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Artículo de investigación

Ostórico mejora la artritis de rata a través del eje miR-34a/bcl-2

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DOI:

10.3791/69624

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15 de mayo de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, and Public Experimental Research Center, Xuzhou Medical University, 2Department of Joint Surgery, Shuyang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El ósforo (OST) es un compuesto natural con extensas actividades farmacológicas. Este estudio sugiere que la OST alivia los efectos de la osteoartritis de rodilla (KOA) a través del eje miR-34a/Bcl-2, como se ha demostrado en estudios in vivo e in vitro en ratas, y aporta nuevas ideas y direcciones para sus aplicaciones de medicamentos patentados y clínicas.

Resumen

La osteoartritis de rodilla (KOA), también conocida como artritis hipertrófica o degenerativa, es un trastorno articular muy común. Las estrategias actuales de manejo clínico incluyen terapia farmacológica, intervención física, procedimientos quirúrgicos y tratamientos complementarios. Aunque estos enfoques pueden aliviar en cierta medida los síntomas de la KOA, a menudo conllevan limitaciones, como efectos secundarios, eficacia limitada o invasividad. El osthole (OST), un derivado natural de la cumarina, ha sido ampliamente estudiado por sus propiedades medicinales, especialmente en el alivio del dolor articular y la mejora de la función articular. En este estudio, se emplearon ensayos CCK8, microscopía electrónica de transmisión (TEM), tinción H&E y análisis bioquímico sérico para demostrar que la OST ejerce efectos protectores sobre los condrocitos tanto in vitro como in vivo, sin observar toxicidad significativa. Investigaciones posteriores utilizando TEM, tinción con acridina naranja, citometría de flujo y western blot revelaron que la OST promueve la autofagia y suprime la apoptosis en los condrocitos. Estudios mecanicistas posteriores mediante qRT-PCR y ensayos de luciferasa reportero indicaron que la OST regula a la baja la miR-34a, aumentando así la expresión de Bcl-2 e inhibiendo la apoptosis a través de la vía miR-34a/Bcl-2. En resumen, estos hallazgos indican que la OST protege los condrocitos tanto en modelos celulares como animales, atenuando el estrés inducido por LPS y reduciendo la inflamación y la apoptosis en ratas KOA. La regulación a la baja de miR-34a y el posterior aumento de la expresión de Bcl-2 contribuyen a su efecto antiapoptótico. Estos resultados proporcionan una base teórica para el desarrollo de medicamentos patentados basados en OST y su posible traducción clínica en la terapia KOA.

Introducción

La osteoartritis de rodilla (KOA) es una enfermedad articular común, también conocida como artritis hipertrófica, hipertrófica o senil de rodilla. Está causada por la degeneración del cartílago articular y cambios en la estructura alrededor de la articulación. Según estudios epidemiológicos, la osteoartritis de rodilla es una enfermedad común, especialmente en personasmayores. Su incidencia está estrechamente relacionada con la edad, el peso, la genética, las lesiones articulares, etc. También pueden verse afectadas funciones fisiológicas, incluyendo la limitación del movimiento articular, la reducción de la fuerza muscular y una marcha anormal. Actualmente, en el tratamiento de la osteoartritis de rodilla, los métodos más utilizados incluyen la terapia farmacológica, la fisioterapia, la cirugía y la terapiaadyuvante 2. Los medicamentos suelen incluir analgésicos, antiinflamatorios no esteroideos y fármacos para la artritis crónica para reducir el dolor y controlar la inflamación. La fisioterapia incluye compresas calientes, compresas frías, masajes y ejercicios específicos de rehabilitación para mejorar la función motora articular y reducir el dolor. El tratamiento quirúrgico puede incluir cirugía artroscópica, reemplazo articular artificial o reparación morfológica ósea articular para restaurar la estructura y función articular. Además, también se utilizan ampliamente terapias complementarias como la acupuntura, la fisioterapia y la medicina tradicional china.

Sin embargo, aunque estos tratamientos proporcionan cierto alivio de los síntomas y de la osteoartritis de rodilla, siguen existiendo limitaciones. El tratamiento farmacológico puede tener reacciones adversas y problemas de dependencia; La fisioterapia requiere un proceso de rehabilitación continuo, y los resultados varían según la diferencia individual; El tratamiento quirúrgico es arriesgado, el proceso de recuperación es largo y requiere una consideración cuidadosa; y, aunque la terapia adyuvante ha recibido amplia atención y aplicación, aún existen pocas pruebas científicas para su eficacia; es necesario estudiar en profundidad el mecanismo regulador de la terapia adyuvante. En la terapia adyuvante, las medicinas tradicionales chinas para el tratamiento de la osteoartritis de rodilla se han utilizado ampliamente en muchas áreas y han demostrado ser útiles. Debe haber algunos componentes de la medicina tradicional china que aún no son bien conocidos, pero que han sido demostrados mediante la práctica a largo plazo y estudios posteriores. Actualmente, muchas medicinas chinas han acumulado una amplia experiencia en el tratamiento de la osteoartritis de rodilla, como Cibotiumbarometz 3, Ligusticum wallichii Franchat4, Angelicapubescens 5 y otras. Estas hierbas tienen efectos analgésicos y antiinflamatorios que pueden aliviar eficazmente el dolor y reducir la inflamación.

La OST es un compuesto similar a la cumarina ampliamente utilizado en medicina como extracto naturalde hierbas 6. Tiene muchas actividades farmacológicas y está respaldada por numerosos estudios. Los estudios han demostrado que el cnidio tiene muchas actividades farmacológicas, incluyendo antitumorales, antiinflamatorios, hiperglucemia, agregación antiplaquetaria y neuroprotección, y tiene posibles efectos terapéuticos en muchas otrasenfermedades 7. Se ha informado que la OST puede promover la apoptosis de las células cancerosas al regular la autofagia, que inhibe la apoptosis de las células del carcinoma ovárico mediante autofagia mediada por LC3 y la pirooptosisdependiente de GSDME 8; La OST induce la apoptosis de las células HT-29 mediante estrés del retículo endoplásmico y autofagiacelular 9; La OST promueve la apoptosis del cáncer colorrectal mediante la supresión de la señalización AMPK/Akt, induciendo autofagia celular, ROS y ferroptosis10; La OST puede inhibir el crecimiento del cáncer colorrectal regulando la autofagia y la transducción de señales mediada pormitocondrias 11. Al mismo tiempo, la OST es especialmente significativa para aliviar el dolor articular y mejorar su función, principalmente reduciendo la respuesta inflamatoria y aliviando el dolor articular. Y sus ingredientes activos pueden reducir la liberación de sustancias inflamatorias e inhibir la degeneración del cartílago articular causada por la artritis. En comparación con los medicamentos occidentales comunes, la OST es más segura y tiene baja toxicidad, y su uso prolongado no produce resistencia a los fármacos. Se ha informado que el osthole potencia la osteogénesis en osteoblastos al elevar el factor de transcripción osterix mediante la señalización cAMP/ CREB in vitro y invivo 12; La OST suprime el desarrollo de la osteoartritis de rodilla al potenciar la autofagia activada a través de la víaAMPK/ULK1 13; Cnidium lactone inhibe la diferenciación de osteoclastos a través de p38 MAPK y PI3K-Akt y la vía de señalización 14 de c-Fos/NFATc1; Cnidium lactone previene la pérdida ósea en un modelo de rata ovarioctomizado a través de la vía de señalización estrógeno-α/BMP-2/Smad 15; La OST mejora la osteoporosis mediante el aumento de la autofagia de las células madremesenquimales 16. Sin embargo, la observación y el análisis indicaron que la mayoría de los estudios se mantuvieron en el fenotipo, o no lograron revelar el mecanismo de regulación de la vía de señalización de la participación en fármacos a nivel molecular, lo que también fue una de las razones por las que los compuestos extraídos de la medicina tradicional china son difíciles de aceptar ampliamente. Por ello, es de gran importancia explorar más a fondo el mecanismo de regulación biológica de Osthole a nivel molecular para su medicina patentada y su aplicación clínica.

El miARN es un ARN pequeño que regula la función biológica inhibiendo la expresión de genes objetivo. Se sabe que muchas medicinas tradicionales chinas ejercen sus efectos biológicos regulando el miARN. De manera similar, también se ha informado que la OST influye en la expresión de miARN. En primer lugar, la OST desempeña un papel biológico antitumoral a través del miARN. Se ha informado que la OST inhibía la proliferación celular e inducía la apoptosis celular mediante la disminución de la expresión de CPEB2 mediante la regulación alcista de miR-424 en el carcinomaendometrial 17; La OST suprime la proliferación y acelera la apoptosis de las células gliomas humanas mediante la regulación al alza de miR-16 y la regulación a la baja deMMP-9-18; La OST muestra un efecto antitumoral en el retinoblastoma al inhibir la vía PI3K/AKT/mTOR y regular el eje hsa_circ_0007534/miR-214-3p19. En segundo lugar, la OST también puede afectar los procesos fisiológicos de los órganos del cuerpo mediante la regulación del miARN, que alivia la remodelación vascular pulmonar modulando la reprogramación metabólica lipídica mediada por miR-22–3p 20; La OST protege a las ratas contra la isquemia/reperfusión miocárdica mediante la regulación a la baja del miR-30a y la promoción de laautofagia 21; La OST protege los cardiomiocitos H9c2 contra daños inducidos por trastuzumab al potenciar la autofagia a través de la vía de señalización p38MAPK/mTOR 22. En tercer lugar, la OST puede desempeñar un papel neuroprotector a través del miARN, que estimuló la diferenciación de células madre neuronales en neuronas en un modelo celular de la enfermedad de Alzheimer mediante la regulación alza de miR-9 y rescató el deterioro funcional de las neuronas hipocampales en ratones transgénicosAPP/PS1 23; La OST disminuye los niveles de betaamiloide mediante la regulación al alza de miR-107 en la enfermedad de Alzheimer 24. Sin embargo, no se ha informado que el miARN pueda ser regulado por la OST para tratar la osteoartritis de rodilla. La literatura mostró que miR-34a mejora la apoptosis de condrocitos y facilita el desarrollo de la osteoartritis al dirigirse a DLL1 y regular la vía PI3K/AKT 25. El ARN largo no codificante MEG3 regula la progresión de la osteoartritis regulando el eje miR-34a/Klotho 26; La regulación a la baja de miR-34a promueve la proliferación e inhibe la apoptosis de las células de cartílago osteoartrítico de rata activando la vía PI3K/Akt 27. Entonces, ¿podría tratarse KOA con OST mediante la regulación miR-34a? Por lo tanto, se plantea la hipótesis de que la OST puede tratar la osteoartritis de rodilla regulando el miARN.

En resumen, la OST es un compuesto natural con extensas actividadesfarmacológicas 28. Anteriormente, el grupo de investigación confirmó que la OST puede mejorar la osteoartritis de rodilla en ratas, pero la transducción de señales celulares y los mecanismos moleculares subyacentes a este efecto biológico no se han aclarado completamente. En este artículo, estudiando más a fondo las vías de señalización de miARN, autofagia y apoptosis de la OST, se pretende clarificar el mecanismo de la OST en el tratamiento de la osteoartritis de rodilla y aportar nuevas ideas y direcciones para su medicina patentada y aplicación clínica.

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Protocolo

Todos los estudios fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Tratamiento Animal de la Universidad Médica de Xuzhou. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Modelo animal

Se adquirieron ratas adultas, machos y hembras Sprague-Dawley (SD), que pesaban entre 250 y 300 g, al Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica de Xuzhou. Las ratas se criaban en una sala especial libre de patógenos. Los procedimientos experimentales con animales, incluyendo tratamiento, cuidado y elección del punto final, siguieron las directrices de "Investigación Animal: Reporte de Experimentos In Vivo". Se realizaron experimentos con animales mediante aleatorización. Las ratas SD se agruparon en cuatro grupos (n = 8 por grupo): grupo normal (sin cirugía, alimentación normal) (grupo normal), grupo simulado (cirugía simulada: incisión de piel y músculo sin transección del ligamento cruzado anterior [ACLT], seguida de gavage con solución salina), grupo KOA/NC (cirugía ACLT + gavage salino), grupo KOA/OST (cirugía ACLT + gavage OST). El modelo KOA de la rodilla de rata se construyó utilizando el método de transección del ligamento cruzado anterior (ACLT) como se describióanteriormente 29. Al grupo de suero fisiológico se le administró mediante gavage, y al grupo de OST se le administró mediante GAGE durante 4 semanas. La dosis de OST es de 50 mg/kg de peso corporal (disuelta en PEG 400 y diluida con solución fisiológica), y la frecuencia de administración es una vez al día durante 4 semanas en la subsección de Ratas. Después, se sacrificó a las ratas para su análisis (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados). Los tejidos se congelaban inmediatamente en nitrógeno líquido o se fijaban en paraformaldehído al 4%.

2. Cultivo celular

La línea celular de condrocitos humanos (C28/I2) se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las células se cultivaron según las directrices del ATCC y se utilizaron en un plazo de 6 meses.

Condiciones del cultivo: medio DMEM/F-12 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% penicilina-estreptomicina, incubado a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 .

Tratamientos: Las células se siembraron en 1 × 106 células por pozo en placas de 6 pozos; tras 24 horas de adherencia, se trataron solo con LPS (1 μg/mL) o con OST (100 μM) durante 24 horas.

3. Ensayos de viabilidad celular

Las células condrocitas fueron coincubadas con OST o LPS en diferentes concentraciones en placas de 96 pozos. El ensayo CCK8 refleja la viabilidad celular al detectar absorbancia (OD450 nm) mediante un lector de microplacas, con valores de OD más altos indicando células más viables.

Gradiente de concentración OST: 0, 25, 50, 100, 200, 400 μM (incubado durante 24 horas). El ensayo CCK8 mostró una viabilidad celular del >90% en todas las concentraciones, confirmando la no toxicidad del compuesto.

Gradiente de concentración de LPS: 0, 0,1, 0,5, 1, 2 μg/mL (incubado durante 24 horas). El grupo LPS de 1 μg/mL tenía ~50% de viabilidad celular (frente al grupo Ctrl), por lo que esta concentración se eligió para experimentos posteriores.

4. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y tinción con Safanin O

Los tejidos se incrustaron en parafina, se desenceraron, se rehidrataron y se teñieron con reactivos H&E y Safranin O/Fast Green según las indicaciones del fabricante. Condiciones de tinción: la concentración de trabajo de AO fue de 1 μg/mL; las células se incubaron a 37 °C durante 5 minutos en la oscuridad.

Método cuantitativo: La tasa de positividad AVO se calculó contando células que contienen puntos naranjas en 5 campos aleatorios (aumento ×400) por muestra utilizando el software ImageJ. Luego, se capturaron secciones bajo un microscopio BX43 (aumento ×400).

5. Citometría de flujo

Las células se extrajeron y resuspendieron en la solución de Annexin-V FITC/PI para el análisis de apoptosis. Condiciones de incubación: Las células fueron resuspendidas a 1 ×10 6 células/mL en solución de Annexin-V FITC/PI (KeyGEN) e incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad.

Estrategia de gating: Dispersión directa (FSC) vs. se usaban compuertas de dispersión lateral (SSC) para excluir los restos de las celdas; Las células FITC⁺/PI⁻ de Annexin-V se definieron como apoptóticas tempranas, y las de Annexin-V FITC⁺/PI⁺ como apoptóticas tardías. El gráfico de acceso está incluido en el Archivo Suplementario 1 (datos brutos de citometría de flujo). Las células se recogían mediante un citómetro de flujo. Los datos se analizaron utilizando el software Flow Jo.

6. Transfección de plásmidos y mimetismo

El MiR-34a mimético (34a-mimic) y el mimetismo de control no específico (NC) se obtuvieron de una fuente comercial. Las células fueron transfectadas con plásmidos usando LipofectaminaTM 3000 según las instrucciones del fabricante.

7. Mancha de naranja acridina

La autofagia se evaluaba habitualmente mediante tinción de naranja acridina en las células. Tras el tratamiento de las células con LPS o OST en concentraciones específicas durante 24 horas, se incubaron con AO (1 μg/mL) a 37 °C durante 5 minutos en la oscuridad. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio láser confocal. La tasa de positividad AVO se calculó contando celdas que contienen puntos naranjas en 5 campos aleatorios (aumento de ×400) por muestra utilizando el software ImageJ. Los datos se reportan como media ± DE de tres experimentos independientes.

8. Observación con microscopio electrónico de transmisión

Las muestras se fijaron con glutaraldehído al 2,5% y tetróxido de osmio al 1%, luego se deshidrataron, enjuagaron e impregnaron. Tras la polimerización, las muestras se cortaron en secciones de 70 nm de grosor utilizando un ultramicrotomo. La ultraestructura de las células fue observada mediante microscopía electrónica de transmisión.

9. Inmunoblot

Se compraron anticuerpos monoclonales de ratón (Abs) contra Bcl-2 (#68103), anticuerpo policlonal de conejo contra LC3 (#14600-1-AP), IL-6 (21865-1-AP) y anticuerpo monoclonal de ratón contra β-actina (#66009-1-lg) a Proteintech. Se obtuvieron comercialmente ABS secundarios conjugados a IRDye 800CW de Cabra (policlonal), anti-Rabbit IgG (H+L) o IRDye 800CW de cabra (policlonal) anti-Mouse IgG (H+L). Las células se lisaron en un ensayo de lisis de célula completa, separadas por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se detectaron proteínas utilizando el ABS primario y el correspondiente ABS secundario. La carga proteica era de 30 μg por carril; diluciones primarias de anticuerpos: Bcl-2 (1:1000), LC3 (1:1500), β-tubulina (1:5000); se usaron anticuerpos secundarios (IRDye 800CW) en 1:10.000, IL-6 (1:800). Luego, las bandas proteicas fueron capturadas por el sistema de imagen láser de quimioluminiscencia mejorada. Las bandas proteicas fueron cuantificadas por el software ImageJ.

10. Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR)

Los ARN totales se aislaron de células utilizando el reactivo Trizol. Los cDNA derivados de ARN total se sintetizaron utilizando el kit de regente de cDNA y se analizaron mediante los métodos SYBR Green. Los cDNA derivados de miRNAs se sintetizaron usando un kit de cDNA de primera cadena miRcute más miRNA y analizados mediante un kit qPCR miRcute más miRNA. Todos los procedimientos se realizaron según el protocolo del fabricante. La expresión del transcrito objetivo se calculó utilizando el método 2-△△CT . GADPH y U6 se usaron como control de carga para ARNm y miARN, respectivamente. La secuencia de cebadores se enumera en la Tabla 1.

11. Ensayos de reporteros luciferasa

Plásmido reportero tipo psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR (WT) y plásmido reportero psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR con un mutante en el sitio de unión de miR-34a (Mut). Los reporteros y el miR-34a imitador fueron co-transfectados en células condrocitas usando LipofectamineTM 3000. Las células se extrajeron y lisaron tras 24 horas de transfección. La intensidad de la luciferasa se midió entonces utilizando el kit Dual-LumiTM Luciferase Reporter Gene Assay según las instrucciones del fabricante.

12. Pruebas de análisis de la marcha

El sistema MGT-PR se utilizó para observar los movimientos en movimiento de las ramas en movimiento de las ratas en cada grupo. Antes de las pruebas, se permitió que las ratas se adaptaran al entorno de la pista. Se registraron datos de marcha durante la marcha libre, capturándose tres ensayos válidos consecutivos para cada rata. Los parámetros analizados incluyeron la longitud del paso, la duración del columpio y la coordinación entre las extremidades traseras derecha e izquierda.

13. Análisis estadístico

Los experimentos se realizaron en triplicado y se repitieron de forma independiente al menos tres veces. El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 9. Los datos se mostraron como media ± DS. Las diferencias estadísticas se evaluaron mediante ANOVA unidireccional (prueba post hoc de Tukey) para comparaciones múltiples, o mediante la prueba t de Student bilateral para dos comparaciones experimentales de grupos. Se aceptaron diferencias como significativas en p < 0,05.

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Resultados

Células condrocitas protegidas con OST tanto in vitro como in vivo
Como producto natural, el perfil de seguridad de la OST requiere una investigación exhaustiva. Este estudio evaluó primero su citotoxicidad en condrocitos in vitro utilizando el ensayo CCK8. Los resultados indicaron que la OST no mostró toxicidad hacia los condrocitos incluso a una concentración de 400 μM (Figura 1A). Para examinar l...

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Discusión

Sobre todo, la OST protegió los condrocitos del estrés inducido por LPS in vitro y alivió la inflamación y la apoptosis en ratas KOA in vivo. Estos efectos protectores se asociaron con la regulación a la baja de miR-34a y un consecuente aumento en la expresión de Bcl-2, coherente con el papel propuesto del eje miR-34a/Bcl-2 en la mediación de la acción de la OST.

En este estudio, se encontró que la OST promueve la autofagia de las células con...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés económicos.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Laboratorio Clave de Nuevos Medicamentos y Medicina Clínica (XZSYSKF2021037) de la Universidad de Jiangsu. Los experimentos de este artículo se realizaron en parte en el Centro Público de Investigación Experimental y el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Xuzhou. Se extienden agradecimientos a Fuxing Dong, Kejia Zhang, Jinxia Kuai y Min Zhang por su entusiasta ayuda.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tetróxido de osmio al 1%Tecnología Ruixin
2,5% de glutaraldehídoTecnología Zhongjingkeyi
Naranja acridinaSigmaAmresco 0360
Solución Fitc/PI Annexin-VKeyGENKGA107
Bcl-2Proteintech#68103
Kit de Conteo de Células-8VICMED39.VC5001L
QuimioluminiscenciaOdyssey CLX
Microscopio confocalLeicaSTELLARIS 5
DMEM/F-12HyClone12.SH30023-01
Kit de análisis génico Dual-LumiTM Luciferase ReporterBeyotimeRG088
Kit de regente de ADNc FastKingTIANGENKR116-03
Citómetro de flujoBDFACS Canto II
Línea celular de condrocitos humanosColección de Cultura de Tipo AmericanoYTLK280144
LC3Proteintech#14600-1-AP
LipofectaminaTM 3000InvitrogenL3000015
LipopolisacáridosSigma29.L2880
Ensayo de lisisKeyGENKGP704-100
Lector de microplacasBioTekSinergia 2
Kit de primera cadena de ADN de miRcute más miRNATIANGENKR211-02&ZWNJ;
Kit qPCR miRcute más miRNATIANGENFP411-02
OstholeMedchemexpressO815127-25g
Electroforesis en gel de SDS-poliacrilamidaNCM BiotecnologíaP2012
SueroClark BioscienceFB15015
SYBR GreenTIANGENFP217-01‌
Microscopía electrónica de transmisiónFEITecnai G2
Ultra-microtomoLeciaUC7
Microscopio de fluorescencia verticalOlimpoBX43
β-ActinProteintech#66009-1-LG

Referencias

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