Research Article

Visualización de electrotaxis dependientes de la edad de células madre humanas derivadas del adiposo bajo campos eléctricos de corriente continua

DOI:

10.3791/69666

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December 19th, 2025

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1Department of Plastic Surgery, The First Affiliated Hospital of China Medical University, 2Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 3Department of Ophthalmology and Vision Science, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In This Article

Summary

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En una pequeña cohorte de donantes, el envejecimiento redujo la migración electrotáctica de los hADSCs. DCEF alteró la expresión génica (747 arriba, 624 abajo), enriqueciendo los términos de transporte/canal GO y las vías PI3K-Akt KEGG, sugiriendo implicación en electrotaxia relacionada con la edad, sin establecer causalidad.

Abstract

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Las células madre humanas derivadas del adiposo (hADSCs) son fundamentales para la regeneración tisular y la cicatrización de heridas, y su migración dirigida es un requisito previo para ejercer estos efectos terapéuticos. Los campos eléctricos (EF) son bien reconocidos como señales clave que guían la migración celular durante la reparación de heridas, pero el comportamiento electrotáctico de los hADSC —especialmente cómo las características del donante (por ejemplo, la edad) regulan este comportamiento y sus mecanismos moleculares subyacentes— sigue siendo poco comprendido. Esta brecha de conocimiento limita la aplicación optimizada de los hADSC en medicina regenerativa. En este estudio, primero validamos la existencia de electrotaxias en hADSC y confirmamos su dependencia del voltaje: bajo campos eléctricos de corriente continua (DCEFs) de 100-200 mV/mm, los hADSC migraron direccionalmente hacia el ánodo, con intensidades de EF más fuertes que aumentaron tanto la dirección como la velocidad de migración (frente a un control de 0 mV/mm). Luego comparamos hADSC de donantes jóvenes (27,00 ± 4,58 años) y donantes mayores (62,33 ± 4,04 años) utilizando secuenciación de ARN (RNA-seq) tras estimulación DCEF de 200 mV/mm. El análisis transcriptómico identificó 747 genes regulados al alza y 624 a la baja en hADSC ancianos, con genes diferencialmente expresados (DEGs) enriquecidos en procesos/vías biológicas críticos para la electrotaxia — incluyendo el transporte transmembrana de iones de sodio, la actividad de canales de sodio dependiente de voltaje (términos GO) y la vía de señalización PI3K-Akt (vía KEGG). Funcionalmente, los hADSC ancianos mostraron una migración anodal significativamente reducida (menor distancia acumulada, distancia euclidiana y directez) en comparación con los hADSC jóvenes bajo estimulación DCEF. Este estudio proporciona la primera evidencia de electrotaxia dependiente de la edad en hADSC, demostrando que la edad del donante se correlaciona con una capacidad electrotáctica deteriorada. Además, revela que la actividad desregulada de los canales de sodio y la señalización PI3K-Akt pueden estar detrás de este descenso relacionado con la edad. Estos hallazgos apuntan a los posibles mecanismos regulatorios de la electrotaxia hADSC y ofrecen nuevas perspectivas para adaptar las terapias basadas en hADSC (por ejemplo, seleccionando donantes óptimos o dirigiéndose a las vías de sodio/PI3K-Akt) para mejorar la regeneración tisular y los resultados de cicatrización de heridas.

Introduction

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Las células madre derivadas del adiposo (ADSC) poseen una gran capacidad de autorrenovación y un potencial regenerativo significativo. Bajo condiciones de inducción adecuadas, pueden diferenciarse en osteoblastos, condrocitos y adipocitos, entreotros 1. Mediante la señalización paracrina, la ADSC también puede apoyar la generación de vasos sanguíneos ylinfáticos 2,3, inhibir la formación decicatrices 4 y mostrar efectos reguladores inmunitarios5. Por ello, el ADSC se considera una célula semilla ideal para terapias basadas en células en medicina regenerativa.

La función de la ADSC está influida por diversas características del donante, que pueden afectar su eficacia potencial en terapias celulares, incluyendo la edad del donante, el índice de masa corporal, el género yotros 6. Los ADSC derivados de donantes mayores presentan características de envejecimiento más pronunciadas, con un potencial de diferenciación adipogénica reducido, potencial de diferenciación osteogénica y capacidadmigratoria 7,8,9. Además, la capacidad de promover la proliferación de queratinocitos y estimular los mecanismos de autorreparación del cuerpo estádisminuida.

La migración dirigida por células es un mecanismo fisiológico clave en la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos, con los campos eléctricos (EF) desempeñando un papel importante en la guía de la migración celular y en la promoción de la reparaciónde heridas 11. Por ejemplo, cuando la barrera epitelial se daña, se generan inmediatamente campos eléctricos endógenos que persisten hasta que la herida cicatriza y la función de barrera epitelial serestaura 12,13,14. Como una de las señales que guían la migración dirigida de células, se ha demostrado que las señales eléctricas tienen una prioridad mayor que otras señales coexistentes, como la inhibición del contacto, las fuerzas mecánicas y los factoresquimiotácticos 15,16. Se han desarrollado varios métodos para promover la cicatrización de heridas y la regeneración de tejidos, como mediante fármacos y dispositivos externos de estimulación eléctrica que potencian o imitan los campos eléctricos endógenos en el cuerpohumano 17,18. La capacidad de las células para migrar según un gradiente de campo eléctrico se conoce como electrotaxia. Los estudios in vitro han demostrado que muchos tipos diferentes de células son capaces de migración dirigida en campos eléctricos. Algunas células migran hacia el ánodo, como las células de la cresta neural craneal de mamíferos, los astrocitos humanos y las células de cáncer de mamahumano 19,20,21. Otras células migran hacia el cátodo, como las células epiteliales tubulares renales humanas, los fibroblastos dérmicos humanos y los neutrófiloshumanos 22,23,24. El ADSC puede guiarse para migrar hacia el ánodo en campos eléctricos de corriente continua (CC), y bajo condiciones prolongadas de cultivo, se ha demostrado que la corriente eléctrica pulsada exógena promueve eficazmente la migración direccional del ADSC hacia el ánodo manteniendo la viabilidadde la celda 25. Hasta la fecha, los estudios sobre las características electrotaxicas de las células madre humanas derivadas del adiposo siguen siendo escasos, y los mecanismos subyacentes que regulan su comportamiento electrotáctico aún no se comprenden completamente.

Somos los primeros en investigar sistemáticamente las diferencias electrotácticas dependientes de la edad en hADSC entre donantes jóvenes y mujeres mayores bajo campos eléctricos de corriente continua gradiente (DCEF), y en descubrir aún más los mecanismos subyacentes (que involucran la actividad de canales de sodio y la señalización PI3K-Akt) mediante análisis transcriptómico. En este estudio, examinamos los efectos de DCEF en los hADSC. Utilizando secuenciación de ARN y análisis diferencial de enriquecimiento génico, comparamos perfiles de expresión génica entre dos grupos hADSC —derivados de donantes jóvenes y ancianos— tras estimulación DCEF para identificar diferencias transcripcionales relacionadas con la edad. Planteamos la hipótesis de que el envejecimiento del donante afecta la respuesta electrotáctica de los hADSCs, y que este descenso relacionado con la edad está relacionado con una alteración de la actividad de los canales de sodio y la señalización de PI3K-Akt.

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Protocol

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Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes antes de la recogida de tejidos. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China (Aprobación: [2018]2018-110-2). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recogida de tejidos

Aislamiento y cultura hADSC
Recogida de tejidos: Se obtuvieron muestras de tejido adiposo abdominal humano durante procedimientos rutinarios de liposucción electiva realizados en el Departamento de Cirugía Plástica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China. Todas las donantes eran voluntarias sanas sometidas a liposucción abdominal estética, y no se realizaron intervenciones quirúrgicas adicionales con fines de investigación. Las muestras de tejido fueron recogidas por el cirujano operador en condiciones estériles inmediatamente después de la aspiración y transferidas al laboratorio en recipientes estériles sobre hielo en un plazo de 30 minutos.

Tamaño de la muestra: En total se incluyeron 6 donantes en este estudio, compuestos por 3 donantes más jóvenes (edad: 27,00 ± 4,58 años) y 3 donantes mayores (edad: 62,33 ± 4,04 años).

Procesamiento de tejidos: Transfiere fragmentos de tejido adiposo a un tubo cónico de 50 mL, centrifugar a 1.800 x g durante 3 minutos a 4 °C y aspirar cuidadosamente la fase superior oleosa (para eliminar el exceso de lípidos). Añadir colagenasa tipo IV al 0,2% (volumen final: 5-10 mL por 1 g de tejido adiposo) al pellet, luego colocar el tubo en un baño maria o incubadora a 37 °C durante 45 minutos. Agita suavemente el tubo cada 10-15 minutos durante la digestión para asegurar un contacto uniforme entre la colágenosa y el tejido. Tras la digestión, terminar la reacción añadiendo DMEM de baja glucosa suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina (relación de volumen entre el medio neutralizante y la solución de colagénasa = 1:1).

PRECAUCIÓN: Al manipular colagénasia, lleva guantes desechables, bata de laboratorio y gafas de seguridad para evitar el contacto visual y de piel, prepara y utiliza el reactivo en un armario de seguridad biológica (BSC) para evitar la contaminación por aerosoles y, en caso de derrame, limpia inmediatamente con etanol al 75% y deshazte de los materiales contaminados como residuos biológicos.

Aislamiento celular: Centrifuga la mezcla de digestión neutralizada a 1.200 x g durante 10 minutos a 4 °C para pelletar las células. Descarte el sobrenadante, luego vuelva a suspender el pellet en un tampón de lisis de eritrocitos (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA; pH 7,4; volumen: 2-3 mL por pellet) e incubar a temperatura ambiente (22-25 °C) durante 5 minutos para lisar los glóbulos rojos residuales. Filtrar la suspensión celular secuencialmente a través de coladores de 200 μm para eliminar los restos de tejido no digerido y obtener una suspensión unicelular.

Recuento de células: Antes de la siembra, el número de células se cuantificó usando un hemocitómetro. En resumen, se desprendieron hADSC con tripsina-EDTA al 0,25%, se resuspendieron en medio de cultivo y se mezclaron 1:1 con solución azul de tripán al 0,4%. Las células viables (no teñidas) se contaron manualmente usando un hemocitometro de Neubauer bajo un microscopio óptico, y el número total de células viables se calculó como: número de células/mL = (células contadas promedio x factor de dilución x 104).

Cultivo celular: Siembra las células filtradas a una densidad de 5 x 103 células/cm2 en medio de crecimiento (DMEM bajo en glucosa + 10% FBS + 1% penicilina/estreptomicina) e incubar a 37 °C con 5% de CO2. Sustituye el medio cada 2-3 días para eliminar las células no adherentes y mantener condiciones óptimas de cultivo. Todos los hADSC utilizados en experimentos posteriores —incluyendo caracterización celular (detección de marcadores superficiales, ensayos de diferenciación trilineal), estimulación DCEF, análisis de migración y morfología, ensayos de senescencia/proliferación y secuenciación de ARN— estaban en el paso 3 al pasaje 5.

Caracterización hADSC
Expresión de marcadores en la superficie celular: Cultivar células hasta una confluencia del 70%, luego disociar las células adherentes con 0,25% de tripsina-EDTA (incubar a 37 °C durante 3 minutos). Centrifuga la suspensión de la celda a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C, descarta el sobrenadante y vuelve a suspender la pila en 1x PBS (volumen: 1-2 mL). Alicuota 1 x 105 células por muestra (resuspendida en 100 μL de 1x PBS) y añadir anticuerpos conjugados fluorescentes en las diluciones especificadas: anti-CD44 (1:50), anti-CD90 (1:100), anti-CD29 (1:50), anti-CD73 (1:50) y anti-CD105 (1:20)1,4,7. Incuba la mezcla de anticuerpos y células a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad para evitar el apagado con fluoróforo. Tras la incubación, centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos a 4 °C y aspirar completamente el sobrenadante. Resuspende el pellet en 1-2 mL de 1x PBS, centrifuga de nuevo a 1.000 x g durante 3 minutos a 4 °C, descarta el sobrenadante y repite este proceso de lavado dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos. Finalmente, resuspende el pellet celular en 200 μL de PBS 1x fresco, adquiere datos de fluorescencia usando un citómetro de flujo y realiza un análisis cuantitativo con el software FlowJo (v10). El flujo de trabajo de gating siguió los procedimientos estándar de fenotipado MSC: compuerta FSC-SSC para excluir residuos y seleccionar la población celular principal en función del tamaño y la granularidad, seguida de la exclusión doble usando gráficos FSC-A vs. FSC-H y SSC-A vs. SSC-H para asegurar eventos de célula única. Después, se realizó un gating de células vivas para excluir células muertas tripan-azul-positivas o PI-positivas. Se realizó gating de fluorescencia para controles con una sola tinción, y se usaron controles sin tinción para establecer umbrales para CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (marcadores positivos) y CD34, CD45 (marcadores negativos). Se exportaron y analizaron parcelas de gating representativas para confirmar la identidad de los hADSC.

Potencial de diferenciación
Diferenciación adipogénica: Cosechar hADSC de generación P3 con confluencia del 85% usando 0,25% de tripsina-EDTA, luego sembrarlos en placas de 24 pozos con una densidad de 1 x 10⁵ células por pozo (usando medio DMEM completo) e incubar a 37 °C con 5% deCO2 hasta que las células alcancen de nuevo el 85% de confluencia. Para la inducción, utiliza el kit de diferenciación de adipogénesis, reconstituyendo el componente A del kit (inductor adipogénico) y el componente B (mantenedor adipogénico) según el manual, y utiliza el componente A durante los primeros 3 días antes de cambiar al componente B durante 1 día. Repite este ciclo durante 3 semanas. Para la tinción, aspira el medio de inducción, lava suavemente las células con 3 mL de 1x PBS (evita alterar las capas celulares), fija las células con paraformaldehído (PFA) al 4% a temperatura ambiente durante 20 minutos y luego incuba con una solución de 0,3% de aceite rojo O (preparada en 60% de isopropanol) a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lava las células 3 veces con 1 PBS para eliminar el exceso de tinte y luego toma imágenes de gotas lipídicas usando un microscopio de luz invertida (20 veces).

Diferenciación osteogénica: Semilla hADSC en placas de 12 pozos con una densidad de 1 x 10⁵ células por pozo, y cuando las células alcancen un 85% de confluencia, utiliza el kit de diferenciación osteogénesica para inducción: reconstituir el componente A del kit (inductor osteogénico) y el componente B (suplemento osteogénico) en DMEM de baja glucosa (concentraciones finales: 10% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 0,1 μM dexametasona, 10 mM β-glicerofosfato, 0,05 mM de ácido-2-fosfato ascórbico) y refresca el medio cada 3 días durante 3 semanas. Para teñir, fija las células con 4% de PFA a temperatura ambiente durante 15 minutos, lava 3 veces con 1 PBS y luego incuba con una solución de Alizarina Roja S al 2% (pH 4,2, preparada en agua desionizada) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lava las células 3 veces con 1 PBS para eliminar la tinción no unida, luego fotografía los nódulos depositados en calcio bajo un microscopio de contraste de fase (20x) y cuantifica la mineralización midiendo el área de nódulos S-positivos en rojo de alizarina usando el software ImageJ.

Diferenciación condrogénica: Centrifugar 250.000 hADSC a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C en un tubo cónico de 15 mL para formar un pellet celular, añadir 500 μL de medio DMEM completo al tubo e incubar durante la noche a 37 °C con 5% deCO2 para estabilizar el pellet. Al día siguiente, utiliza el kit de diferenciación de condrogénesis para la inducción: reconstituye el componente A del kit (inductor condrogénico) en un medio independiente de CO2 (concentraciones finales: 1% penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL ácido ascórbico-2-fosfato, 100 μg/mL piruvato sódico) y refresca suavemente el medio cada 3 días (evitando molestar el pellet). Tras 3 semanas de inducción, fijar el pellet celular con PFA al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos, aspirar el fijador, incubar con solución de Toluidina Blue O al 0,1% (p/v) (preparada en buffer de acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0) a temperatura ambiente durante 15 minutos, aspirar la mancha, enjuagar el pellet 3 veces con agua desionizada para eliminar el exceso de colorante. luego se toma imágenes bajo un microscopio de campo claro (20x) y se cuantifica la acumulación de proteoglicanos sulfatados midiendo la densidad óptica media (OD) de la tinción con Toluidina Blue O usando el software ImageJ.

PRECAUCIÓN: Al manipular PFA al 4% (un reactivo tóxico y corrosivo), actúa exclusivamente en una campana extractora usando guantes desechables, bata de laboratorio y gafas de seguridad para evitar inhalar vapor o contacto con piel y ojos — si ocurre contacto, enjuágalo inmediatamente con agua corriente durante 15 minutos y busca atención médica. Para la eliminación de residuos peligrosos, recolecta materiales usados contaminados con PFA y PFA (por ejemplo, puntas de pipeta, placas) en un contenedor dedicado a residuos químicos etiquetado como PFA Waste y deshazte de ellos siguiendo protocolos institucionales de residuos peligrosos, asegurando no mezclarse con residuos biológicos.

Montaje de cámaras electrotaxis: Perfora dos agujeros (0,75 cm de diámetro) en extremos opuestos de la línea central sobre una tapa de placa de Petri de 10 cm, situada a 1 cm del borde del plato (para acomodar puentes de agar-sal). Aplica una capa fina de grasa al vacío (≤ 2 cm de largo ≤ 1 cm de ancho) en la parte inferior de la placa de Petri a lo largo de la línea central, a 4 cm de cada borde (Figura 1A). Con pinzas estériles de punta fina, coloca una capa de cubierta de cristal estéril de 1 cm x 2 cm en cada parche de grasa y presiona suavemente para asegurar un sellado hermético (evitar roturas de la cubierta; Figuras 1B-C). Aplica otra capa fina de grasa al vacío encima de cada cubierta adherida, luego coloca una segunda cubierta de cristal estéril de 1 cm x 2 cm directamente sobre la grasa para formar una pila de doble cubierta. Presiona suavemente para asegurar un sellado hermético entre las dos cubiertas (evitar fugas medias; Figura 1D). A lo largo de la línea diagonal que conecta la esquina superior izquierda de una pila de cubiertas con el borde de la antena más cercana, y la esquina inferior derecha de la pila opuesta al borde más cercano, se aplica grasa al vacío para formar una pared barrera continua. La pared debe estar firmemente adherida al fondo del plato (sin huecos) y medir aproximadamente 2 cm de altura y 0,5 cm de ancho (Figura 1E). Esterilizar la cámara ensamblada bajo luz ultravioleta durante 20 minutos (para eliminar la contaminación microbiana), y luego almacenarla a temperatura ambiente en condiciones estériles hasta su uso (Figura 1F).

Estimulación DCEF: Colocar láminas de vidrio estériles (para la siembra celular) en una placa de Petri de 10 cm e incubar durante la noche a 37 °C con un 5% deCO2 para preacondicionar las láminas (favorecer la adhesión celular). Preparar la solución de Steinberg diluyendo 10 mL de solución original 10x en 90 mL de ddH2O (estéril; concentraciones finales: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO3)24H2O, 0,83 mM MgSO47H2O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Añadir 0,3 g de agar a 20 mL de la solución de Steinberg preparada, cocinar al microondas durante 20 s hasta que el agar esté completamente disuelto y la solución clara, luego rellenar inmediatamente puentes de sal de vidrio personalizados con la mezcla caliente de agar-Steinberg y dejar que se solidifique a temperatura ambiente. Tras la solidificación, esteriliza los puentes salinos bajo luz UV durante 15 minutos y esteriliza dos vasos de precipitados (cada uno con 30 mL de solución de Steinberg) bajo luz UV durante 15 minutos. Siembra hADSC de generación P3 en las láminas estériles preacondicionadas a una densidad de 2 x 10⁴ células/cm², incuba a 37 °C con 5% deCO2 durante 24 horas para permitir la adhesión celular, luego transfiere las láminas sembradas en celda a la pista de la cámara de electrotaxia ensamblada y fijarlas con portaobjetos laterales estériles (para evitar movimientos). Sella la pista colocando una cubierta de cristal de 3 cm x 2 cm sobre la grasa al vacío, presionando suavemente para asegurar un sellado hermético y aplicando grasa adicional al vacío a lo largo de los bordes de la cubierta superior para formar una barrera (evitar la evaporación media). Llenar los depósitos de la cámara con un medio independiente de CO2 (suplementado con 10% de FBS y 1% penicilina/estreptomicina; volumen: 5-8 mL por depósito), insertar los puentes esterilizados de sal de agar a través de los orificios de la tapa de la placa de Petri (con un extremo sumergido en el depósito del medio de la cámara y el otro extremo en los vasos de precipitados rellenos de solución de Steinberg), y conectar los vasos a una fuente de alimentación mediante electrodos de Ag/AgCl (para suministrar una corriente continua estable). Aplicar un campo eléctrico de corriente continua (DCEF) de 2 V/cm durante 4 horas, monitorizar el voltaje cada 15 minutos usando un multímetro digital (ajustar si es necesario para mantener una intensidad de campo constante) y capturar imágenes en time-lapse de la migración celular cada 5 minutos en 4 campos aleatorios usando el software (modo objetivo 5x, campo claro).

NOTA: Al utilizar equipos eléctricos, asegúrese de que la fuente de alimentación y los electrodos estén secos y colocados sobre una superficie no conductora para evitar descargas eléctricas. Lleva guantes aislantes al conectar o desconectar electrodos, apaga la corriente antes de ajustar el sistema y, en caso de fugas de medio en componentes eléctricos, apaga la corriente inmediatamente y límpiate con papel absorbente empapado en etanol al 75%. En este estudio, minimizando el grosor de la cámara de electroforesis y manteniéndola en aproximadamente 1 mm, junto con la realización de mediciones de voltaje multipunto en ambos extremos de la cámara, la variación en la intensidad del campo se controló dentro del 10%. Bajo estas condiciones, se considera que la distribución del campo eléctrico dentro del área de cultivo es esencialmente uniforme26.

Análisis de migración y morfología
Imagen en vivo: Para hADSC bajo estimulación DCEF, importa las secuencias de imágenes en time-lapse (intervalos de 5 minutos) al software ImageJ, rastrea manualmente 100 celdas a través de 4 campos independientes desde el inicio (t=0) hasta el final de la estimulación (t=4 h) usando el plugin Manual Tracking, y calcula la velocidad media de migración (μm/min) y la direccionalidad (relación D/T, donde D = distancia en línea recta desde el inicio hasta el final, T = longitud total del camino) usando el plugin Chemotaxis Tool (ImageJ).

Seguimiento: Calcular los siguientes parámetros de migración para cuantificar el comportamiento electrotáctico: Dirección (Σcosθi/n, donde θi es el ángulo entre el vector de desplazamiento de la célula y la dirección del campo eléctrico (EF), y n es el número total de celdas rastreadas, que van de -1 a 1 con valores más cercanos a 1 que indican una migración dirigida al ánodo más fuerte), Distancia acumulada (longitud total del camino recorrida por cada célula durante el periodo de estimulación, en μm), Velocidad de Seguimiento (distancia acumulada dividida por el tiempo de estimulación, en μm/h) y Distancia Euclidiana (desplazamiento recta de principio a fin de cada celda, en μm, reflejando la migración neta).

Morphometría: Tras la estimulación DCEF, fijar las células con un 4% de PFA a temperatura ambiente durante 20 minutos, lavar 3 veces con 1 PBS, teñir el citoesqueleto con Phalloidin-TRITC (dilución 1:500 en 1x PBS; volumen: 200 μL por pozo para placas de 24 pozos) a temperatura ambiente durante 30 minutos (para marcar F-actina), y contratiner núcleos con DAPI (1 μg/mL en 1x PBS; volumen: 100 μL por pozo) durante 5 minutos. Las células fueron fotografiadas usando un microscopio de fluorescencia a una magnificación de 20x (con imágenes representativas de alta resolución capturadas a 40x). Phalloidin-TRITC se visualizó usando una longitud de onda de excitación de 540-555 nm y una longitud de onda de emisión de 565-580 nm, mientras que DAPI se visualizó usando una longitud de onda de excitación de 358-405 nm y una longitud de onda de emisión de 420-480 nm. Luego mide los siguientes parámetros morfológicos en ImageJ: Eje largo (diámetro máximo de Feret, la distancia más larga entre dos puntos cualesquiera en el perímetro de la celda), Longitud vertical (ancho de la celda perpendicular al eje largo) y Verticalidad (sinα, donde α es el ángulo entre el eje largo de la celda y la dirección de la EF, con valores más altos que indican una mayor alineación con la EF).

Ensayos de senescencia y proliferación
Tinción SA-β-Gal: Utiliza un kit de detección de senescencia para identificar células senescentes (células teñidas de azul) bajo un microscopio de campo claro (objetivo 20x). Semillar hADSC de generación P3 en placas de 6 pozos a una densidad de 2 x 105 células por pozo, cultivar hasta el 80% de confluencia, aspirar el medio, lavar suavemente las células 3 veces con 1x PBS, añadir 1 mL de solución fijadora (incluida en el kit) por pozo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos, lavar las células 3 veces con 1 PBS para eliminar el fijador residual tras la fijación, añadir 0,5 mL de solución de trabajo de tinción SA-β-gal (preparada mezclando 50 μL de sustrato SA-β-gal con 450 μL de tampón de tinción según el manual del kit) por pozo, sellar la placa con película transparente (para evitar la evaporación), incubar durante la noche (16-18 h) a 37 °C (evitar la exposición al CO2 , ya que altera el pH e inhibe la actividad enzimática). captura imágenes en campo claro de ≥10 campos aleatorios por pozo (objetivo 10x) al día siguiente, cuenta el número de celdas teñidas de azul (SA-β-gal+) y el total de celdas, y calcula el porcentaje de celdas senescentes como (Número de celdas SA-β-gal+ / Número total de celdas) x 100.

Inmunotinción Ki67
Tras la tinción en SA-β-gal, aspirar la solución de tinción, lavar las células dos veces con 1 PBS, permeabilizar las membranas celulares con 0,1% de Triton X-100 (preparado en 1x PBS; 1 mL por pozo) a temperatura ambiente durante 10 minutos, y bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos con un 5% de BSA (en 1x PBS; 1 mL por pozo) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se incubaron con anticuerpo primario Anti-Ki67 (dilución 1:200 en 1% de BSA/PBS; 500 μL por pozo) a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, se lavaron las células 3 veces con 1 PBS (5 min cada una), eliminaron el anticuerpo primario no unido e incubaron con anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488-488 (dilución 1:500 en 1% BSA/PBS; 500 μL por pozo) a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad. Las células se lavaron de nuevo 3 veces con 1 PBS y se contra-tintaron con DAPI (1 μg/mL en 1 PBS; 200 μL por pozo) durante 5 minutos. Las imágenes de fluorescencia se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia a una ampliación de 20x (con imágenes representativas de alta resolución obtenidas a 40x). Las células Ki67+ marcadas con Alexa Fluor 488 se visualizaron usando una longitud de onda de excitación de 485-495 nm y una longitud de onda de emisión de 515-545 nm, mientras que los núcleos teñidos con DAPI se imaginaron usando una longitud de onda de excitación de 358-405 nm y una longitud de onda de emisión de 420-480 nm. El porcentaje de células proliferativas se calculó como: (Número de células Ki67+ / Número de núcleos DAPI+ ) x 100.

NOTA: Al manipular anticuerpos primarios y secundarios, actúe en un BSC para evitar la contaminación, alicuota de anticuerpos en volúmenes de un solo uso para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, y recoge materiales contaminados con anticuerpos (por ejemplo, puntas de pipeta, placas) en una bolsa dedicada de residuos biológicos autoclavable para su esterilización mediante autoclave antes de su eliminación.

Análisis electrotaxico dependiente de la edad en hADSC: Utilizar una fuente de alimentación de pulsos de corriente continua para generar DCEF de tres intensidades: 0 mV/mm (control), 100 mV/mm y 200 mV/mm, emplear una estación de trabajo de células vivas para observar y registrar la migración celular en tiempo real y, para cada intensidad de EF, comparar cuantitativamente la capacidad de migración anodal de hADSC de donantes jóvenes y ancianas midiendo la Distancia Acumulada, Distancia euclidiana, velocidad de seguimiento y dirección, con tres réplicas biológicas independientes por grupo para garantizar la fiabilidad del resultado. Los parámetros de migración electrotáctica se cuantificaron utilizando los plugins Manual Tracking y Chemotaxis Tool en ImageJ (NIH). Las células individuales se rastrearon manualmente durante todo el periodo de estimulación de 4 horas, y se calcularon los siguientes parámetros según métodos estándar: Distancia acumulada: la longitud total del camino recorrida por cada célula durante el periodo de registro. Distancia euclidiana: la distancia en línea recta entre las posiciones inicial y final de la celda. Velocidad de la vía: distancia acumulada dividida por el tiempo total de seguimiento (μm/h). Dirección: calculada como el coseno medio del ángulo (θ) entre cada vector de desplazamiento y el vector del campo eléctrico (los valores varían de -1 a 1; valores más cercanos a 1 indican una fuerte migración anodal).

Secuenciación de ARN
Extracción y preparación de ARN: Esteriliza un recipiente lleno de hielo bajo luz UV durante 15 minutos (para mantener la estabilidad del ARN) y realiza todos los pasos siguientes sobre hielo. Transfiere las láminas de vidrio con semillas de hADSC (1 cm x 2 cm) desde la cámara electrotaxia a una placa de Petri estéril, lava las células 3 veces con 3 mL de PBS 1x helado (añade PBS suavemente, agita ligeramente y aspira completamente para eliminar el medio residual), luego añade 1 mL de reactivo de trizol a cada lámina e incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos para lisar completamente las células (asegúrate de que el lisado cubra toda la capa celular). Transfiere el lisato a un tubo de centrífuga libre de RNasa de 1,5 mL, añade 0,2 mL de cloroformo, usa un vórtice vigoroso durante 15 s para inducir la separación de fases, incuba el tubo sobre hielo durante 15 minutos y luego centrifuga a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. Esto separa el lisato en tres capas: la fase acuosa superior que contiene ARN, la capa intermedia de proteínas y la fase orgánica inferior. Transfiere cuidadosamente la fase acuosa superior (≈ 0,5 mL) a un nuevo tubo libre de RNasa (evitar tocar la capa media), añadir 0,5 mL de isopropanol, aplicar un vórtice suave para precipitar ARN, incubar sobre hielo durante 10 minutos y luego centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 °C; El ARN formará un pellet blanco en la parte inferior del tubo. Desechar el sobrenadante, repetir la precipitación de isopropanol una vez para mejorar la pureza del ARN, aspirar completamente el sobrenadante, secar al aire el pellet de ARN en un BSC a temperatura ambiente durante 5-10 minutos (no secarlo en exceso, ya que esto reduce la solubilidad), resuspender el pellet de ARN en 30 μL de agua tratada con DEPC, incubar a 55 °C durante 10 minutos para facilitar la disolución, cuantificar la pureza del ARN midiendo la relación A260/A280 (objetivo: 1,8-2,0) usando un espectrofotómetro, evaluar la integridad del ARN usando un nanochip de ARN; objetivo: Número de Integridad del ARN [RIN] > 8,0, y almacenar muestras de ARN calificadas a -80 °C hasta la secuenciación.

PRECAUCIÓN: El trizol y el cloroformo son tóxicos, volátiles y cancerígenos, por lo que manejalos exclusivamente en una campana extractora usando guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas de seguridad; evita inhalar vapores, limpia con papel de cocina y enjuágalos con agua y jabón durante 10 minutos si se derraman en la piel, y no mezcles con lejía u otros agentes oxidantes (ya que pueden producir gases tóxicos). Para la eliminación de residuos peligrosos relacionados con la extracción de ARN, recoge mezclas, sobrenacionantes de isopropanol y tubos contaminados en un recipiente sellado y resistente químicamente etiquetado como residuos de ARN (no mezclar con residuos acuosos o biológicos) y deshazte siguiendo los protocolos institucionales de residuos peligrosos, asegurando no verter por los desagües.

Preprocesamiento de datos y control de calidad: Preparar bibliotecas de secuenciación usando el Kit de Preparación de la Biblioteca VAHTS mRNA-seq siguiendo el protocolo del fabricante: enriquecer ARNm usando perlas magnéticas oligo(dT), fragmentar ARNm en fragmentos de 200-300 bp usando cationes divalentes, sintetizar ADNc de primera cadena usando hexámeros aleatorios seguidos de ADNc de segunda cadena, realizar reparaciones de extremos, añadir colas A, ligar adaptadores de secuenciación, amplificar bibliotecas por PCR y purificar con perlas. Secuenciar las bibliotecas en una plataforma de secuenciación (lecturas terminales emparejadas de 150 bp), generando aproximadamente 50 millones de lecturas en bruto por muestra, luego usar un software para recortar lecturas de baja calidad (eliminar lecturas con >50% de bases con puntuación de calidad Phred <20) y secuencias adaptadoras, conservando aproximadamente 48 millones de lecturas limpias por muestra (Q30 > 90%) para análisis posteriores tras el recorte.

Análisis de bioinformática: Alinear las lecturas limpias al genoma de referencia humano (GRCh38/hg38) usando el software Hisat2 v2.2.1 y guardar los resultados de alineación como archivos BAM, usar el software htseq-count v0.13.5 para contar el número de lecturas asignadas a cada gen (basado en las anotaciones de genes de Ensembl), normalizar los datos de recuento génico usando la función estimateSizeFactors del paquete DESeq (2012) R para eliminar los efectos por lotes y las diferencias en la profundidad de secuenciación, y realizar análisis de expresión diferencial usando la función nbinomTest (paquete DESeq), seleccionando genes expresados diferencialmente (DEGs) usando umbrales de cambio de plegamiento (FC) > 2 y el valor p ajustado (padj) < 0,05. Realizar análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) (proceso biológico, función molecular, componente celular) y análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG) en DEGs utilizando el paquete clusterProfiler v4.0 R, centrándose en enriquecimientos relacionados con la migración celular (por ejemplo, adhesión celular, migración celular), transporte iónico (por ejemplo, transporte transmembrana de iones de sodio) y vías de señalización (por ejemplo, vía de señalización PI3K-Akt). Realizar agrupamiento jerárquico no supervisado en DEGs usando el paquete pheatmap v1.0.12 R y visualizar patrones de expresión génica entre muestras mediante un mapa de calor (puntuaciones z escaladas por filas).

Análisis estadístico: Todos los datos experimentales se presentan como Medio ± Error Estándar de la Media (Media ± SEM), con al menos 3 réplicas biológicas independientes por grupo (n ≥ 3). Utiliza el test t de Student para comparar diferencias entre dos grupos (por ejemplo, donantes jóvenes vs. ancianos) y el Análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido del test post-hoc de Tukey para comparar diferencias entre tres o más grupos (por ejemplo, diferentes intensidades de EF), realizando análisis estadísticos usando el software SPSS 23.0 y definiendo la significación estadística de la siguiente manera: *p < 0,05, **p < 0,01, p < 0,001.

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Results

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La aplicación de campos eléctricos guía la migración direccional de los hADSC y mejora su capacidad migratoria
Los hADSC extraídos exhibieron marcadores típicos de superficie de células madre mesenquimales (por ejemplo, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) y poseían potencial de diferenciación trilineal (adipogénico, osteogénico, condrogénico; Figura 2A), cumpliendo los criterios estándar para la identificación de hADSC. Aplicamos campos eléctricos de corriente continua (DCEF) ...

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Discussion

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Al principio del proceso de reparación y regeneración de lesiones tisulares, los campos eléctricos emergen como una de las primeras señales físicas establecidas en el microambiente. Sus propiedades direccionales están espaciotemporalmente correlacionadas con el reclutamiento celular en el sitio delesión 27. Los campos eléctricos endógenos se originan a partir del potencial transepitelial generado por el transporte de iones polarizados en los tejidos epiteliales. C...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos sinceramente al Departamento de Cirugía Plástica del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China (Shenyang, China) y al Instituto de Curas Regenerativas de la Universidad de California, Davis (CA, EE. UU.) por su provisión de infraestructura experimental crítica y recursos de investigación compartidos que permitieron este estudio. También expresamos nuestro agradecimiento a Shanghai OE Biotech Co., Ltd. por su apoyo técnico en secuenciación de ARN y análisis bioinformático.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4° C/-20° C/-80° Frigorífico CHaier, ChinaHYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
AgarHUSHI, China10000561
Bioanalizador Agilent 2100Agilent Technologies, Estados UnidosG2939BA
Alizarin Red S Sigma-Aldrich, Estados UnidosA5533
Armario de Bioseguridad  Thermo Fisher Scientific, Estados Unidos1300 A2 1,5 m
CaNO3· 4H2OHUSHI, China10013960
CentrifugadoraThermo Fisher Scientific, Estados UnidosX4R Pro y nbsp;
Incubadora CO2Thermo Fisher Scientific, Estados UnidosForma Steri-Cycle 3307 
Colagenasa Tipo IVBiosharp, China y nbsp;BS076
Microscopio ConfocalZEISS, AlemaniaLSM 900
Fuente de alimentación de pulsos de corriente continua  Daedo Powertronics, CoreaDDP-500
DexametasonaSigma-Aldrich, Estados UnidosD4902
Multímetro digitalFluke, Estados UnidosFLUKE-175
DMSOSigma-Aldrich, Estados UnidosD2650
Balanza electrónica y equilibrio electrónico;Sartorius, Alemania y nbsp;BSA224S-CW
FBS Gibco, Estados Unidos10270-106
Citómetro de flujoThermo Fisher Scientific, Estados UnidosA24858
IBMX (1-Metil-3-isobutilxantina)Sigma-Aldrich, Estados UnidosI7018
Indometacina   Sigma-Aldrich, Estados UnidosI7378
InsulinaSigma-Aldrich, Estados UnidosI5500   
Microscopio invertidoZEISS, AlemaniaAxio Observer 7 / ACR
ITS-GSigma-Aldrich, Estados UnidosI3146
KClHUSHI, China10019318
KH2PO4HUSHI, China10019320
Ácido linoleico y nbsp;Sigma-Aldrich, Estados UnidosL1376
Estación de Celular en VivoLive Cell Instrument, CoreaChamlide TC 
DMEM de baja glucosaGibco, Estados Unidos11885084
MgSO4· 7H2O HUSHI, China10019322
Na2HPO4· 12H2OHUSHI, China10019324
NaClHUSHI, China10019318
Espectrofotómetro NanoDrop 2000Thermo Fisher Scientific, Estados UnidosND-2000
Oil Red OSigma-Aldrich, Estados UnidosO0625
Penicilina/EstreptomicinaGibco, Estados Unidos15140122
PipetasEppendorf, Alemania y E 4920000061
SYBR Premix EX TaqTakara, China y nbsp;RR420A
Toluidine Blue O         Sigma-Aldrich, Estados UnidosT3260
TrisHUSHI, China10019326
TRIzolBeyotime, ChinaR0016
Tripsina-EDTAGibco, Estados Unidos25200056
Microscopio verticalZEISS, Alemania415200-0000-000 
Grasa al vacíoDOW CORNING, Estados Unidos1597418
Vitamina C y Vitamina;    Sigma-Aldrich, Estados UnidosA4544
Sistema de Purificación de AguaThermo Fisher Scientific, Estados Unidos  GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-Glicerofosfato Sigma-Aldrich, Estados UnidosG9422

References

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Adipose Derived Stem CellsElectrotaxisElectric Field StimulationAge Dependent MigrationStem Cell MigrationRNA SequencingSodium Channel ActivityPI3K Akt SignalingTissue RegenerationWound Healing

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