Análisis transcriptómico basado en datos de ARN-seq a granel

Summary

El protocolo actual establece una cadena completa para analizar el proceso de RNA-seq a granel desde los datos brutos hasta el análisis de enriquecimiento funcional.

Abstract

El hígado graso no alcohólico (NAFL) suele considerarse una condición benigna; sin embargo, una vez que progresa a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), los pacientes enfrentan un riesgo significativamente mayor de desarrollar enfermedad hepática en fase terminal. Muchos estudios intentan esclarecer el mecanismo molecular que subyace a la transición de NAFL a NASH. Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (como el ARN-seq a granel) han proporcionado a los investigadores una comprensión más profunda al examinar el transcriptoma, revelar la expresión de moléculas, la activación de vías de señalización y otros factores asociados a la progresión de la enfermedad. Existe una gran cantidad de datos de código abierto disponibles para que los investigadores los analicen con el fin de identificar posibles objetivos para el tratamiento de enfermedades. Sin embargo, la investigación relacionada está limitada por la falta de un proceso eficiente y fiable para el análisis aguas arriba del transcriptoma. Aquí, se proporciona una línea de análisis upstream altamente reproducible y fácil de usar y posterior análisis diferencial de genes relacionados para lograr un procesamiento estandarizado y un análisis profundo de datos privados o públicos. La cadena se divide en cuatro pasos: (1) control de calidad de los datos; (2) mapeo génico; (3) análisis diferencial de genes; y (4) análisis funcional. Este proceso tiene como objetivo descubrir los mecanismos moleculares de transformación de enfermedades y ayudar a los investigadores a detectar posibles objetivos y enfoques terapéuticos mediante el análisis de datos de ARN-seq a granel.

Introduction

La enfermedad hepática grasa no alcohólica (NAFLD) es la enfermedad hepática crónica más prevalente a nivel mundial, afectando a más de una cuarta parte de la población. Su incidencia ha aumentado drásticamente en las últimas^{décadas 1,2,3}. La creciente carga de enfermedades, especialmente su forma más avanzada, la esteatohepatitis no alcohólica (NASH), supone un gran desafío para la salud global y una gran carga^{económica 4}. La primera etapa de la NAFLD es el hígado graso no alcohólico (NAFL), que va acompañado de infla....

Protocol

Para fines demostrativos, se utilizó el conjunto de datos público PRJNA1023502 generado por Lan Bai et al. para ilustrar cada paso tanto de análisis upstream como^{downstream 20}. Como este conjunto de datos se origina en la base de datos de acceso abierto NCBI SRA, no se requieren permisos adicionales ni aprobaciones éticas. Consulte la Tabla de Materiales para verificar todas las versiones requeridas de software y R-package. El conjunto de datos disponible públicamente PRJNA1023502 comprende 6 muestras de RNA-seq de hígado que no son NASH, 6 NAFL y 6 muestras de RNA de hígado NASH. En este proto....

Results

El flujo de trabajo de análisis upstream para la secuencia masiva de ARN se ilustra en la Figura 1A. Este flujo de trabajo ejecuta secuencialmente los siguientes pasos clave en una plataforma Linux: primero, se realiza un riguroso control de calidad de los datos de secuenciación en bruto usando fastp para eliminar lecturas y secuencias adaptadoras de baja calidad; posteriormente, HISAT2 alinea las lecturas de alta calidad con el genoma de referencia, con Sam.......

Discussion

El análisis masivo de datos de RNA-seq se caracteriza como una tarea interdisciplinar que integra genómica, bioinformática, estadística e informática. Un flujo de trabajo analítico completo abarca múltiples pasos aguas arriba y posterior, incluyendo preprocesamiento de datos en bruto, control de calidad, alineación de secuencias, cuantificación a nivel génico, normalización de datos, análisis de expresión diferencial e interpretación biológica. Entre estos pasos, convertir con precisión .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
biomaRt	Bioconductor	2.64.0	Anotación génica de Ensembl
clusterProfiler	Bioconductor	4.16.0	Análisis de enriquecimiento funcional
DESeq2	Bioconductor	1.48.1	Análisis de expresión diferencial
FactoMineR	AgroParisTech	2.11.0	ACP y análisis multivariante
fastp	OpenGene	1.0.1	Control de calidad y filtrado de datos FASTQ
RecuentosCaracterísticas	División de Bioinformática, Instituto Walter y Eliza Hall de Investigación Médica	2.0.0	Cuenta el número de lecturas asignadas a cada gen para la cuantificación de la expresión génica
ggplot2	Postul	3.5.2	Visualización de datos
ggrepel	Kamil Slowikowski	0.9.6	Etiquetas de texto que no se solapan
ggridges	Claus O. Wilke	0.5.6	Crear gráficos de crestas
HISAT2	Universidad Johns Hopkins	2.2.1	Alinea las lecturas filtradas de alta calidad con el genoma de referencia
R	Equipo Principal R	4.5.0	Un entorno para la computación, análisis y visualización de datos
RColorBrewer	Erich Neuwirth	1.1.3	Paletas de colores para trazar gráficos
samtools	Corriente de trabajo de Genómica a Gran Escala	1.22.0	Convertir y procesar archivos SAM para una recuperación y acceso eficientes
Kit de herramientas SRA	Centro Nacional de Información Biotecnológica	3.2.1	Obtener y preprocesar los datos de secuenciación en bruto de la base de datos NCBI SRA