden inducir senescencia asociada al estrés tubular, lo que conduce a una pérdida progresiva de la función renal y eventual progresión hacia la enfermedad renal terminal (ECK). Por lo tanto, dirigirse a la senescencia en los RTEC puede ser una estrategia eficaz para retrasar el envejecimiento renal y prevenir o tratar la ERC.

La inflamación crónica es una característica distintiva de la edad^{de 3} años y un factor importante en muchas enfermedades relacionadas con la edad. Las citocinas proinflamatorias liberadas por las células senescentes se conocen colectivamente como el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP⁾⁴. El SASP promueve una inflamación sostenida, induce la senescencia en las células vecinas y contribuye al declive funcional^{progresivo 5}. El modelo de senescencia inducida por D-galactosa (D-gal) es uno de los modelos experimentales de envejecimiento más utilizados. Estudios previos han demostrado que el tratamiento con D-gal conduce a la acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS), disfunción mitocondrial, alteración de la homeostasis redox e inducción de la senescencia celular^{relacionada con el estrés 6}. En comparación con los modelos naturales de envejecimiento, que requieren mucho tiempo y presentan una alta variabilidad interindividual, el modelo inducido por D-galactosa ofrece ventajas como la simplicidad, la inducción rápida y una variabilidad intra-grupo relativamente baja. Este modelo es aplicable tanto a estudios in vivo como in vitro. Aunque no recapitula completamente el envejecimiento natural lento y libre de patologías, es muy adecuado para modelar la senescencia renal, dada la alta actividad metabólica del riñón y su susceptibilidad al estrés oxidativo. Desde una perspectiva mecanicista, la D-galactosa promueve la senescencia celular principalmente mediante el estrés oxidativo, coherente con investigaciones centradas en la generación de ROS y la disfunción mitocondrial durante el envejecimiento.

Cordyceps sinensis es un hongo medicinal tradicional chino ampliamente utilizado en el tratamiento de enfermedades relacionadas con los^{riñones 7}. Contiene múltiples componentes bioactivos, incluyendo polisacáridos, adenosina, aminoácidos, cordicepina y ergosterol. Los extractos y preparados fermentados de Cordyceps sinensis presentan propiedades antiinflamatorias, antioxidantes y antienvejecimiento 8,9,10,11. Por ejemplo, se ha demostrado que los polisacáridos de Cordyceps reducen la infiltración inflamatoria en un modelo murino para asma al inhibir la vía de señalización TGF-β1/^{Smad 12}. Además, los polisacáridos de Cordyceps pueden suprimir la fosforilación de las vías MAPK y reducir la expresión de citocinas inflamatorias como IL-6 e IL-1β en las células RAW264.7¹³. Estudios previos han demostrado que los polisacáridos de Cordyceps (CCP), el principal componente bioactivo de Cordyceps sinensis, pueden atenuar la senescencia en las células epiteliales tubulares renales al regular la autofagia y suprimir la producción de SASP. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales el PCC contrarresta el daño mediado por ROS siguen siendo incompletos y caracterizados.

El presente estudio investiga los efectos protectores del PCC frente al envejecimiento renal en ratones y examina sus efectos sobre la inflamación, el estrés oxidativo y la senescencia utilizando un modelo inducido por D-galactosa del envejecimiento celular epitelial tubular renal. Exploramos además si el CCP modula la producción de ROS, la función mitocondrial y las vías de señalización posteriores, incluyendo la fosforilación de MAPK, la translocación nuclear de NF-κB y la activación del inflamosoma de NLRP3. En conjunto, este trabajo pretende proporcionar evidencia experimental que respalde el uso del CCP en estudios sobre la senescencia renal y la lesión renal relacionada con la edad. El flujo de trabajo experimental general y el mecanismo propuesto se resumen en la Figura 1.

Protocolo

Todos los procedimientos animales se llevaron a cabo conforme a las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Nankín (Aprobación Ética Nº 202108A006). Todos los residuos generados durante los procedimientos de cultivo celular y tinción se recogían en recipientes sellados y bolsas de biohazard y se eliminaban por un servicio autorizado de gestión de residuos médicos.

Modelos animales e intervenciones terapéuticas

Para minimizar la variación interindividual, se asignaron aleatoriamente a 40 ratones en cinco grupos (n = 8 por grupo) y se sometieron a las siguientes intervenciones: (1) Grupo control: Recibió administración intragástrica de 0,2 mL de solución salina por ratón; (2) Grupo modelo: Recibió inyecciones subcutáneas diarias de D-galactosa (250 mg/kg), administradas en 0,2 mL de una solución de 25 mg/mL por ratón; (3) Grupo CCP de dosis bajas: Recibió inyecciones de D-galactosa combinadas con administración intragástrica de CCP a 50 mg/kg (0,2 mL de una solución de 5 mg/mL por ratón); (4) Grupo CCP de dosis altas: Recibió inyecciones de D-galactosa combinadas con administración intragástrica de CCP a 100 mg/kg (0,2 mL de una solución de 10 mg/mL por ratón); (5) Grupo de vitamina E: Recibió inyecciones de D-galactosa combinadas con administración intragástrica de vitamina E a 100 mg/kg (0,2 mL de una solución de 10 mg/mL por ratón). Tras 8 semanas de tratamiento, se sacrificaron ratones y se recogieron muestras de suero, orina y tejido renal para análisis posteriores.

Análisis de la función renal

La función renal se evaluó utilizando kits comerciales de análisis para medir la creatinina, el ácido úrico y la proteína urinaria según las instrucciones del fabricante. Los valores de absorbancia se midieron en 505 nm para la creatinina, 510 nm para el ácido úrico y 585 nm para la proteína urinaria utilizando un lector de microplacas multifunción.

Tinción en secciones tisulares

Los tejidos renales incrustados en parafina se seccionaron con un grosor de 4 μm. Las secciones se desparafinizaron, incubaron con hematoxilina durante 5 minutos, se enjuagaron con agua corriente, se diferenciaron usando alcohol ácido al 1% durante 5 segundos y se enjuagaron de nuevo. Tras un lavado de suero salino tamponado con fosfato (PBS) de 1 minuto, las secciones se contra-teñieron con eosina durante 3 minutos, se deshidrataron y se montaron. Para la tinción tricroma de Masson, las secciones se desparafinizaron y teñieron con hematoxilina como se ha descrito antes, seguidas de Ponceau S durante 5 minutos y azul anilina durante 5 minutos. Luego se deshidrataron secciones y se montaron.

Ensayo de viabilidad celular

Las células HK-2 se sembraron en placas de 12 pozos a 1 × 10⁵ células por pozo. Tras una exposición de 24 horas a D-galactosa y polisacáridos de Cordyceps, se añadió un 10% de solución de CCK-8 a cada^{pozo 14}. Tras la incubación a 37 °C durante 30 minutos, se registró la absorbancia a 450 nm usando un microlector de placas. La documentación de control de calidad para polisacáridos de Cordyceps y la autenticación STR de las células HK-2 se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa por transcripción inversa

Tras 24 horas de cultivo celular, se retiró el medio de cultivo y se extrajo ARN total utilizando el reactivo de extracción. La concentración de ARN se determinó mediante un espectrofotómetro de microplacas, y la integridad del ARN se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Se eliminó ADN genómico y se sintetizó el ADNc mediante transcripción inversa. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla de Materiales.

Medición de los niveles intracelulares de ROS

Las células HK-2 se sembraron en placas de 12 pozos a 1 × 10⁵ células por pozo. Al alcanzar una confluencia del 60-70%, las células recibieron un pretratamiento con D-galactosa durante 12 horas. Tras 24 horas de exposición al fármaco, se descartó el medio y se enjuagaron las células una vez con PBS. Se detectó una ROS intracelular por incubación con una sonda fluorescente sensible a ROS a 37 °C durante 20 minutos, y se capturaron imágenes de fluorescencia a longitudes de onda de excitación/emisión de 488/525^{nm 15}.

Western blot

Las proteínas celulares se lisaron usando tampón RIPA y se clarificaron por centrifugación a 13.000 × g durante 15 minutos a 4 °C. Las proteínas se desnaturalizaron hirviendo durante 10 minutos, y se sometieron cantidades iguales de proteína (20 μg por muestra) a separación electroforética y se transfirieron a las membranas PVDF. Tras bloquear durante 1 hora, las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios. Los lavados posteriores de PBST fueron seguidos por incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, y la detección se realizó utilizando un sustrato de quimioluminiscencia (ECL)^{mejorada 16}. Los detalles de los anticuerpos e identificadores de los reactivos se enumeran en la Tabla de Materiales.

Tinción de senescencia SA-β-gal

Las celdas HK-2 se enchaparon en placas de 12 pozos con una densidad de 1 × 10⁵ celdas por pozo. Cuando las células alcanzaron una confluencia del 60-70%, se pretrataron con D-galactosa durante 12 horas. Se realizó tinción de SA-β-gal según el protocolo del fabricante, y se observaron las células teñidas mediante un microscopio^{óptico 17}.

Medición del potencial de membrana mitocondrial

El potencial de membrana mitocondrial se evaluó utilizando la sonda fluorescente JC-1 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se detectaron monómeros de JC-1 en longitudes de onda de excitación/emisión de 490/530 nm, mientras que los agregados de JC-1 se detectaron a 525/590 nm. Se adquirieron imágenes observando señales claras de fluorescencia roja o verde.

Análisis estadístico

Los datos se presentaban como diagramas de barras o puntos y se analizaban utilizando el software de referencia. Las intensidades de las bandas western blot se cuantificaron usando ImageJ. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) con pruebas t posteriores para comparaciones entre grupos. La significación estadística se definió como un valor P < 0,05. Los símbolos indican comparaciones con el grupo de control (*) o el grupo D-gal (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Resultados

Se utilizó la D-galactosa para establecer un modelo de senescencia en ratón, con la vitamina E como control positivo anti-senescencia comúnmente utilizado. Los ratones senescentes fueron tratados con diferentes dosis de Cordyceps polisacáridos (CCP). Los ratones envejecidos mostraron insuficiencia renal significativa, como se evidencia por el aumento de proteínas urinarias, ácido úrico sérico y niveles de creatinina (Figura 2B-D). Tanto la s...

Discusión

Este estudio demuestra los efectos protectores de los polisacáridos de Cordyceps sobre las células epiteliales tubulares renales y aporta evidencia de que atenúan la senescencia inflamatoria en las células HK-2 al modular la vía de señalización ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3. Estos hallazgos aclaran aún más los posibles mecanismos subyacentes a los efectos de los compuestos derivados de Cordyceps sinensis en el tratamiento de enfermedades renales agudas y ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Casepasa1/PAb de conejo cortado	WL03450	Wanlei, Shengyang, China
CCK-8 Kit	C0037	Biyotime, Shanghái, China
CCP	B21296	Yuanye Bio, Shengyang, China
Kit de prueba de creatinina	C011-2-1	Jiancheng, Nankín, China
D-gal	HY-N0210	MCE, EE. UU.
ERK Rabbit pAb	4695	CST, EE. UU.	AB_390779
Gapdh Rabbit pAb	AC033	Abclonal, Wuhan, China
H & Kit de tinción E	G1120	Solarbio, Pekín, China
JC-1 Kit	C2003S	Biyotime, Shanghái, China
Kit de tinción de Masson	G1340	Solarbio, Pekín, China
NLRP3 Rabbit pAb	WLH3383	Wanlei, Shengyang, China
P21 Rabbit pAb	64016s	CST, EE. UU.	AB_2892063
p38 Rabbit pAb	9212	CST, EE. UU.	AB_330713
p50 PAb de conejo	3035	CST, EE. UU.	AB_330564
p65 Rabbit pAb	8242	CST, EE. UU.	AB_10859369
p-ERK Rabbit pAb	4370	CST, EE. UU.	AB_2315112
Fosfo-SAPK/JNK mAnticuerpo	4668	CST, EE. UU.	AB_823588
p-p38 Rabbit pAb	4511	CST, EE. UU.	AB_2139682
Kit de teñido ROS	S0033S	Biyotime, Shanghái, China
Anticuerpo SAPK/JNK	9256	CST, EE. UU.	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Biyotime, Shanghái, China
Kit de prueba de ácido úrico	C012-2-1	Jiancheng, Nankín, China
Kit de detección de proteínas urinarias	C035-2-1	Jiancheng, Nankín, China
Vitamina E	S27812	Yuanye Bio, Shengyang, China
Introducción para PCR
Nombre del gen	Forward Primer	Imprimador inverso
Caspasa-1	5'-TACAGAAGGGTGCTGAACAA-3'	5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
GAPDH	5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'	5'-AAAGGTGGAGGAGTGTGTGTCG-3'
NLRP3	5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'	5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'