Modelos animales estandarizados inducidos por inestabilidad para estudios preclínicos de osteoartritis

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo establecer modelos animales adecuados para investigar la osteoartritis.

Resumen

Como la enfermedad articular más prevalente a nivel mundial, la osteoartritis de rodilla (OA) representa una carga significativa para la salud global, lo que ha impulsado una investigación exhaustiva sobre su patogénesis y estrategias de tratamiento. A pesar de numerosos estudios, siguen faltando metodologías estandarizadas para el establecimiento de modelos. Por ello, para abordar esta carencia, presentamos protocolos integrales y reproducibles para desarrollar modelos animales de osteoartritis inducidos por inestabilidad, específicamente el modelo de Desestabilización del Menisco Medial (DMM) en ratones y el modelo de Desgarro del Menisco Medial (MMT) en ratas. Además, describimos un procedimiento sencillo y fácilmente implementable para evaluar los umbrales de dolor postoperatorio y la estabilidad espacial de la marcha, orientado a promover la consistencia metodológica en la investigación preclínica sobre la osteoaristoria. La validación histológica y conductual confirmó el éxito de ambos modelos, ya que las puntuaciones de la Osteoarthritis Research Society International (OARSI) estaban notablemente elevadas, la longitud de la zancada se alteró significativamente y los umbrales de dolor mecánico se redujeron sustancialmente en los grupos DMM y MMT en comparación con los controles, lo que indicaba una degeneración articular pronunciada e hipersensibilidad. Estos resultados de validación subrayan la reproducibilidad y la relevancia traslacional de ambos modelos. Así, al proporcionar documentación detallada en vídeo, este trabajo promueve la estandarización de procedimientos y facilita la coherencia entre laboratorios, mejorando así la fiabilidad y comparabilidad de los resultados de investigación en OA.

Introducción

La artrosis (OA) es un trastorno degenerativo articular muy prevalente y una de las principales causas de discapacidad a nivel^{mundial 1,2}. A pesar de la extensa investigación, el desarrollo de fármacos OA modificadores de la enfermedad (DMOAD) eficaces ha sido relativamente^{lento 3}. Ahora se reconoce ampliamente que la artrosis es una enfermedad multifactorial que implica cambios patológicos complejos en múltiples tejidos periarticulares, incluyendo cartílago articular, hueso subcondral, tendones y^{sinovio 4,5}. La investigación preclínica eficaz sobre los diversos procesos patológicos de la AO requiere el uso de modelos animales bien definidos y apropiados. Aunque se han establecido y reportado una variedad de modelos animales de^OA 6,7,8,9,10,11, muchos estudios continúan empleando modelos animales inadecuados, limitando la relevancia traslacional de sus hallazgos. Para abordar este problema, presentamos modelos estandarizados de OA inducida por inestabilidad, incluyendo procedimientos de Desestabilización Reproducible del Menisco Medial (DMM) y Desgarro del Menisco Medial (MMT), en formato de vídeo para servir como referencia práctica para la investigación preclínica de OA y la estandarización de modelos.

Como se informó en estudios previos, la inestabilidad meniscal es un factor importante que contribuye a la degeneración de la articulación de la rodilla en casos clínicos. Por lo tanto, la inestabilidad meniscal inducida quirúrgicamente en ratones y ratas sirve como un enfoque eficaz para la inducción experimental de la OA. En este contexto, presentamos dos modelos representativos de OA inducida por inestabilidad, incluyendo el modelo DMM en ratones y el modelo MMT en ratas. El modelo DMM en ratones es especialmente valioso para investigar los mecanismos moleculares de la AO, ya que estos son susceptibles a la manipulación transgénica, y este modelo muestra una progresión gradual y prolongada de la enfermedad, imitando estrechamente la OA humana. Sin embargo, es importante señalar que el modelo DMM es menos adecuado para estudios centrados en alteraciones patológicas en el hueso subcondral, donde modelos alternativos pueden ofrecer una mayor relevancia traslacional.

Además, establecimos el modelo MMT en ratas para complementar el modelo DMM en ratones. El procedimiento de TMM induce daños estructurales más extensos que afectan tanto al cartílago articular como al hueso subcondral, reflejando así mejor las características patológicas avanzadas de la artrosis observadas en entornos clínicos. Esto hace que el modelo MMT de ratas sea especialmente adecuado para la bioingeniería y la investigación traslacional, incluyendo la evaluación de biomateriales, terapias regenerativas y sistemas de administración de fármacos dirigidos a la reparación articular. Aunque las técnicas quirúrgicas MMT y DMM ya se han descrito en estudios previos, sigue faltando un protocolo visual integral y paso a paso que garantice estandarización, reproducibilidad y precisión técnica en los laboratorios de investigación. Por ello, para abordar esta carencia, hemos desarrollado una demostración detallada basada en vídeo que ilustra cada paso crítico del establecimiento del modelo, desde la preparación animal hasta el cuidado postoperatorio. Además, introducimos dos métodos de evaluación conductual comúnmente utilizados, uno para evaluar el umbral de dolor y otro para analizar la estabilidad espacial de la marcha, con el fin de proporcionar un marco coherente para la evaluación funcional tras la inducción de la OA. Así, al integrar protocolos quirúrgicos y conductuales, este manuscrito pretende promover la estandarización metodológica en la investigación preclínica de la AO, mejorando así la comparabilidad de datos y la relevancia traslacional entre estudios.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo conforme a las directrices del Comité de Ética y Bienestar Animal de la Universidad Médica China de Zhejiang y fueron aprobados bajo el protocolo número IACUC-20251020-11. Para la cirugía de DMM, se utilizaron ratones machos C57BL/6 de entre 10 y 12 semanas, mientras que se seleccionaron ratas machos de Sprague-Dawley de 200 a 225 g para el procedimiento MMT. Todos los animales fueron alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos (FPS) y se permitió un periodo de aclimatación de una semana antes de la experimentación. Se mantuvieron las condiciones estándar de cría, sustituyendo alimentos, agua y camas al menos dos veces por semana para garantizar el bienestar animal y la coherencia experimental.

1. Preparación animal

1. Administrar analgesia adecuada (por ejemplo, buprenorfina) antes de la cirugía según las directrices institucionales. Anestesiar al animal con un anestésico inhalado (por ejemplo, isoflurano al 2% a 0,4 L/min con un flujo de gas fresco de 4 L/min en una cámara de inducción) y mantener la anestesia durante todo el procedimiento mediante un cono nasal. Confirma la profundidad de la anestesia asegurando la ausencia de reflejo de retirada del pedal.
2. Aplica una tira de 2-3 mm de ungüento oftálmico lubricante en el saco conjuntival del párpado inferior y masajea suavemente el párpado para asegurar una distribución uniforme de la pomada sobre la superficie ocular.
3. Afeitar el pelaje que rodea la articulación derecha de la rodilla y desinfectar el lugar quirúrgico mediante un procedimiento de limpieza en tres pasos con povidona-yodo seguido de etanol al 70%. Coloca al animal sobre una mesa de operaciones estéril.

2. Cirugía de DMM en ratones

NOTA: Este procedimiento induce desestabilización articular al transectar el ligamento meniscotibial medial (MMTL), resaltado en rojo en la Figura 1, que normalmente ancla el menisco medial a la meseta tibial.

1. Coloca al ratón anestesiado en orientación supina y haz una pequeña incisión cutánea parapatuliana medial (aproximadamente 3-5 mm) sobre la rodilla derecha.
2. Disecciona cuidadosamente los tejidos blandos que la cubren para exponer la cápsula articular. Haz una incisión medial al tendón rotuliano y desplaza suavemente la rótula lateralmente para visualizar la articulación de la rodilla. Confirma que la MMTL aparece como una banda delgada y ligamentar que conecta el cuerno anterior del menisco medial con la meseta tibial. Utiliza un estereomicroscopio para mejorar la visualización y minimizar el riesgo de dañar el cartílago articular.
3. Transecta cuidadosamente la unión tibial del MMTL usando microtijeras, una cuchilla de bisturí #11 o una aguja de jeringuilla doblada. Al usar una aguja de jeringuilla doblada, el borde romo ayuda a proteger el cartílago articular subyacente. Confirmar la transección exitosa observando la desestabilización resultante del menisco medial.
4. Cierra la cápsula articular incisa usando 8-0 Suturas absorbibles, seguidas del cierre de la incisión cutánea con clips para heridas o suturas 6-0.
   NOTA: Procura evitar perforar o dañar el cartílago articular durante la sutura y asegurarse de que la tensión articular se mantenga adecuadamente al cerrar la incisión.
5. Permite que el animal se recupere en una almohadilla térmica y vigílalo de cerca hasta que recuperes la movilidad completa.

3. Cirugía MMT en la rata

NOTA: Este procedimiento induce la OA al crear una ruptura completa del menisco medial tras la transección del ligamento colateral medial (LCM), generando así inestabilidad articular y degeneración progresiva del cartílago.

1. Coloca adecuadamente a la rata anestesiada y realiza una incisión parapatelar, de aproximadamente 6-8 mm de longitud, sobre la rodilla derecha.
2. Realizar una disección roma para separar las capas musculares y exponer claramente el LCM (Figura 2).
3. Con tijeras quirúrgicas, transecta completamente el LCM en su punto medio.
4. Retrae suavemente el LCM transectado para exponer el menisco medial subyacente. Con pinzas finas, agarra el menisco y realiza una transección de grosor completo en su región más estrecha para crear un desgarro completo.
5. Reposiciona los tejidos blandos y cierra la incisión en capas, usando suturas absorbibles 5-0 para el músculo y la fascia, seguidas de clips para heridas o suturas 5-0 no absorbibles para el cierre de la piel.
6. Permite que el animal se recupere siguiendo el mismo procedimiento descrito en el paso 2.5.

4. Evaluaciones de conducta

1. Realizar evaluaciones de referencia antes de la cirugía y evaluaciones repetidas en los momentos postoperatorios designados (por ejemplo, 2, 4 y 8 semanas).
   NOTA: Para minimizar la variabilidad entre operadores, se realizaron pruebas de comportamiento por el mismo operador entrenado que quedó ciego ante el agrupamiento experimental. Cada medición se repitió tres veces por animal y se utilizó el valor medio para el análisis.
   1. Prueba simplificada de umbral de retirada mecánica
      1. Coloca a los ratones en compartimentos individuales sobre una plataforma elevada de malla metálica y déjalos aclimatarse al menos 30 minutos antes de la prueba. La sensibilidad mecánica al dolor se evalúa entonces utilizando un anestesiómetro electrónico von Frey.
      2. Usando un filamento de Von Frey, aplica la sonda sobre la superficie plantar de la pata trasera derecha del ratón y aumenta gradualmente la fuerza¹².
      3. Registra la respuesta, observando que una reacción positiva se indica por retirada repentina de la pata, un sobresalto o una lamida. Evalúa la presencia o ausencia de una respuesta consistente para evaluar los cambios en la sensibilidad a lo largo del tiempo.
   2. Análisis de la marcha
      1. Utiliza un sistema automatizado de análisis de la marcha para la evaluación.
      2. Permite que el animal camine voluntariamente por la pasarela de cristal del aparato. Define un ensayo válido como aquel en el que el animal se mueve a un ritmo constante sin detenerse. Espera a que el software del sistema identifique automáticamente las huellas y calcule múltiples parámetros de marcha. Analizar métricas clave para la extremidad trasera derecha (operada), incluyendo la duración de la fase de la postura, la velocidad de swing y la presión de la pata, y compáralas con las de la extremidad contralateral y los controles operados por simulación.
         NOTA: Todos los animales fueron aclimatados al aparato de prueba con sesiones diarias de entrenamiento antes de la evaluación inicial. Para cada animal, se registraron tres intentos por momento de tiempo, y solo los ensayos en los que el animal mantuvo una velocidad constante sin pausas se consideraron válidos. Todas las mediciones fueron realizadas por operadores entrenados bajo un diseño doble ciego para minimizar la variabilidad entre operadores, y las repeticiones se promediaron para asegurar la reproducibilidad de los datos.

Resultados

Caracterización y validación del modelo de ratón DMM OA
Tras un periodo de aclimatación de 1 semana, se estableció el modelo de osteoartritis (OA) inducida por DMM en ratones siguiendo el procedimiento ilustrado en la Figura 1. Se realizaron evaluaciones patológicas y conductuales dos semanas después de la cirugía. Como se muestra en la Figura 2A, los cambios degenerativos más pronunciados se localizaron en la articulación femorotibial medial...

Discusión

Este protocolo proporciona un marco estandarizado para la inducción y evaluación de dos modelos quirúrgicos de AO ampliamente utilizados. Estos modelos son especialmente valiosos porque replican estrechamente las características fisiopatológicas de la artrosis postraumática humana, ofreciendo así una fuerte relevancia traslacional. El modelo DMM implica la transección del ligamento meniscotibial medial, mientras que el modelo MMT implica una ruptura directa del menisco medial. En nuestro...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de análisis de marcha	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposico			Ungüento oftálmico
Ratones	Instituto de Animales Modelo de Nankín	C57/BL6
Sistema de prueba del dolor	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	Anestesiómetro electrónico de von Frey
Rata	Instituto de Animales Modelo de Nankín	S/D