Curación mejorada por parche electromagnético flexible de heridas cutáneas de grosor completo en ratas

Resumen

Este protocolo demuestra un método para crear heridas circulares de piel de grosor completo en ratas y mejorar su cicatrización mediante un parche flexible de cobre que proporciona un campo electromagnético pulsado.

Resumen

Las heridas cutáneas crónicas y grandes presentan desafíos clínicos significativos debido a la cicatrización retrasada y al alto riesgo de infección. La terapia de campo electromagnético pulsado (PEMF) es un enfoque no invasivo que puede favorecer la reparación tisular. Este estudio describe un protocolo reproducible de modelo de herida de rata utilizando un parche flexible impreso de cobre conectado a un controlador de PCB personalizado para proporcionar estimulación PEMF localizada a heridas dorsales de grosor completo. La herida contralateral sirvió como control sin tratar. La progresión de la cicatrización se evaluó mediante fotografías regulares y mediciones de la zona de la herida. El protocolo proporciona un sistema práctico y adaptable para evaluar y optimizar terapias basadas en PEMF in vivo en diversas condiciones, con un enfoque en la aplicación localizada y el ajuste de parámetros para la medicina regenerativa. La selección de parámetros se basó en una pantalla ortogonal CCK-8 de proliferación de fibroblastos que evaluó 0,25-1,3 mT, 10-40 Hz y 30-90 min/día; el análisis de efectos principales identificó 1,3 mT, 30 Hz y 60 min/día como los niveles óptimos, que se adoptaron para las pruebas in vivo .

Introducción

Las heridas cutáneas crónicas (como las úlceras diabéticas) son una preocupación de salud creciente, lo que a menudo conduce a una cicatrización deteriorada, infección o^{amputación 1}. Los tratamientos tradicionales pueden ser prolongados y costosos, lo que genera interés en terapias complementarias que pueden acelerar la reparación^{tisular 2}. La terapia de campos electromagnéticos es uno de estos enfoques, que es no invasivo y ha demostrado efectos pro-curativos tanto en entornos preclínicos como^{clínicos 2,3,4,5}. Los campos electromagnéticos pulsados (PEMF) en el rango de frecuencias extremadamente bajas (~1-100 Hz) pueden estimular procesos celulares importantes para la reparación, incluyendo la angiogénesis y la liberación de factores^{de crecimiento 2,6,7}.

Por ejemplo, la exposición a PEMF aceleró significativamente el cierre de heridas en roedores diabéticos y sanos al aumentar el factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2) y aumentar la angiogénesis⁸. De manera similar, en el modelo de cicatrización deteriorada (por ejemplo, ratas diabéticas), se ha demostrado que el tratamiento con PEMF mejora las tasas de curación y aumenta la resistencia a la tracción del tejido recién^{formado 9}. Clínicamente, la terapia PEMF se ha explorado en pacientes con heridas crónicas. Un ensayo piloto aleatorizado en pacientes con úlcera diabética en el pie informó de un aumento del flujo sanguíneo microcirculatorio y una tendencia hacia un cierre más rápido de la herida bajo exposición a^{PEMF 10}. En general, el PEMF también ha mostrado efectos beneficiosos en otros tipos de heridas; por ejemplo, se observó una mejora en la cicatrización en quemaduras tratadas con campos magnéticos^{pulsados 11}. Estos estudios subrayan colectivamente el potencial de la estimulación electromagnética como terapia complementaria para el cuidado de^heridas 8,9,10,11.

En comparación con los estimuladores convencionales con cable, la actuación magnética elimina la necesidad de conectores transcutáneos y reduce el riesgo de complicaciones relacionadas con el hardware. Los sistemas magnéticos inalámbricos han logrado estimulación específica de tejido en otros contextos, por ejemplo, un conducto de guía nerviosa conductor puede generar microcorrientes inducidas bajo un campo magnético alterno, con la amplitud de la corriente determinada indirectamente por los parámetros^{del campo 12}. Las estrategias magnéticas también pueden apoyar la vascularización —un cuello de botella crítico en la cicatrización de la piel— porque se ha demostrado que los campos magnéticos estáticos o dinámicos, solos o en combinación con biomateriales magnéticamente sensibles, modulan el comportamiento endotelial y la señalización^{angiogénica 13}. Estos precedentes motivaron nuestro desarrollo de un enfoque wearable: un parche de bobina conforme, extraíble, que concentra PEMF en el lecho de la herida mientras preserva la no invasividad y la programabilidad^{externa 12,13}. En el siguiente protocolo, detallamos los pasos para implementar esta terapia PEMF en un modelo de herida de espesor completo en rata, incluyendo la aplicación del dispositivo, el régimen de estimulación y la evaluación de resultados.

Protocolo

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Jiangnan (JN. Nº 2025-0630S0360-915[408]). Implementamos el protocolo usando ratas SD machos (6-8 semanas, aproximadamente 200-250 g). Antes de la experimentación, las ratas eran alojadas individualmente con acceso libre a comida y agua, manteniéndose en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad, de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Creación de heridas excisionales de espesor completo

1. Prepara el campo animal y quirúrgico.
   1. Inducir anestesia con isoflurano al 3-4% en una cámara de inducción. Tras la pérdida del reflejo de enderezamiento, mantener la anestesia en ~2% a través del cono nasal.
   2. Coloca a la rata en posición prona sobre una superficie quirúrgica estéril. Afeita la región torácica dorsal (omóplatos hasta la zona lumbar media, incluyendo los flancos) usando una máquina de cortar eléctrica.
   3. NOTA: Retira el pelo de al menos 5 × 5 cm a cada lado de la línea media para permitir un acceso quirúrgico claro y la colocación de los SPIR.
   4. Desinfecta la zona afeitada con etanol al 70% seguido de solución de iodóforo. Repite el exfoliante de etanol/yodo tres veces, terminando con yodo.
   5. Cubre el campo quirúrgico con gasas estériles, dejando expuestas solo las zonas de las heridas planeadas.
2. Crea heridas excisionales bilaterales de espesor completo.
   1. Delinear dos círculos de 2 cm de diámetro en los flancos dorsales utilizando un marcador quirúrgico estéril, colocando uno a cada lado de la línea media, detrás de las extremidades anteriores.
      NOTA: Asegúrese de que ambos círculos sean iguales en tamaño y estén colocados simétricamente para permitir la comparación dentro del animal^14,15.
   2. Elimina la zona circular marcada de la piel usando tijeras estériles o un bisturí. Retira la epidermis, la dermis y el panniculus carnoso para crear una herida de grosor completo (~3,14 cm²).
   3. Consigue la hemostasia aplicando una presión suave con gasas estériles. Crea una herida idéntica de 2 cm en el flanco contralateral usando la misma técnica.
      NOTA: El lecho de la herida debe estar formado por fascia o músculo expuesto, sin dermis residual.
   4. Administrar analgesia postoperatoria inmediatamente después de la formación de la herida (por ejemplo, lidocaína 4 mg/kg por vía subcutánea).
3. Asigna grupos experimentales.
   1. Utiliza un diseño dentro del sujeto en el que una herida recibe tratamiento PEMF y la herida contralateral actúa como control.
   2. Incluye una cohorte separada que reciba un dispositivo simulado (bobina idéntica sin alimentación) para controlar la presencia del dispositivo.
   3. Mantener controles sin tratar o simulados para distinguir los efectos electromagnéticos de los efectos de manipulación o vendaje.

2. Aplicación del dispositivo PEMF

1. Vendar la herida y colocar el DIU.
   1. Coloque una gasa fina estéril o una película semipermeable directamente sobre la herida designada para el tratamiento PEMF. Asegura una cobertura completa del lecho de la herida.
   2. Coloca el parche flexible de la bobina de cobre sobre la herida vendada (Figura 1). Centra la bobina de modo que la herida quede debajo del centro de la bobina.
      NOTA: El diámetro de la bobina (~5 cm) puede extenderse más allá de los márgenes de la cuerda; Asegúrate de que la herida permanezca dentro de la zona de campo magnético efectivo.
2. Asegura la bobina.
   1. Asegura la bobina con cinta adhesiva de grado médico enrollada suavemente alrededor del torso. Mantén un contacto cercano entre el DIU y el apósito sin comprimir el tórax.
   2. Coloca una tira flexible de aluminio sobre la bobina para estabilizar la posición si es necesario. Evita restringir la respiración o el flujo sanguíneo local.
   3. Aleja los cables de cable del cuerpo (por ejemplo, hacia la cabeza) para evitar enredos.
3. Administrar estimulación PEMF.
   1. Conecta la bobina al controlador de la PCB (Figura 2) y activa el dispositivo. Ajusta los parámetros de estimulación a una frecuencia de 30 Hz y una intensidad de campo magnético de ~1,3 mT durante 60 minutos al día.
   2. Realiza sesiones de estimulación a la misma hora cada día (±1 hora) para mantener intervalos constantes.
      NOTA: Estos parámetros se seleccionaron en base al cribado ortogonal CCK-8 (0,25-1,3 mT, 10-40 Hz, 30-90 min/día, Tabla 1) identificando 1,3 mT, 30 Hz y 60 min/día como óptimos (Tabla 2).
   3. Coloca un LE inactivo idéntico sobre la herida de control durante 1 hora para proporcionar un tratamiento simulado. Marca claramente la bobina falsa para evitar confusiones.
4. Retira el dispositivo e inspecciona la herida.
   1. Apaga el mando después de 60 minutos. Quita cuidadosamente la bobina y los materiales adhesivos.
   2. Inspecciona la herida para detectar sangrados, edemas o efectos adversos. Sustituye la gasa estéril si es necesario.
      NOTA: La temperatura superficial de la bobina se mantiene cerca de la temperatura ambiente durante una hora de estimulación; No se observó calefacción significativa.
5. Proporciona cuidados posttratamiento.
   1. Ponte un collar isabelino para evitar auto-traumas. Asegúrate de ajustar correctamente sin afectar la respiración ni la alimentación.
   2. Envuelva una gasa ligeramente alrededor de las patas traseras para reducir el rascado en las heridas dorsales.
   3. Vigila a la rata hasta que se recupere completamente de la anestesia. Continúa con la analgesia (por ejemplo, lidocaína 4 mg/kg cada 12 horas durante 2-3 días o según el protocolo institucional).
   4. Repite los tratamientos diarios de PEMF durante la duración del estudio (por ejemplo, 14 días).

3. Monitorización de heridas y recogida de datos

1. Captura imágenes de heridas.
   1. Fotografía de heridas a 0, 3, 7, 10 y 14 días después de la herida. Anestesiar ligeramente a los animales si es necesario para evitar el movimiento.
   2. Incluye una escala de medición en cada imagen y coloca la cámara perpendicular a la herida a una distancia^{fija 14,15}.
2. Mide el área de la herida.
   1. Calibra la escala de imagen en ImageJ usando la regla de referencia. Traza márgenes de la herida para calcular el área en mm².
   2. Registrar el área de la herida en cada momento y calcular el porcentaje de cierre de la herida en relación con la línea base.
   3. Compara cuantitativamente las heridas tratadas con PEMF y las de control.
3. Extraer tejido para histología (opcional).
   1. Eutanasiar a los animales en el punto final experimental según los procedimientos aprobados por la IACUC.
   2. Extirpa muestras de tejido de la herida y fija en formalina para el procesamiento histológico.
   3. Realizar incrustación y tinción de parafina (por ejemplo, H&E, tricromo de Masson) para evaluar la deposición de colágeno, la re-epitelización y la^{angiogénesis 13,16}.

4. Análisis e interpretación de datos

1. Genera curvas de cierre de heridas.
   1. Traza el porcentaje de cierre de heridas a lo largo del tiempo para cada grupo.
   2. Calcula la tasa de curación y el tiempo hasta los umbrales de cierre predefinidos.
2. Realizar análisis estadísticos.
   1. Compila los datos de área de la herida de todos los animales y calcula la media ± de la DE en cada momento de la época.
   2. Confirmar la normalidad (prueba de Shapiro-Wilk) y la homogeneidad de la varianza (prueba de Levene).
   3. Analizar las diferencias usando ANOVA bidireccional con los factores "Tratamiento" y "Tiempo". Realiza las pruebas post hoc de Tukey si se detecta una interacción significativa.
   4. Defina la significación estadística como *p < 0,05 y **p < 0,01.

Resultados

En este modelo de herida de ratas de grosor completo, la terapia diaria con PEMF mediante un parche flexible de bobina resultó en un cierre de la herida significativamente más rápido en comparación con los controles. Para evaluar rigurosamente el efecto, las ratas se asignaron en tres grupos basados en el diseño experimental descrito en la sección de Protocolo: un grupo control dentro del sujeto (donde cada rata tenía una herida tratada con PEMF y una herida contralateral sin tratar, dat...

Discusión

Los pasos críticos incluyen la creación de heridas simétricas de grosor completo, asegurar que el parche de la bobina quede plano sobre una barrera estéril sin huecos y mantener una exposición diaria constante; Las desviaciones pueden reducir la entrega en el campo y aumentar la variabilidad en los resultados de la cicatrización.

Este trabajo presenta varias limitaciones que deben considerarse al interpretar los hallazgos y evaluar el potencial traslacional. E...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de cultivo celular de 96 pozos	BaiDi	H908002	Para el ensayo CCK-8
PORTAOBJETOS DE MICROSCOPIO DE ADHESIÓN	CITOTESTO	P/N.80312-3161	Equipamiento para   H& Tinción E/Masson
Analgésico (inyección de clorhidrato de lidocaína)	HUAMU	70011657	Analgésico opioide, 4 mg/kg (para control del dolor)
Máquina de anestesia	Ciencias de la Vida de tracción trasera (Shenzhen, CN)	R520-ISO	Vaporizador de isoflurano con suministro de oxígeno
Máquina automatizada de tinción inmunohistoquímica	Leica	21.2201	tinción inmunohistoquímica automatizada
Punzón de biopsia (20 mm)	Integra Miltex	#33-37	Punzón circular de piel, 2 cm de diámetro
Cámara, digital	Huawei Mate 70 Pro	N/A	≥ 12 MP para imagen de heridas
Anticuerpo CD31	Abcam	a. 182981	Marcador endotelial para IHC (Figura 4B)
Anticuerpo CD34	Abcam	ab81289	Marcador endotelial para IHC (Figura 4B)
Kit de Recuento de Celdas-8 (CCK-8)	Biosharp	BS350B	Utilizado para el cribado in vitro de parámetros PEMF (OD450)
Plato de cultivo celular (10 cm)	BaiDi	H802004	Plato de cultivo de tejido de 10 cm (100 mm) para cultivo de fibroblastos
Medio de cultivo celular (por ejemplo, DMEM + FBS)	BaiDi	L100-500	Para cultivo de fibroblastos en el cribado CCK-8
Incubadora de CO2	Termodinámica	BB150-2TCS-L	Para el cultivo de fibroblastos
Bobina, cobre flexible	Fabricado a medida (internamente)	N/A	Bobina impresa en espiral (5 cm de diámetro, poliimida)
Placa controladora (generador PEMF)	Construcción personalizada (diseño interno)	N/A	PCB personalizada, acciona la bobina a 30 Hz, ~1,3 mT
Máquina eléctrica de cortar pelo	Wahl u Oster (peluquería de mascotas)	Modelo 9160 y nbsp;	Máquina de peluquería animal para pelaje de afeitar
Collar isabelino (roedor)	MukeBio	MK-EC-01	Prevenir interferencias en heridas
Estación de Incrustación	Epredia HistoStar	A81000002	Procesamiento para histologia (si se realiza)
Mascarilla facial	Vedeng	V531596	Mantén la anestesia
Fibroblastos (línea celular L929)	Procell	CL-0137	Células utilizadas para el cribado de proliferación de CCK-8
Software de simulación por elementos finitos (por ejemplo, COMSOL Multiphysics)	COMSOL	CM010004	Simulación de campo magnético (Figura 5B-C)
Férula flexible de tira de aluminio	Deargo	1592	Soporte para evitar el desplazamiento de la bobina
Pinzas	Majestuoso	01625	Para manipular piel y apósitos durante la cirugía
Hematoxilina y Eosina (H&; E) Uni de teñido y sellado automático	DRS-Prisma-P+FILM	61770249	Consumible para tinción histológica rutinaria
Software de análisis de imágenes	Institutos Nacionales de Salud	Versión 1.54	Para la medición del área de la herida (por ejemplo, ImageJ)
Software de análisis de imágenes	Institutos Nacionales de Salud	Versión 1.54	Para la medición del área de la herida (por ejemplo, ImageJ)
Cámara de inducción	Ciencias de la Vida de tracción trasera (Shenzhen, CN)	802-00132-00	Inducción de anestesia con isoflurano
Cámara térmica infrarroja	HIKMICRO	H11	Monitorizar la temperatura superficial de la bobina (Figura 5A)
Desinfectante de Povidona de yodo 10%	HYNAUT	N/A	Antiséptico cutáneo (iodóforo)
Isoflurano	Ciencias de la Vida de tracción trasera (Shenzhen, CN)	20037015	Anestésico inhalado (grado USP)
Inyección de lidocaína 10%	SANMA	N/A	Para analgesia postoperatoria
Kit de tinción tricroma de Masson	BASO	C250202	Consumible para visualización de colágeno/ECM
Marcador y regla médica para la piel	Tondaus	N/A	Incluir escala en fotografías de heridas
Lector de microplacas	Termodinámica	A51119500C	Para la medición de OD450 en el ensayo CCK-8
Microtomo	Epredia HM 340E	23900670	Seccionamiento para histología/IHC (si se realiza)
Fijador tisular de poliformaldehído	compartir-biografía	SB-C009	Fijación de especímenes de tejido animal
Jaula para vivienda de ratas	FengQiao	CP-JM	Jaula estándar para ratas en viviendas individuales.
Ratas, Sprague Dawley (macho, 6 y ndash; 8 semanas)	WeiJingyu SUZHOU	SCXK2024-0004	200– 250 g; alojados individualmente; Uso aprobado por IACUC
Bisturí	Jinhuan	35W0602	Para la creación de heridas excisionales
Acabado semipermeable de película	ZD	P20189	Barrera alternativa de heridas
Software de análisis estadístico (por ejemplo, GraphPad Prism o R)	Software Mackeiv	10.6.9(890)	ANOVA bidireccional y comparaciones múltiples post hoc
Gasa estéril	ZD	3141626	Vendaje/barrera protectora para heridas
Cortinados quirúrgicos estériles	ZD	V271617	Para cubrir el campo quirúrgico tras la preparación de la piel
Tijeras quirúrgicas	Majestuoso	01627	Para la creación de heridas excisionales
Jeringuillas y agujas	MINANK	20193141643	Para la administración de analgésicos subcutáneos
Escáner de diapositivas completas	3DHISTECH	N/A	Escaneo digital de diapositivas