Lesión testicular postexposición retardada y progresiva en ratas debido a partículas finas (PM2.5)

Resumen

La exposición a PM2.5 induce lesión testicular retardada en modelos de rata mediante respuestas inflamatorias sostenidas, aumento de la apoptosis de células germinales, regulación a la baja de Connexin-43/Ocludin y señalización coherente con la activación de la vía JNK, lo que pone de manifiesto su amenaza a largo plazo para la salud reproductiva masculina.

Resumen

Las partículas finas (PM2.5) están cada vez más implicadas en la discapacidad reproductiva masculina. Sin embargo, dado que la mayoría de la investigación sigue siendo aguda, retardada, persistente o progresiva daño testicular post-exposición —crítico para la evaluación de riesgos a largo plazo— sigue siendo poco comprendida. Establecimos un modelo de rata con resolución temporal para determinar si la lesión persiste o empeora tras la exposición. Setenta y dos ratas Sprague-Dawley machos fueron asignadas aleatoriamente en nueve grupos (control; vehículo a las 24 horas, 1, 2 y 4 meses; PM2,5 en los mismos puntos) y recibió PM2,5 intranasal a 5 mg/kg/día durante 7 días. Cuantificamos la calidad del esperma y los índices de órganos reproductores, examinamos la histologia y ultraestructura testicular, medimos testosterona sérica, FSH, LH y E2, perfilamos los ARNm de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ), evaluamos la apoptosis de células germinales mediante TUNEL y evaluamos proteínas unionales y relacionadas con el estrés (Connexin-43, Ocludin, JNK). La exposición a PM2.5 resultó en disminuciones sostenidas en la concentración y motilidad del esperma, junto con un aumento de malformaciones y atrofia testicular y epididimal que no se recuperaron durante los 4 meses posteriores a la exposición. La histología mostró un adelgazamiento progresivo del epitelio seminífero y una degeneración ultraestructural. También fue evidente alteración endocrina, con una reducción de testosterona y alteraciones de las gonadotropinas. Mecánicamente, la exposición a PM2.5 mantuvo una expresión elevada de IL-1β e IL-6, promovió la apoptosis de células germinales y reguló a la baja Connexin-43 y Ocludina, mostrando patrones consistentes con la activación de la vía JNK. En conjunto, estos hallazgos demuestran una toxicidad testicular tardía y progresiva tras finalizar la exposición a PM2.5 y sugieren que preservar la integridad de la unión y dirigirse a JNK puede mitigar el daño reproductivo a largo plazo.

Introducción

PM2.5, una mezcla compleja de partículas finas con un diámetro aerodinámico de ≤2,5μm, se origina en emisiones industriales, gases de escape de vehículos y combustión de biomasa, y se ha consolidado como un importante contaminante ambiental^global. Los estudios epidemiológicos vinculan la exposición a PM2.5 con enfermedades respiratorias^{y cardiovasculares 2}, así como con deterioros del sistema^{reproductor 3}. El impacto en la fertilidad masculina es especialmente preocupante debido a la evidencia de que la contaminación atmosférica puede reducir la calidad del^{esperma 4}. Los factores masculinos contribuyen a más de la mitad de los casos de infertilidad a nivel mundial, y múltiples estudios reportan disminuciones significativas en los parámetros espermatozoides en las últimas^{décadas 5}. Análisis globales recientes confirman además un deterioro generalizado en la calidad del esperma en múltiples^{regiones 6}. Aunque factores como el tabaquismo, el consumo de alcohol, la radiación y la exposición a sustancias químicas son riesgos^{establecidos 7}, el PM2.5 ha surgido como un tóxico reproductivo adicional que ataca los^{testículos 8}.

Los testículos son muy sensibles a los tóxicos ambientales debido a su estructura fisiológica única y su actividad espermatogénica continua. Investigaciones previas han indicado que la exposición a PM2.5 puede inducir daño testicular a través de múltiples vías, como el estrés oxidativo, respuestas inflamatorias y la alteración de la barrera^{sangre-testicular 9}. Estos efectos agudos se caracterizan por una reducción de la calidad del esperma, una histologia testicular anormal y desequilibrios^{hormonales 10}. Sin embargo, la mayoría de los estudios se centran en lesiones inmediatas, dejando los efectos a largo plazo o retardados poco caracterizados.

Los modelos actuales de exposición a PM2.5 presentan limitaciones inherentes: la inhalación corporal completa imita la exposición natural pero requiere equipos especializados y carece de precisión^{de dosis 11}, mientras que la instillación intratraqueal asegura el control de la dosis pero es invasiva y no replica el depósito fisiológico de^{partículas 12}. Nuestro modelo intranasal resuelto en el tiempo evita estos inconvenientes: su administración no invasiva se alinea con los patrones de deposición de las vías respiratorias superiores, permite un control preciso de la dosis y apoya el muestreo multi-tiempo a largo plazo para detectar lesiones retardadas, que superan la capacidad de los modelos tradicionales enfocados en^{agudos 13}.

Nuestra dosis de 5 mg/kg/día de PM2.5 se alinea con paradigmas de exposición subaguda de roedores demostrados para provocar respuestas reproductivas y, mediante conversión de área de superficie corporal, aproxima una dosis equivalente humana ~6 veces superior a los niveles ambientales estándar para acelerar manifestaciones de toxicidad^{a largo plazo 14}. Se aplican consideraciones de especie: aunque las ratas comparten fisiología testicular conservada con los humanos, su ciclo espermatogénico más corto puede acelerar la progresión de la lesión observada en nuestros¹⁵ puntos temporales, y la administración intranasal difiere de la deposición respiratoria inferior humana, aunque se confirma la diseminación sistémica de toxinas en testículos.

Los efectos tardíos de la exposición a tóxicos ambientales son fundamentales para evaluar los riesgos reproductivos a largo plazo, ya que pueden revelar daños irreversibles que no son evidentes en observaciones a corto^{plazo 16}. Por ejemplo, algunos tóxicos pueden causar lesiones latentes en los testículos, que se manifiestan o empeoran gradualmente con el tiempo, incluso después de que la exposición cese, lo que puede llevar a una disfunción reproductiva crónica¹⁷. Dada la ubicuidad y persistencia del PM2.5, determinar si su toxicidad reproductiva continúa o empeora tras la exposición es^{fundamental 18}.

La inflamación sostenida, el estrés oxidativo y los mecanismos de reparación deteriorados son posibles factores que causan efectos retardados. La regulación alcista inducida por PM2.5 de IL-1β, IL-6 y TNF-α puede mantener la inflamación crónica, alterar la espermatogénesis y promover la apoptosis^{germinal 19}. El daño a proteínas clave de la unión, como Connexin-43 y Ocludin, compromete la barrera sangre-testículo y puede impedir la recuperación^{funcional 20}. La activación de la vía de la quinasa C-Jun N-terminal (JNK), mediadora del estrés y la señalización apoptótica, también ha sido^{implicada 21}.

A pesar del creciente reconocimiento de la toxicidad reproductiva del PM2.5, existe una brecha significativa de conocimiento sobre la dinámica temporal del daño testicular tras la suspensión de la exposición. Específicamente, sigue sin estar claro cuánto tiempo persisten las lesiones testiculares, si empeoran con el tiempo y qué vías moleculares impulsan estos efectos^{retardados 22}. Abordar estas cuestiones es fundamental para desarrollar estrategias preventivas y terapéuticas específicas que mitiguen el daño reproductivo masculino inducido por PM2.5.

Persisten lagunas significativas respecto a la duración, progresión y mecanismos de la lesión testicular inducida por PM2.5 tras la suspensión de la exposición. Este estudio aborda estas carencias evaluando los criterios reproductivos; histopatología; perfiles hormonales—específicamente hormona folículo-estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH) y estradiol (E2); inflamación; apoptosis; y expresión de proteínas barrera en múltiples momentos posteriores a la exposición. Los hallazgos ofrecen una visión sobre los riesgos reproductivos a largo plazo del PM2.5 y orientan las estrategias de salud pública para proteger la fertilidad masculina.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron conforme a las normativas institucionales y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Fujian Health College (Número de Aprobación del Proyecto: DW2024-01).

Seguridad y residuos peligrosos
Reactivos tóxicos como formalina, tetróxido de osmio y cloroformo se manipularon en una campana extractora certificada mientras se llevaba el equipo de protección personal adecuado. Se recogieron residuos orgánicos halogenados y soluciones que contienen osmio en contenedores designados y se eliminaron según los requisitos institucionales. El pentobarbital sódico se registró como sustancia controlada y los objetos punzantes se manipularon de forma segura durante todo el estudio.

Material y manipulación PM2.5
Se utilizó un material de referencia estándar PM2.5 para la dosificación. Siguiendo los procedimientos establecidos de preparación de partículas, la pólvora seca se suspendía en PBS estéril a la concentración requerida y se sonicaba en baño maria durante 10-15 minutos inmediatamente antes de su uso, sin surfactante. Las suspensiones de trabajo se preparaban frescas cada día. Los niveles de endotoxinas fueron evaluados mediante ensayo de lisato de amoebacitas de limulus y resultaron indetectables. Cuando fue necesario, se incluyeron controles de polimixina-B para excluir efectos impulsados por LPS.

Construcción de modelos animales in vivo
Setenta y dos ratas Sprague-Dawley macho con SPF (2 meses, 190 ± 10 g) fueron alojadas bajo condiciones estándar y se distribuyeron aleatoriamente en nueve grupos (n = 8 por grupo), que consistían en un grupo de control, grupos de vehículos muestreados a 24 h, 1, 2 y 4 meses, y grupos expuestos a PM2,5 en los mismos momentos de tiempo. PM2,5 se administró por vía intranasal a 5 mg∙^kg-1∙^día-1 en 10-20 μL por naris bajo anestesia ligera de isoflurano una vez al día durante 7 días. Tras la administración, las ratas se colocaban en posición supina durante 1-2 minutos para facilitar la inhalación. Los animales se mantuvieron hasta la eutanasia en los puntos designados tras la exposición, y se registró la masa corporal para los cálculos de coeficientes de órganos. Los criterios finales incluían coeficientes de órganos, calidad del esperma, histologia y ultraestructura, hormonas reproductivas séricas y ensayos moleculares.

Morfología de órganos reproductores y evaluación de la calidad del esperma
Los testículos y epidídimidos fueron disecados bajo anestesia pentobarbital profunda, secados y pesados para calcular los coeficientes de órganos. Los espermatozoides se recogieron de la cauda epidídimo picándolos en un tampón precalentado a 37 °C. La concentración se determinó con un hemocitómetro. La motilidad se evaluó examinando al menos 200 espermatozoides en cinco o más campos no solapados en portaobjetos precalentados. La morfología se evaluó tras fijación, difusión y tinción con eosina-nigrosina o Diff-Quik, con al menos 200 espermatozoides por rata. Todas las evaluaciones fueron ciegas y las réplicas técnicas se promediaron para obtener un valor por animal.

Análisis histológico y ultraestructural del tejido testicular
Los testículos se fijaron en formol 10% tamponado neutral, se procesaron mediante etanol y xileno graduados, se incrustaron en parafina y se seccionaron a 5 μm para la tinción de HE. Las secciones teñidas se evaluaron mediante muestreo aleatorio sistemático, aplicándose exclusiones para cortes oblicuos, artefactos o mala fijación. Los diámetros de los túbulos se calcularon a partir de ejes ortogonales y el grosor epitelial se midió en puntos espaciados uniformemente. Los análisis fueron ciegos y se evaluaron un mínimo de 10 túbulos por rata.

Para el TEM, los pequeños bloques tisulares se fijaron en glutaraldehído, postfijaron en tetróxido de osmio, se deshidrataron, infiltraron con resina y polimerizaron. Las secciones ultrafinas se teñieron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se imagaron a 60-120 kV bajo ajustes consistentes. La QC incluyó la evaluación de la integridad de membranas y mitocondriales, así como la evitación de artefactos de extracción.

Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA)
Se recogió sangre de la aorta abdominal bajo anestesia en una ventana fija de la mañana para controlar la variación circadiana. Tras la coagulación y centrifugación, el suero se alicuaba y almacenaba a −80 °C. Se cuantificaron testosterona, FSH, LH y E2 utilizando una plataforma de inmunoensayo validada. Las muestras se ejecutaron en duplicado con controles adecuados, y la precisión del ensayo se ajustó a las especificaciones de la plataforma. Se excluyeron muestras hemólisadas o lipémicas.

Reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo del tejido testicular usando fenolcloroformo y se purificó mediante precipitación con isopropanol y lavado con etanol. La calidad del ARN se verificó espectrofotométricamente. Se sintetizó ADNc, y se realizó RT-qPCR con química basada en colorantes bajo condiciones de ciclo estándar, seguida de análisis de curva de fusión. Los niveles de expresión se normalizaron a GAPDH usando el método 2^−ΔΔCq .

Análisis de Western blot
Los lisados proteicos se prepararon en tampón RIPA con inhibidores de proteasas, cuantificados mediante ensayo BCA y desnaturalizados en tampón de carga. La transferencia SDS-PAGE y PVDF se realizó bajo condiciones controladas. Se bloquearon membranas, se incubaron con anticuerpos primarios para Connexin-43, Ocludin, JNK y GAPDH, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia, y la densitometría implicó la resta de fondo, la normalización a GAPDH y la escalada al grupo de control.

Análisis estadístico
Los datos se reportaron como media ± SD. Se utilizó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey o la prueba t de Student cuando correspondía, analizando los datos no paramétricos mediante la prueba U de Mann-Whitney. Se consideró significativo un valor p < 0,05.

Finalización y limpieza
Todos los residuos químicos peligrosos fueron registrados y eliminados adecuadamente. Los datos en bruto, incluidos los resultados de los instrumentos y los archivos de análisis, se archivaban junto con las notas correspondientes para garantizar la trazabilidad.

Resultados

Deterioro persistente de la función reproductiva masculina en ratas, caracterizado por una reducción de la calidad del esperma y deterioro del desarrollo de órganos reproductores debido a la exposición a PM2.5

Se examinaron el impacto de PM2.5 en la función reproductiva masculina, la calidad del esperma, los coeficientes de órganos reproductores y los indicadores relacionados en nueve grupos de ratas machos. Se realizaron análisis en relación con el punto de tiempo postexposic...

Discusión

La exposición a PM2.5 de corto plazo fue seguida por un deterioro progresivo de la función reproductiva masculina tras la exposición durante 1-4 meses. Estos hallazgos apoyan la toxicidad reproductiva dependiente del tiempo que persiste tras cesar la dosis y extienden observaciones previas de deterioro reproductivo asociado a^{PM2.5 23}.

Para mejorar la reproducibilidad, estandarizamos cuatro elementos. En primer lugar, la consistencia de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tetróxido de osmio al 1%	TCI, China	O0308	Para la post-fijación en el análisis TEM del tejido testicular
Formalina amortiguada con neutro al 10%	Solarbio, China	PC0020	Para fijar muestras de tejido testicular en tinción HE
2,5% de glutaraldehído	Solarbio, China	G1102	Para fijar muestras de tejido testicular en análisis TEM
75% etanol	Acros Organics, EE. UU.	61509-0040	Para purificar ARN precipitado en RT - qPCR
Sensor Automático de Quimioluminiscencia	Bio-Rad, EE. UU.	ChemiDoc	Utilizado para la imagen automática de señales quimioluminiscentes en Western bloting.
Kit de ensayo de proteínas BCA	Solarbio, China	PC0020	Para determinar la concentración total de proteínas en el análisis de Western blot
Búfer de bloqueo	No especificado	T7131A	Utilizado en el análisis de Western blot para eliminar la unión no específica
Cloroformo	Acros Organics, EE. UU.	327270010	Utilizado en la separación de ARN durante RT - qPCR
Connexin - 43	Abcam, EE. UU.	ab11370	Detecta la expresión y distribución de una proteína clave de barrera sangre-testículo para ayudar a evaluar la integridad de la barrera
Equipación ECL	Biosharp, China	BL520B	Para visualizar bandas proteicas en el análisis de Western blot
Kits ELISA (para testosterona, FSH, LH, E2)	Abcam, Reino Unido	ab108666; ab108702; ab108651; ab108667	Para detectar hormonas reproductivas séricas
Eosina	Solarbio, China	G1002	Utilizado en la tinción de hecología hecrónica de tejido testicular
Resina epoxi	Solarbio, China	GP2001	Para incrustar muestras de tejido testicular en el análisis TEM
GAPDH	Abcam, EE. UU.	ab128915	Evalúa la apoptosis de células testiculares inducidas por PM2.5 y proporciona una base morfológica para estudiar su impacto en la apoptosis celular testicular
Hematoxilina	Solarbio, China	G1077	Utilizado en la tinción de hecología hecrónica de tejido testicular
Sistema de imagen	Nikon, Japón	Nikon DS-U3	Se utiliza para obtener muestras de imagen bajo un microscopio.
Isopropanol	Acros Organics, EE. UU.	AC447080025	Utilizado en la precipitación de ARN durante la RT - qPCR
JNK	Abcam, EE. UU.	ab124956	Explora el mecanismo molecular de la lesión testicular causada por PM2.5 e identifica los tipos celulares en los que se activa
Lector de microplacas	DISPOSITIVOS MOLECULARES, EE. UU.	SpectraMax iD3	Se utiliza para detectar señales en microplacas (por ejemplo, absorbancia, fluorescencia).
Ocludin	Abcam, EE. UU.	ab31721	Comprende el grado de daño de la barrera sangre-testicular y explora las interacciones entre proteínas relevantes
Microscopio óptico	Chongqing Opto - Instrumento Electrónico, China	BDS200	Utilizado para observación microscópica óptica general.
Microtomo Patológico	Instrumento Kaiyu de Shanghái, China	RM2016	Usado para cortar secciones de tejidos patológicos.
Pentobarbital sódico	Solarbio, China	G1102	Utilizado para inyecciones intraperitoneales en ratas antes de la extracción de sangre
Material de referencia estándar PM2.5	Instituto Nacional de Metroología, China	GBW13643	Para exposición a PM2.5 en grupo experimental
Membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF)	Thermo Fisher, EE. UU.	88585	Utilizado en el análisis de Western blot para transferencia de proteínas
Kit de reactivos PrimeScript RT	TAKARA, Japón	RR037Q	Para la síntesis de ADNc en RT - qPCR
Sistema de PCR en tiempo real	Roche, Suiza	LightCycler 480	Utilizado para la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para el análisis de expresión génica.
Búfer de lisis RIPA	TAKARA, Japón	RR9161	Para la extracción de proteínas en el análisis de Western blot
Shaker	Thermo, EE. UU.	MAXQ-4000	Se usa para agitar muestras en experimentos.
SPSS	IBM, EE.UU.	28	Para análisis de datos
Suero fisiológico estéril	Solarbio, China	S8160	Uso en el tratamiento de grupos de vehículos
Kit TB Green Premix Ex Taq II	TAKARA, Japón	RR820S	Utilizado en RT - qPCR
Microscopio Electrónico de Transmisión (MET)	Hitachi, Japón	HT7800/HT7700	Utilizado para observación ultraestructural a nanoescala.
Reactivo de Trizol	Ambion, China	15596018	Para extraer ARN total en RT - qPCR
Ultramicrotomo	Leica, Alemania	Leica UC7	Se usa para cortar secciones ultra finas para TEM.
Sistema universal de transferencia de proteínas / Máquina de transferencia de proteínas blot	Bio-Rad, EE. UU.	Trans-Blot Turbo	Se utiliza para la transferencia de proteínas en Western bloting.
Microscopio óptico vertical	Nikon, Japón	Nikon Eclipse E100	Se utiliza para observación microscópica óptica vertical.
Acetato de uranilo	Merck, Alemania	201030	Para teñir secciones ultrafinas en análisis TEM de tejido testicular