Artículo de método

Ovulación masiva en mamíferos: técnicas para analizar la poliovulación espontánea natural y la poliovulación inducida en Lagostomus maximus

DOI:

10.3791/69653

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6 de febrero de 2026

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1Centro de Estudios Biomédicos Básicos, Aplicados y Desarrollo (CEBBAD), Universidad Maimónides, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe métodos para analizar la ovulación natural e inducida en Lagostomus maximus, incluyendo la recuperación de ovocitos tras una ovulación espontánea, inducida por hormonas o plasma seminal. Proporciona un marco integral para estudiar la respuesta ovárica y la fisiología reproductiva en un modelo mamífero altamente poliovulatorio.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La vizcacha de las llanuras sudamericanas, Lagostomus maximus, es reconocida como la especie mamífera con la mayor tasa de ovulación, que puede alcanzar hasta 300 óvulos. Este notable fenómeno de poliovulación puede examinarse mediante varios enfoques metodológicos que reflejan su fisiología reproductiva distintiva. La ovulación natural se evalúa mediante la liberación de ovocitos durante la temporada de cría, lo que proporciona información sobre los mecanismos ovulatorios espontáneos de la especie, recuperando los ovocitos al lavar el oviducto y los cuernos uterinos. Además, la inducción experimental de la ovulación mediante hormonas exógenas, como las gonadotropinas, permite una evaluación controlada de la respuesta ovárica y ofrece un modelo valioso para comprender la regulación endocrina en roedores histricognatos. Un tercer enfoque implica el uso de plasma seminal autólogo como desencadenante fisiológico de la ovulación, destacando la coexistencia de mecanismos inducidos y espontáneos en esta especie. En conjunto, estas técnicas no solo esclarecen la dinámica del reclutamiento folicular y la liberación de ovocitos, sino que también establecen a L. maximus como un modelo comparativo para la biología reproductiva, con posibles implicaciones traslacionales para comprender el control de la ovulación en mamíferos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La vizcacha de las llanuras sudamericanas (Lagostomus maximus) es un roedor histricognato distinguido por su excepcional fisiología reproductiva, caracterizada por una tasa de ovulación extraordinaria que puede superar los 300 ovocitos por ciclo 1,2. Esta característica distintiva ha posicionado a L. maximus como un modelo natural para estudiar la función ovárica y el control ovulatorio enmamíferos 3,4,5,6,7,8,9,10,11.

A diferencia de los ovuladores espontáneos típicos, L. maximus presenta mecanismos ovulatorios tanto espontáneos comoinducidos 2. Esta dualidad, combinada con un crecimiento folicular masivo y ovulación asincrónica, desafía los enfoques convencionales basados únicamente en los criterios endocrinos ohistológicos 4,12,13,14. Por ello, el uso de técnicas directas y cuantitativas es esencial para determinar con precisión el momento y la magnitud de la liberación de ovocitos.

Las hembras adultas de vizcachas se obtuvieron de una población natural residente mantenida en la Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS), Parque Pereyra Iraola, Berazategui, Provincia de Buenos Aires, Argentina (34°49′57" S, 58°06′12" O). Reconocemos que los derechos soberanos sobre los recursos naturales son propiedad exclusiva de la Provincia de Buenos Aires. El número de animales capturados fue autorizado por el Ministerio de Agricultura de la provincia de Buenos Aires. Las hembras fueron capturadas utilizando trampas vivas colocadas en las entradas de madrigueras en diferentes momentos del año.

Los periodos de captura se seleccionaron según el ciclo reproductivo natural de la especie establecido por Llanos &Crespo 15, y se refinaron basándose en nuestra experiencia de trabajo de campo 7,8,10,14. La especie presenta una temporada reproductiva principal que se extiende desde finales del verano (marzo) hasta el inicio de la primavera a finalesde septiembre 16, 17 y 18, y un periodo de reproducción secundario que ocurre en octubre, especialmente en hembras que han perdido a sudescendencia 15. En consecuencia, se determinaron los siguientes grupos de trabajo: a) Grupo I (N= 27): finales de febrero-principios de abril (no embarazadas, inicio de la temporada principal reproductiva); b) Grupo II (N= 26): mediados de septiembre a finales de octubre (estro no preñada, tras la lactancia); Grupo III (N= 35): diciembre-enero (ovulación inducida por hormonas no embarazada); Grupo IV (N= 7): diciembre-enero (ovulación inducida por plasma seminal no embarazada).

Este estudio presenta y valida varios enfoques metodológicos para analizar la ovulación en L. maximus: (1) evaluación de la ovulación natural mediante la recuperación directa de ovocitos; (2) inducción de la ovulación mediante gonadotropinas exógenas; y (3) inducción de la ovulación con plasma seminal autólogo. Cada técnica proporciona conocimientos complementarios sobre la dinámica folicular, la maduración de los ovocitos y los mecanismos reguladores que rigen la ovulación.

El lavado de los oviductos y los cornos uterinos permite la recuperación directa de los ovocitos y la cuantificación precisa de la ovulación, lo que permite correlacionarse con el desarrollo folicular y la morfología de losovocitos 19,20,21. La estimulación hormonal con gonadotropinas exógenas, adaptada de protocolos utilizados en roedoresde laboratorio 22, permite una evaluación controlada de la respuesta ovárica y del momento de la liberación de ovocitos. Mientras tanto, el uso del plasma seminal autólogo como desencadenante fisiológico de la ovulación —previamente descrito en ovuladores inducidos como conejos ycamelídeos 23,24,25— ofrece un medio innovador para explorar los factores endocrinos y paracrinos implicados en la ovulación.

Al integrar estas metodologías complementarias, el presente trabajo proporciona un marco reproducible para investigar los mecanismos ovulatorios en L. maximus. La combinación de modelos naturales e inducidos permite diferenciar entre el reclutamiento folicular espontáneo, la eficiencia ovulatoria y las respuestas mediadas por plasma seminal. Además, estos enfoques revelan fenómenos como la activación espontánea partenogenética de ovocitos y la coexistencia de ovocitos "defectuosos" y "euovuladores", contribuyendo a la comprensión de la selección folicular y la competenciaoocítica 2.

Más allá de sus implicaciones específicas de especie, el modelo vizcacha ofrece una relevancia más amplia para la biología reproductiva comparada. Su estrategia ovulatoria mixta une características de los ovuladores inducidos y espontáneos, proporcionando valiosos paralelismos con los procesos reproductivos en otros mamíferos, incluyendo especies domésticas y humanos 7,14,26,27.

Los protocolos metodológicos detallados aquí están diseñados para garantizar la reproducibilidad y facilitar su adaptación a diversos contextos experimentales que involucren dinámica folicular, regulación ovulatoria y manipulación hormonal.

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Protocolo

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Los protocolos experimentales descritos en el presente fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales Experimentales (CICUAE, Universidad Maimónides, número de protocolo #6184). La captura, manipulación y eutanasia fueron realizadas por personal técnico cualificado, cumpliendo con todas las normativas locales, estatales y federales que regulan el cuidado y uso de animales de laboratorio. La ganadería siguió las Directrices para el Cuidadoy Uso de Animales de Laboratorio 28 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y las directrices de la Sociedad Americana de Mamalogistas (ASM) para el uso de mamíferos salvajes enla investigación 29. Todos los experimentos cumplieron con las directricesARRIVE 2.0 30. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados. La vizcacha de las llanuras sudamericanas (Lagostomus maximus) no se considera una especie enpeligro de extinción 31.

1. Inducción hormonal de la ovulación

NOTA: Esta sección presenta la inducción hormonal de ovulación en mujeres no embarazadas de vizcachas capturadas. Se discuten tres opciones de protocolo diferentes.

  1. Protocolo A:
    1. Administrar 200 UI de gonadotropina coriónica equina (eCG) intramuscularmente a las 0 h y 24 h, seguidas de 500 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG) a las 48 horas.
    2. Descansa las hembras hasta la eutanasia.
    3. Eutanasiar a las mujeres entre 60 y 132 horas tras la administración de la hCG (véase la sección 3).
  2. Protocolo B:
    1. Administrar 200 UI de eCG intramuscularmente a 0 h y 24 h, seguidas de 1.000 UI de hCG a las 72 h.
    2. Descansa las hembras hasta la eutanasia.
    3. Eutanasiar a las mujeres entre 60 y 132 horas tras la administración de la hCG (véase la sección 3).
  3. Protocolo C:
    1. Administrar 250 UI de eCG intramuscular a 0 h, 24 h y 48 h, seguido de 2 mg de hormona luteinizante porcina (pLH) a las 72 h.
    2. Descansa las hembras hasta la eutanasia.
    3. Eutanasiar a las mujeres entre 60 y 132 horas tras la administración de la HPL (véase la sección 3 y la Tabla 1).
      NOTA: Los animales de cada grupo fueron eutanasiados en diferentes momentos (desde 60 h hasta 132 h tras la administración de la hCG). Esta distribución temporal fue esencial para confirmar la naturaleza extendida del periodo de ovulación en esta especie. Específicamente, para experimentos destinados a la recogida exclusiva de ovocitos maduros, la eutanasia se realizó de forma constante a las 120 horas post-hCG.

2. Inducción de la ovulación por plasma seminal

NOTA: Analizar la capacidad del plasma seminal para inducir la ovulación por administración intramuscular en mujeres con preparación hormonal.

  1. Recogida y preparación del semen
    1. Recoger semen de machos reproductivos mediante electroeyaculación, como describe Giacchino32.
    2. Centrifugar el semen a 200 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente para pelletar los espermatozoides y los restos celulares.
    3. Suplementa los supernadantes (plasma seminal) con penicilina y estreptomicina y conserva a -20 °C hasta su uso.
  2. Inducción de la ovulación en mujeres no embarazadas por plasma seminal
    1. Administrar 200 UI de eCG intramuscularmente a 0 h y 24 h para cada mujer.
    2. Inyectar plasma seminal intramuscularmente 48 horas después de la dosis final de eCG.
    3. Descansa las hembras hasta la eutanasia.
    4. Eutanasiar animales 72 horas después de la inyección seminal de plasma (véase la sección 3).
      NOTA: Incluir mujeres de control inyectadas con solución salina en lugar de plasma seminal.

3. Anestesia, eutanasia y recogida del tracto reproductor

NOTA: Utilizar anestesia y métodos humanitarios de eutanasia para obtener los tractos reproductores intactos para análisis de ovocitos e histológicos.

  1. Inducir la eutanasia mediante una inyección intramuscular única calculada de 13,5 mg/kg de clorhidrato de ketamina y 0,6 mg/kg clorhidrato de xilazina administrados según las recomendaciones del fabricante y los protocolos institucionales establecidos.
  2. Confirma la anestesia profunda por la ausencia de respuesta al dolor (reflejos pedales).
  3. Coloca al animal en posición supina y esteriliza el abdomen.
  4. Abre quirúrgicamente la cavidad abdominal para exponer completamente todos los órganos abdominales.
  5. Realizar una inspección general para determinar el estado general del animal y confirmar la ovulación natural o inducida por hormonas mediante la presencia de estigmas ovulatorios.
  6. Obtener una muestra de sangre mediante punción directa de la vena cava superior para pruebas serológicas.
  7. Realizar la eutanasia del animal administrando intracárdicamente 0,5 mL/kg de pentobarbital sódico.
  8. Disecciona y elimina cuidadosamente los ovarios, oviductos y cuernos uterinos, cuidando de no dañar sus estructuras.
  9. Conserva los tejidos en solución salina con fosfato tamponado (PBS) bien frío hasta el procesamiento (≤15 min).

4. Recuperación de ovocitos

NOTA: Recuperar ovocitos de los oviductos y cuernos uterinos mediante un suave enjuaguamiento para asegurar la recogida completa de los gametos liberados minimizando el daño tisular.

  1. Prepara el aparato de lavado colocando una aguja roma de 26-G a una jeringuilla de 1 mL llena de NaCl al 0,9% suplementada con 4 mg/mL de BSA, 100 μg/mL de penicilina G y 100 UI/mL de estreptomicina.
  2. Inserta suavemente la aguja en el infundíbulo de cada oviducto e inyecta lentamente la solución de lavada.
  3. Recoge el efluente del oviducto distal y del cuerno uterino en placas de Petri estériles.
  4. Repite el lavado hasta que el líquido recuperado parezca claro y libre de ovocitos visibles o restos celulares.
  5. Transfiere ovocitos a gotas de 100 μL de medio M2 que contienen 4 mg/mL de BSA y antibióticos bajo aceite mineral.
  6. Confirmar la recuperación exitosa inspeccionando las gotas bajo un estereomicroscopio; Espera observar ovocitos libres sin células cúmulo dispersos dentro del líquido.
  7. Continúe con el lavado hasta que el efluente parezca claro y no se observen ovocitos adicionales bajo el estereomicroscopio (normalmente 3-5 lavados por oviducto).
    NOTA: Los ovocitos recuperados deben parecer esféricos y translúcidos bajo bajo aumento.
  8. Clasificar los ovocitos según la integridad morfológica descrita en la sección 6.

5. Evaluación morfológica de los ovocitos

NOTA: Evalúe la calidad de los ovocitos recuperados en función de la apariencia citoplasmática, la uniformidad de la zona pellucida y la etapa de maduración nuclear.

  1. Identificar los ovocitos como normales si presentan forma esférica, zona pelúcida uniforme, citoplasma translúcido homogéneo y una vesícula germinal visible o primer cuerpo polar.
  2. Identificar los ovocitos como anormales si el citoplasma aparece oscuro, granular o fragmentado, o si la zona pellúcida es irregular.
  3. Registrar la etapa de maduración nuclear como vesícula germinal (VG), descomposición germinal de vesícula (DBG) o metafase II (MII).

6. Evaluación de la maduración nuclear de los ovocitos e integridad del husillo meiótico

NOTA: Evalúe la maduración nuclear y la morfología del huso mediante tinción por inmunofluorescencia de α-tubulina y contracoloración de cromatina.

  1. Fija ovocitos en paraformaldehído (PFA) al 2% durante 20 minutos.
  2. Permeabiliza en Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 40 minutos.
  3. Después de fijar con 2% de PFA durante 20 minutos y lavar tres veces en PBS (30 min cada una).
  4. Bloque con suero de cabra al 2%, 2% BSA, 2% leche en polvo, 0,1 M glicina y 0,01% Triton X-100 en PBS durante ≥ 1 hora.
  5. Incubar los ovocitos durante la noche a 4 °C con anticuerpo anti-α-tubulina del ratón (1:200).
  6. Lavar en PBS durante 30 minutos e incubar durante 1 hora en oscuridad con IgG anti-ratón conjugado con fluoresceína isotiocianato (FITC) (1/1000).
  7. Contrateñe con 10 μg/mL de Hoechst 33324 durante 10 minutos y lava en PBS que contenga un 2% de BSA.
  8. Montar ovocitos en medio antifade e imagen usando un microscopio confocal.
  9. Captura y procesa imágenes usando el software EZ-C1 (EZ-C1 versión 3.90); Ajustar el contraste y el brillo en el software de procesamiento de imágenes según sea necesario.
    NOTA: La tinción exitosa se indica mediante un patrón de fluorescencia verde claro del husillo meiótico (FITC) y la contratinción nuclear azul con Hoechst 33324.

7. Análisis estadístico

NOTA: Analizar datos cuantitativos para comparar las respuestas ovulatorias y la calidad de los ovocitos entre grupos experimentales.

  1. Expresa los datos como media ± SD.
  2. Utiliza el test t de Student para comparaciones entre dos grupos.
  3. Aplica ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples.
  4. Consideremos p < 0,05 estadísticamente significativo.

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Resultados

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Ovulación natural

Doce de las 27 hembras (grupo I) capturadas entre finales de febrero y mediados de abril, coincidiendo con la temporada primaria de apareamiento, fueron observadas ovulando, mientras que durante la temporada secundaria (septiembre/octubre) (grupo II), 10 de las 26 hembras capturadas mostraron ovulación. Se observó una tasa de éxito comparable de aproximadamente el 40% de las hembras ovuladoras durante ambos periodos de captura. No se observó hinchazón de la r...

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Discusión

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El protocolo presentado aquí para estudiar la ovulación en las vizcacas de las llanuras proporciona un marco reproducible para evaluar tanto eventos ovulatorios naturales como inducidos experimentalmente. Una gran ventaja de este protocolo radica en su capacidad para cuantificar y caracterizar directamente el extraordinariamente alto número de ovocitos liberados por la vizcacha de las llanuras, una característica inigualable en otros modelos de mamíferos. A diferencia de los métodos indi...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses que pueda percibirse como perjudicial para la imparcialidad de la investigación reportada.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo financiero intramuros de la Universidad Maimónides, Argentina, y la agencia FONCYT-AMPCYT, Argentina (PICT-2018-04619, concedido a NPL). Los autores están especialmente agradecidos a la Autoridad del Ministerio de Agricultura del Gobierno de la Provincia de Buenos Aires, Argentina, por autorizar la captura de animales; al personal de la Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS, Provincia de Buenos Aires, Argentina) por su invaluable ayuda en la captura y manejo de los animales; y al DVM Sergio Ferraris y al DVM Fernando Lange del CCV-Universidad Maimónides por su asistencia durante la anestesia y los procedimientos quirúrgicos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adobe PhotoshopAdobe Systems Inc., EE. UU.N/AProcesamiento de imágenes
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-Aldrich, EE. UU.A9647Usado en medio de descarga y en buffer de bloqueo
Centrífuga (para procesamiento de semen)Eppendorf, Alemania5417RPreparación de plasma seminal
Microscopio confocal (C1 Eclipse E800)Nikon Ltd., JapónN/AImagen de ovocitos
ElectroeyaculadorDiseñado en el laboratorio; Adaptado de mamíferos domésticos para su uso en roedores caviomorfosN/AColección de semen
Eutanilo (pentobarbital sódico, difenilhidantoína sódica)Brouwer S.A., ArgentinaN/AEutanasia
IgG anti-ratón de cabra conjugado con FITC (AP124F)Chemicon, EE. UU.AP124FAnticuerpo secundario
Kit de tinción de hematoxilina-eosinaSigma-Aldrich, EE. UU.VariosHistología
Hoechst 33324Thermo Fisher Scientific, EE. UU.H3570Tinción nuclear
Clorhidrato de ketaminaHolliday Scott S.A., ArgentinaN/AAnestesia
Campana de flujo laminarThermo Scientific, EE. UU.N/AManejo aséptico
Microscopio ópticoOlympus, JapónBX51Histología
Lutropina-V (pLH)Bioniche Animal Health Care, CanadáN/AInducción hormonal
M2 mediaSigma-Aldrich, EE. UU.M7167Recuperación de ovocitos
Aceite mineralSigma-Aldrich, EE. UU.M8410Cultivo de ovocitos
Novormon 5000 (eCG)Syntex S.A., ArgentinaN/AInducción hormonal
Ovusyn (hCG)Syntex S.A., ArgentinaN/AInducción hormonal
Paraformaldehído (PFA, 2% y 4%)Sigma-Aldrich, EE. UU.158127Fijación
Penicilina GSigma-Aldrich, EE. UU.P3032Antibióticos para medios
EstereomicroscopioLeica Microsystems, AlemaniaM80Identificación de ovocitos
EstreptomicinaGibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.11860038Antibióticos para medios
Jeringuilla con aguja de punta roma (1 mL)BD en Biociencias, EE. UU.305219Lavado de ovíductos/útero
Triton X-100Sigma-Aldrich, EE. UU.T8787Permeabilización
Medio de montaje VectaShieldLaboratorios Vector, EE. UU.H-1000Montaje para fluorescencia
Clorhidrato de xilazinaRichmond Laboratories, ArgentinaN/AAnestesia
XilenoSigma-Aldrich, EE. UU.534056Descerado de secciones de parafina
Anticuerpo monoclonal de &alfa-tubulina (anti-&alfa;-tubulina de ratón, SC-5286 B7)Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.SC-5286 B7Para la inmunotinción de huso meiótico

Referencias

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