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Artículo de método

Generación y manipulación genética de organoides cervicales humanos

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DOI:

10.3791/69617

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10 de marzo de 2026

 ,  ,  , 
1Department of New Biology, DGIST, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University Chilgok Hospital, 3Clinical Omics Institute, Kyungpook National University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Kyungpook National University School of Medicine, 5New Biology Research Center, DGIST, 6Graduate Program in Biomedical Science & Engineering, DGIST

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo detallado para establecer y manipular genéticamente organoides cervicales humanos.

Resumen

El cáncer de cuello uterino es el cuarto cáncer más común en mujeres y afecta con mayor frecuencia al ectocuello uterino. El ectocérvix uterino está revestido por epitelio escamoso estratificado, compuesto por células basales y células parabasales diferenciadas. La regeneración observada tras la conización cervical sugiere la presencia de una actividad robusta de células madre. Sin embargo, nuestro conocimiento de la identidad y los mecanismos regulatorios de las células madre cervicales y su proceso de transformación maligna ha sido limitado debido al acceso restringido a los tejidos cervicales humanos y a la falta de sistemas óptimos para evaluar la actividad de las células madre en el ectocérvix uterino. Los organoides cervicales humanos recientemente establecidos pueden ayudar a superar estas limitaciones y ofrecer nuevas oportunidades para estudiar la fisiología y patología cervical. Sin embargo, no existe un método estandarizado para aislar y establecer organoides cervicales humanos. Aquí describimos un método para establecer organoides ectocervicales humanos. Concretamente, presentamos un protocolo para aislar células individuales del epitelio ectocervical humano. Incubando tejido cervical en una solución enzimática optimizada, despegamos el epitelio cervical para maximizar el rendimiento celular y minimizar la contaminación por fibroblastos. Además, describimos las condiciones para el cultivo de organoides cervicales humanos utilizando una formulación optimizada de medio. Además, detallamos los procedimientos para el paso y manipulación genética de organoides cervicales. Este protocolo proporciona un enfoque altamente eficiente para establecer organoides cervicales humanos y utilizarlos para estudiar células madre y enfermedades cervicales.

Introducción

El ectocérvix uterino es el sitio más común para el cáncer de cuellouterino 1,2. Aunque el cáncer de cuello uterino ha ido disminuyendo tras la introducción de la vacuna contra el virus del papiloma humano (VPH) en los países desarrollados, a nivel mundial sigue siendo el cuarto cáncer más común entre lasmujeres 3,4. Además, la incidencia de lesiones precancerosas cervicales sigue aumentando en algunospaíses 5,6. Aunque la lesión intraepitelial escamosa de bajo grado (LSIL) suele retroceder por sí sola, la lesión intraepitelial escamosa de alto grado (HSIL) conlleva un riesgo de progresión hacia cáncer invasivo y normalmente requiere intervención quirúrgica, como la escisión o la conización. Estos procedimientos pueden acortar el ectocuérvix y aumentar el riesgo de aborto espontáneo o partoprematuro 7,8. Un conocimiento más profundo de la biología cervical, junto con el desarrollo de la terapia regenerativa, podría ayudar a abordar estos desafíos, pero requiere sistemas modelos robustos y fisiológicamente relevantes.

Los modelos animales han avanzado significativamente nuestra comprensión de la homeostasis cervical, los mecanismos de las enfermedades y las estrategias terapéuticas. Sin embargo, sus diferencias inherentes con la biología y la patología humanas limitan su valor traslacional. Como alternativa, los organoides han surgido como plataformas poderosas para modelar la biología humana y las enfermedades. Los organoides son microestructuras tridimensionales derivadas de células madre que recapitulan las firmas histológicas y moleculares de su tejidode origen 9,10,11. Se han empleado para identificar diversas células madre de tejido humano en múltiples tejidos, incluyendo la tráquea, el esófago y el cuellouterino 12,13,14. Además, los organoides permiten la manipulación genética, lo que permite modelar la patogénesis de diversas enfermedades, incluyendo cánceres yfibrosis 15,16,17. Además, los organoides sirven como una plataforma eficaz para el cribado de la eficacia y toxicidad de fármacos o terapiascelulares 18,19,20,21.

Recientemente, dos grupos independientes establecieron sistemas organoides cervicaleshumanos 22,23. A partir de estos avances, mejoramos significativamente la eficiencia del cultivo de organoides cervicales e identificamos células madre cervicaleshumanas 13. Además, al despegar el epitelio cervical, minimizamos la inclusión de fibroblastos subyacentes al epitelio cervical. Al emplear organoides cervicales mediante manipulación genética, descubrimos el papel de los metabolitos microbianos y sus vías posteriores en el mantenimiento de la homeostasis cervical y la prevención de la progresión precancerosa. Así, un protocolo estandarizado y optimizado para generar, mantener y modificar genéticamente organoides cervicales servirá como una herramienta esencial para estudiar la biología y patología cervical.

En este artículo, presentamos un protocolo detallado y optimizado para generar y pasar organoides cervicales humanos. También describimos un protocolo para su manipulación genética mediante electroporación.

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Protocolo

El aislamiento celular y el cultivo de organoides utilizando tejidos cervicales humanos fueron aprobados y realizados conforme a todas las normativas éticas pertinentes por los comités internos de revisión del DGIST, Daegu, Corea, y del Hospital Universitario Nacional Chilgok Kyungpook, Gyeongsangbuk-do, Corea (DGIST-20210401-BR-112-01 y KNUCH-2020-12-020-001). Los tejidos ectocervicales humanos fueron proporcionados por el Departamento de Obstetricia y Ginecología del Hospital Nacional Universitario Chilgok Kyungpook. Se obtuvieron tejidos cervicales sanos de pacientes que se sometieron a histerectomía laparoscópica total por sus enfermedades uterinas benignas. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes.

1. Aislamiento unicelular de tejidos ectocervicales

NOTA: Este protocolo comienza con una muestra de biopsia de ectocérvix humano de aproximadamente 5 mm × 5 mm × 5 mm de tamaño (Figura 1).

  1. Coloca el tejido biopsiado en una placa de Petri de 10 cm y lávalo una vez con DPBS bien frío (sin calcio ni magnesio) para eliminar sangre y residuos.
    NOTA: Los tejidos cervicales humanos fueron transportados al laboratorio en un plazo de 3 horas tras la cirugía en DMEM/F12 avanzado helado y procesados inmediatamente al llegar.
  2. Transfiere el tejido a un tubo de 1,5 mL que contiene 1 mL de solución de Dispase (2,4 U/mL) e incubar durante 1 hora a 37 °C con una agitación suave en un tubo rotador (20 rpm).
    NOTA: La solución de dispasa (2,4 U/mL) se preparó de nuevo inmediatamente antes de su uso, disolviendo polvo de dispasa a la concentración de trabajo en DPBS helado.
  3. Transfiere la muestra a una nueva placa de Petri de 10 cm. Separa cuidadosamente la capa epitelial blanca del resto del tejido usando pinzas.
  4. Utiliza pinzas afiladas para despegar suavemente la superficie epitelial como una lámina intacta. Transfiere inmediatamente la capa epitelial aislada a un tubo cónico de 50 mL que se mantiene en hielo.
    NOTA: Si el epitelio superficial no se despega fácilmente, raspa la superficie con pinzas de extremo romo.
  5. Añade 1 mL de una solución de disociación recombinante basada en tripsina a la muestra pelada o raspada y transfiere toda la mezcla a un tubo cónico de 50 mL.
  6. Conserva el tejido restante del paso anterior en el otro tubo cónico de 50 mL.
  7. Incubar el tubo cónico de 50 mL que contiene el epitelio cervical a 37 °C durante 5 minutos con una agitación suave en un tubo rotador (20 rpm).
  8. Añade 10 mL de tampón bloqueante recién preparado (PBS con suero de ternera bovina al 2% (BCS)) a la suspensión celular para detener la reacción enzimática.
  9. Centrifuga el tubo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C. Retira y descarta cuidadosamente el sobrenadante.
    NOTA: Si se observa sangre visualmente en el tejido disociado o el tejido parece pegajoso, proceda con el siguiente paso. Si no, salta al paso 1.13.
  10. Añadir 1 mL de tampón de lisis de 1X para glóbulos rojos y 20 μL de DNasa (10 U/μL de stock) al pellet. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos y descomponer el ADN pegajoso.
  11. Añade 10 mL de tampón bloqueador helado (PBS con suero de terneros bovinos al 2% (BCS)) a la suspensión celular para detener la reacción enzimática.
  12. Centrifuga el tubo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C. Retira y descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  13. Lava el pellet celular con un tampón bloqueador bien frío (PBS con suero de terneros bovinos al 2% (BCS)).
  14. Centrifuga el tubo a 450 × g durante 5 minutos. Retira y descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  15. Resuspende el pellet celular en 200-500 μL de medio de cultivo organoide.
  16. Cuenta el número de células usando hemocitómetro con solución de tripán azul. El rendimiento celular esperado está entre 50.000 y 500.000 células por muestra de biopsia.

2. Siembra y cultivo de organoides ectocervicales

  1. Resuspender entre 500 y 2.000 células viables en un volumen final de 50 μL de medio de cultivo organoide (composición descrita en la lista de materiales) en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. La viabilidad celular se evaluó mediante exclusión de azul de tripán antes de la siembra.
  2. Añade 50 μL de una matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel) a la suspensión celular. Mezcle suavemente sobre hielo para evitar la formación de burbujas y dispense la mezcla de 100 μL en el interior de un inserto de cultivo celular colocado en una placa de 24 pozos. Todos los procedimientos que implicaban manipulación de la matriz de membrana basal se realizaron sobre hielo o a 4 °C para evitar la gelificación prematura, salvo que se especifique lo contrario.
  3. Incuba la placa durante 20-30 minutos a 37 °C hasta que la mezcla matriz de membrana basal y célula se solidifique.
  4. Una vez que la mezcla se ha solidificado, añade 400 μL de medio de cultivo organoide al pozo debajo del inserto.
  5. Cultiva los organoides durante 1-2 semanas hasta que alcancen un diámetro medio de 150-250 μm (el diámetro máximo es de unos 500 μm).
    NOTA: Cuando los organoides alcanzan un tamaño adecuado y muestran el patrón lamelar concéntrico de microestructuras similares a la piel de cebolla, considera el paso si es necesario.

3. Disociación y resiembra de organoides

  1. Añade 1 mL de solución de dispasa (2,4 U/mL) sobre el inserto de cultivo celular y disocia suavemente la matriz de membrana basal usando una pipeta.
  2. Transfiere la mezcla de matriz de membrana basal dispasa a un tubo de 15 mL e incuba durante 1 hora a 37 °C.
  3. Añade 10 mL de tampón bloqueante recién preparado (PBS con suero de ternera bovina al 2% (BCS)) a la suspensión celular para detener la reacción enzimática.
  4. Centrifuga el tubo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C.
  5. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el perdigón en 200 μL de TrypLE Express.
  6. Incuba durante 5 minutos a 37 °C.
  7. Añade 1 mL de tampón bloqueador de hielo (PBS con suero de terneros bovinos al 2% (BCS)) y pipetea suavemente para neutralizar la enzima.
  8. Filtrar la suspensión a través de un colador de celdas de 40 μm para obtener células individuales.
  9. Centrifuga el tubo a 450 × g durante 5 minutos a 4 °C. Retira y descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  10. Resuspende el pellet celular en 200-500 μL de medio de cultivo organoide.
  11. Cuenta el número de células usando hemocitómetro con solución de tripán azul. El rendimiento esperado de las células está entre 50.000 y 500.000 células por pozo de inserción de cultivo celular de 24 pozos.
  12. Luego se resuspenden 500-2.000 células en 50 μL de medio de cultivo organoide (composición descrita en la lista de materiales). Añadir 50 μL de matriz de membrana basal a la suspensión celular. Mezclar suavemente, evitar la formación de burbujas, y dispensar la mezcla de 100 μL en el interior de un inserto de cultivo celular colocado en una placa de 24 pozos.
  13. Incuba la placa durante 20-30 minutos a 37 °C hasta que la mezcla matriz de membrana basal y célula se solidifique.
  14. Una vez que la mezcla está completamente solidificada (normalmente tras 20-30 minutos a 37 °C), añadir 400 μL de medio de cultivo organoide al pozo debajo del inserto.
  15. Cultiva los organoides durante 1-2 semanas en medio de cultivo de organoides (composición descrita en la lista de materiales) utilizando un método 3D de matriz extracelular incrustada. Mantener los cultivos a 37 °C, 5% de CO₂ en una incubadora humidificada. Sustituye el medio cada 2-3 días y monitoriza el crecimiento hasta que los organoides alcancen un diámetro medio de 150-250 μm.
  16. Pasar los organoides para la siguiente ronda cuando alcancen un tamaño adecuado y mostrar el patrón lamelar concéntrico de microestructuras similares a la piel de cebolla, si es necesario.

4. Manipulación genética de organoides cervicales humanos mediante electroporación

NOTA: Este protocolo se basa en el uso de un Lonza Amaxa 4D-Nucleofector y el kit P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X (#V4XP-4032).

  1. Tras el aislamiento de la suspensión de células cervicales humanas, transfiere entre 100.000 y 200.000 células a cada tubo de 1,5 mL.
  2. Centrifuga los tubos a 450 × g durante 3 minutos a 4 °C. Retira y descarta cuidadosamente el sobrenadante.
  3. Resuspende el pellet celular en 20 μL de la mezcla de Solución/Suplemento de Nucleofector del kit P4 Primary Cell 4D-Nucleofector X. La mezcla se prepara combinando 16,4 μL de solución nucleofectora y 3,6 μL de suplemento por tubo.
  4. Añadir 300 nM de oligo de siRNA de control o objetivo a cada tubo que contiene las células resuspendidas. Mezcla suavemente pipeteando.
    NOTA: El volumen del oligo de siRNA no debe superar los 2 μL por tubo.
  5. Transfiera cuidadosamente la mezcla nucleofección (20 μL de células resuspendidas en mezcla de solución nucleofector/suplemento + hasta 2 μL de siRNA; total 20-22 μL) a los vasos de la cubeta de electroporación del kit P4 de la célula primaria 4D-nucleofector X.
  6. Golpea suavemente los vasos de nucleocuvuta para asegurarte de que la muestra cubre el fondo de la cubeta.
  7. Cierra la tapa de los Vasos Nucleocuvette y colócala en el retenedor de una unidad 4D-Nucleofector encendida.
    NOTA: Asegúrese de la orientación correcta de los vasos nucleocuvettes en el retenedor.
  8. Inicia el proceso de nucleofección. Configura el código de pulso EA-125 para cada cuvette con el proceso de celda primaria P4.
  9. Tras completar, retira cuidadosamente los vasos Nucleocuvette del retenedor.
  10. Incuba los vasos nucleocuvettes a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que las células se estabilicen.
  11. Abrir la tapa de los vasos Nucleocubette, añadir 180 μL de medio de cultivo organoide precalentado a 37 °C a cada cubeta, y transfiere suavemente la suspensión celular a un nuevo tubo de 1,5 mL para su resuspensión.
  12. Toma un volumen de suspensión celular que contiene entre 500 y 2.000 células y resuspende en un medio de cultivo organoide hasta un volumen final de 50 μL.
    NOTA: No descartes las celdas restantes del paso 4.12. Se usarán en el paso 4.14.
  13. Cultiva los organoides siguiendo el protocolo del Método 2: Siembra y cultivo de organoides con ectocervix. Compara los efectos del siRNA evaluando diversos factores, incluyendo el número, tamaño y estructura de los organoides resultantes.
  14. Dispensar las células restantes del paso 4.12 en una placa de fijación ultrabaja de 96 pozos e incubar durante 48 horas a 37 °C.
  15. Tras 48 horas, transfiere las pilas a un tubo de 1,5 mL y centrifuga a 450 × g durante 3 minutos. Descarta el sobrenadante.
  16. Utiliza el pellet celular para experimentos de PCR en tiempo real para confirmar la eliminación de los genes objetivo y evaluar cualquier cambio en la expresión génica.
    NOTA: Todos los tejidos cervicales y suspensiones celulares humanas deben tratarse como material potencialmente infeccioso. Realizar todos los procedimientos que involucren muestras humanas primarias en un gabinete de bioseguridad certificado bajo las prácticas BSL-2 y conforme a las normativas éticas y de bioseguridad institucionales. Lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular) y desinfecta las superficies y equipos de trabajo tras usarlos con un desinfectante aprobado por la institución. Los reactivos enzimáticos (por ejemplo, enzimas de dispasa y disociación como TrypLE Express) pueden causar irritación en la piel y los ojos y pueden generar aerosoles durante la pipeteo; Evita la generación de aerosoles, mantén los tubos tapados siempre que sea posible y enjuaga inmediatamente con agua en caso de contacto, siguiendo los procedimientos de exposición institucional y las directrices SDS del fabricante. Eliminar todos los residuos biológicos (incluidos materiales que contienen matriz y plásticos contaminados) según las directrices institucionales. Para la electroporación de siRNA, sigue las instrucciones de seguridad eléctrica del fabricante: asegúrate de que las cubetas estén bien colocadas y que la tapa esté completamente cerrada antes de iniciar los pulsos, evita operar el dispositivo con guantes mojados o cerca de derrames, inspecciona el dispositivo y accesorios en busca de daños, y evita el contacto directo con los electrodos de la cubeta inmediatamente después de pulsar.

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Resultados

Cultivo de organoides cervicales humanos 3D

Los tejidos ectocervicales humanos recién aislados se disociaron en células individuales en el orden mencionado anteriormente, que luego se colocaron sobre insertos de cultivo celular de 24 pozos y se cultivaron para formar organoides cervicales según se describe en este protocolo (Figura 1). Los organoides cervicales humanos crecen hasta 500 μm de diámetro a partir de c...

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Discusión

En este manuscrito, describimos el protocolo para establecer y pasar organoides cervicales humanos. También proporcionamos un protocolo para manipularlos genéticamente, lo que avanza significativamente en el estudio de la biología y patología cervical. Aunque optimizamos el protocolo específicamente para organoides uterinos humanos, nuestro protocolo puede aplicarse a otros sistemas organoides con ligeras modificaciones.

La información esencial para establecer...

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Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Salud y Bienestar (RS-2024-00439434 para Y. Jeong).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de Célula Primaria 4D-Nucleofector X de P4LonzaV4XP-4032
Placa de sujeción ultrabaja de 96 pozosSPL39796
Filtro celular 40 y micro; mSPL93040
Tubo cónico de 50 mL 500/cajaSLPSPL50050
Tubo cónico de 15 mlSarstedt62.554.502
CryoPure Tube 1,8 mL -blancoSarstedt72.379P
37 & deg; C, 5 % CO2 y nbsp; incubadoraEppendorf9734IQ905476
Inserto de cultivo celularSPL37024
Amaxa 4D-nucleofectorLonzaAAF-1003X
Buffer de bloqueo (2% BCS en DPBS)Gibco / WelgeneBCS: 26010074; DPBS: LB001-02
Polvo de Dispase IIGibco17105041
DNAse IEnzimomáticaM059L
MatrigelCorning356231
Búfer de lisis de los glóbulos rojosBiosesangR2015
TrypLE ExpressGibco12605
Amortiguador de lavado (HBSS)JBIBL003-1
DMEM/F12 avanzadoGibco12634028
Suplemento GlutaMAXGibco35050-061
Penicilina– EstreptomicinaBiowestL0022-100
HEPESGibco15630-080
Suplemento de B27Gibco17504044
NogginPeproTech118214
N-acetil-l-cisteínaSigmaA9165
Y-27632Tecnologías STEMCELL72307
FGF2PeproTech100-18B-50UG
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG
A83-01SelleckchemS7692 
ForskolinSigmaF6886
Neuregulina 1PeproTech100-03-50UG
NGFPeproTechAF-450-01-100UG
R-spondinSinobiológico11083-HNAS
HGFPeprotech100-39H-250ug
FGF10Peprotech100-26
Petridish 35 mm SPL10035
receta de medios organoides
NombreempresaNúmero de catálogoconcentración
DMEM/F12 avanzadoGibco12634028
Suplemento GlutaMAXGibco35050-0611x
Penicilina– EstreptomicinaBiowestL0022-1001x
HEPESGibco15630-08010 mM
Suplemento de B27Gibco175040441x
sin vitamina A
NogginPeproTech118214100 ng/ml
N-acetil-l-cisteínaSigmaA91651 mM
Y-27632Tecnologías STEMCELL7230710 uM
FGF2PeproTech100-18B-50UG50 ng/ml
FGF7PeproTechAF-100-19-250UG25 ng/ml
FGF10Peprotech100-26100 ng/ml
A83-01SelleckchemS7692 500 nM
ForskolinSigmaF688610 & mu; M
Neuregulina 1PeproTech100-03-50UG50 ng/ml
NGFPeproTechAF-450-01-100UG20 ng/ml
R-spondinSinobiológico11083-HNAS100 ng/ml
HGFPeprotech100-39H-250ug25 ng/ml

Referencias

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