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Un procedimiento paso a paso para producir quimeras germinales en pollo mediante trasplante de células germinales primordiales

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DOI:

10.3791/69704

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5 de diciembre de 2025

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1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

En este artículo

Resumen

Las quimeras de la línea germinal aviar, generadas por el trasplante de células germinales primordiales (PGCs) en embriones receptores, permiten aplicaciones en transgénesis, edición genética y conservación de especies. Este protocolo detalla los procedimientos para el aislamiento de PGC, la expansión in vitro , la microinyección y la verificación de donantes, proporcionando una plataforma fiable para producir quimeras germinales y avanzar en la biotecnología aviar.

Resumen

La generación de quimeras germinales en pollos mediante trasplante de células germinales primordiales (PGCs) proporciona una plataforma robusta y reproducible para la transgénesis aviar, la edición genómica y la conservación de especies. Los enfoques tradicionales que utilizan células blastodérmicas de embriones EGK en estadio X están limitados por la baja eficiencia de transmisión de la línea germinal debido a la segregación temprana de la línea celular. En contraste, las estrategias mediadas por PGC aprovechan la competencia germinal intrínseca de estas células unipotentes, permitiendo una incorporación fiable en las gónadas receptoras. Aquí presentamos un protocolo paso a paso para aislar los PGC de embriones de estadio 26-28 de HH, mantenerlos y expandirlos in vitro, y trasplantarlos a la aorta dorsal de embriones receptores en estadio 14-17 de HH. El enjerto a corto plazo se monitoriza mediante marcadores fluorescentes como PKH26, mientras que la contribución a largo plazo en la línea germinal se confirma mediante análisis PCR de gónadas receptoras. Este enfoque garantiza la generación consistente de quimeras germinales mientras preserva la viabilidad y competencia funcional de los PGC donantes. Además, el método es compatible con herramientas de edición genómica como CRISPR/Cas9 y vectores basados en transposones, permitiendo la producción de modelos aviares transgénicos y editados genéticamente. Más allá de la investigación básica, esta estrategia apoya los esfuerzos de conservación mediante la transmisión de la línea germinal entre especies y la preservación de recursos genéticos. En conjunto, este protocolo proporciona un marco integral y fiable para manipular la línea germinal aviar, proporcionando una plataforma versátil tanto para estudios fundamentales como aplicados en biotecnología avícola.

Introducción

La transmisión mediada por la línea germinal primordial de células germinales (PGC) es el método más eficiente para transferir información genética a la siguiente generación enaves 1,2,3. Las quimeras germinales, definidas como individuos que portan células germinales tanto de donante como de hospedador, permiten la transmisión de material genético del donante a la descendencia, apoyando aplicaciones en transgénesis, genómica funcional y conservación de especies enpeligro 4,5,6,7,8. A diferencia de los enfoques que dependen de células blastodérmicas, las estrategias mediadas por PGC proporcionan una mayor eficiencia y reproducibilidad en la transmisión de la línea germinal, lo que las hace muy adecuadas para una manipulación genética precisa.

En especies aviares, los PGC se originan en la región central de pellúcidas del blastodermo en laetapa X 9 de Eyal-Giladi y Kochav (EGK) y posteriormente migran a la media luna germinal en la etapa 4 10 de Hamburger y Hamilton (HH). Entre las etapas 9 y 12 de la HH, los PGC circulan a través de vasos sanguíneos embrionarios antes de depositarse en la dorsalgonadal 11, 12 y 13. Estos patrones migratorios distintivos permiten el aislamiento de los PGCs en múltiples etapas, incluyendo la media luna germinal, la sangre circulante ylas gónadas 14. Cabe destacar que los PGC extraídos de gónadas de la etapa 26-28 de la HH y trasplantados a embriones receptores de la etapa 14-17 de la HH han demostrado una competencia óptima en la línea germinal y eficiencia en el enfraterto, proporcionando un marco práctico para la aplicación estandarizada de este protocolo.

Los PGC pueden mantenerse y expandirse in vitro manteniendo la identidad y la capacidad de transmisión de la línea germinal, lo que permite su uso para una modificación genética estable. La producción de quimeras germinales mediada por PGC se ha utilizado para generar aves transgénicas que expresan proteínas recombinantes, trazas de línea germinal, manipulan las vías de determinación sexual y conferen resistencia a enfermedadesinfecciosas 6,15,16,17,18,19. Además, el trasplante de PGC facilita la transmisión interespecie de la línea germinal y la conservación del germoplasma aviaren peligro 7,8,20,21,22,23, y la criopreservación de PGC permite la preservación a largo plazo de los recursos genéticos 24,25.

Aunque se han explorado otros tipos de células madre, incluyendo células madre embrionarias (CECs)26,27,28,29, células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)30,31,32 y células madre espermatogoniales (SSCs)33,34, para la modificación de la línea germinal aviar, su eficiencia de transmisión germinal sigue siendo inferior a la de los sistemas basados en PGC, que actualmente se consideran los más fuente fiable de células competentes en la línea germinal.

En los estudios de quimeras germinales, la elección de la raza donante es fundamental para distinguir las células germinales derivadas del donante de las células derivadas del huésped. El Pollo Ogye Coreano (KOC) posee el alelo recesivo i/i responsable de la piel y plumas negras, que se distingue fácilmente de la línea White Leghorn que lleva el alelo dominante I/I 35,36. Esta diferencia visible permite la identificación inequívoca de la descendencia de donante durante el análisis de transmisión de la línea germinal, al tiempo que apoya la conservación de la biodiversidad debido al valor genético autóctono del KOC.

En general, la producción de quimeras germinales mediada por PGC proporciona una plataforma sólida para la biotecnología aviar (Figura 1). Al especificar las etapas óptimas de donante (HH26-28) y receptor (HH14-17) e incorporar pasos definidos de cultivo y validación, este protocolo permite una transmisión eficiente por línea germinal y proporciona un marco práctico para la generación de aves transgénicas y editadas por genoma, así como para la preservación de valiosos recursos genéticos aviares.

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Protocolo

Todos los procedimientos que involucran pollos fueron aprobados por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional de Seúl, Corea del Sur (número de aprobación IACUC: SNU-250226-4). Los animales se mantenían bajo condiciones controladas e higiénicas, con agua y pienso esterilizados. Además, todos los residuos químicos y biológicos generados durante los procedimientos, incluidas las soluciones de tripsina/EDTA, células marcadas con PKH26 y tejidos embrionarios o gonadiles, fueron manipulados y eliminados conforme a las directrices institucionales de bioseguridad y gestión de residuos peligrosos de la Universidad Nacional de Seúl. Todos los reactivos y equipos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales. Los medios y reactivos de PGC utilizados para muestreo de gónadas y cultivo celular de embriones donantes deben ser estériles.

1. Aislamiento de los PGC de pollo

  1. Incubar huevos frescos fertilizados en la etapa X de Eyal-Giladi y Kochav (EGK) a 37 °C durante 5,5 días hasta que los embriones alcancen las etapas 26-28 de HH.
    NOTA: Mantener la humedad entre el 60% y el 65% para asegurar un desarrollo embrionario normal.
  2. Aísla cuidadosamente los embriones de los óvulos en las etapas 26-28 de HH usando pinzas estériles.
  3. Lava los embriones con 1× PBS, luego coloca el embrión sobre una placa de carbón y fíjalo con alfileres de insectos. Utilizando un estereomicroscopio, disecciona cuidadosamente las gónadas embrionarias emparejadas con pinzas afiladas.
    NOTA: Manipula los tejidos con cuidado para evitar daños y asegurar un aislamiento preciso de las gónadas. Debido a su proximidad al riñón mesonefrónico en las etapas 26-28 de la HH, puede acumularse inadvertidamente una pequeña cantidad de tejido renal; sin embargo, una disección cuidadosa bajo un estereomicroscopio y condiciones de cultivo selectivo aseguran que solo proliferen los PGC, manteniendo la pureza.
  4. Transfiere las gónadas emparejadas recogidas de tres embriones a un tubo de 1,5 mL que contiene 500 μL de tripsina/EDTA al 0,05% e incubar a 37 °C durante 5 minutos para disociar las células.
  5. Añade 50 μL de FBS para inactivar la tripsina.
  6. Centrifugar a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C). Retira cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la boluleta celular.
  7. Resuspender las células gonadales disociadas en 1 mL de 1× PBS.

2. Proliferación in vitro de los PGCs de pollos

  1. Preparar un medio de cultivo PGC (KO-DMEM suplementado con 20% FBS, 2% suero de pollo, nucleósidos, GlutaMAX, aminoácidos no esenciales MEM, 2-mercaptoetanol, 10 mM piruvato sódico, antibiótico-antimicol, 10 ng/mL bFGF) y calienta el medio a 37 °C.
  2. Añadir células gonadales disociadas recogidas de tres embriones en las etapas HH 26-28 (aproximadamente 100-150 PGCs porembrión 37,38) a 1 mL de medio de cultivo precalentado por pozo y placar las células sobre una placa de cultivo de 12 pozos.
  3. Balancea suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células.
  4. Mantener las PGC a 37 °C con un 5% de CO₂, monitorizar la morfología y la densidad celular diariamente. Las PGC permanecen redondas, refractiles y típicamente flotantes, mientras que las células somáticas son adherentes (Figura 2A).
    NOTA: Las condiciones de cultivo apoyan selectivamente la proliferación de PGCs, permitiendo que los PGCs se expandan mientras las células somáticas se eliminan gradualmente.
  5. Los PGC cultivados en una placa de 12 pozos se mantienen cambiando el medio de cultivo cada 3-4 días para favorecer una proliferación y viabilidad óptimas (Figura 2B).
  6. Opcionalmente, utiliza marcadores específicos de PGC (por ejemplo, CVH, DAZL, NANG y POUV) para verificar la pureza y realizar la determinación del sexo mediante PCR (Tabla 1).
    1. Prepara muestras de PGC para la extracción de ARN utilizando el Sistema Miniprep de ARN según las instrucciones del fabricante.
    2. Realizar RT-PCR (por ejemplo, CVH, DAZL, NANOG y POUV) o inmunotinción utilizando marcadores específicos de PGC (SSEA1 y DAZL) según los protocolosestándar 39 (Figura 2C,D).
    3. Realizar análisis PCR de sexado según protocolosestándar 40 (Figura 2E).

3. Validación de la competencia en la línea germinal de PGCs cultivados utilizando el marcado PKH26

  1. Cosechar PGCs cuando alcancen la fase de crecimiento logarítmico, normalmente a una densidad de aproximadamente 1-5 × 105 celdas por pozo en una placa de 12 pozos.
  2. Pelletar las células centrifugando a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C), resuspender en 1× PBS y evaluar la viabilidad usando azul de tripán.
  3. Preparar el Diluente C del Kit de Enlace de Células Fluorescentes Rojas PKH26 para el marcaje general de la membrana celular y equilibrarlo a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C).
  4. Reconstituir el tinte PKH26 y preparar una solución de trabajo en el diluyente C a una concentración final de aproximadamente 1-2 μM.
  5. Resuspende el pellet PGC en 1 mL de diluyente C. Añade rápidamente 1 mL de solución PKH26 (proporción 1:1), mezcla suavemente e incuba durante 2-5 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C).
  6. Añadir rápidamente 1 mL de solución de trabajo PKH26 a la suspensión celular (proporción 1:1), mezclar suavemente pipeteando e incubar a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C) durante 2-5 minutos.
    NOTA: No excedas el tiempo de incubación recomendado.
  7. Para la mancha añadiendo de 2 a 4 veces el volumen de FBS o un 1%-5% de BSA en PBS.
  8. Centrifugar a 200 × g, 5 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C); lavar tres veces con medio de cultivo PGC o 1× PBS + 0,1% de BSA.
  9. Resuspende las células en un tampón de inyección (medio de cultivo PGC o 1× PBS + 0,1% BSA) a una concentración de 1-5 × 104 a 1 ×10 5 células/μL. Manténlas brevemente en hielo para preservar la viabilidad.
  10. Verifica el marcaje bajo un microscopio de fluorescencia antes de la inyección (Figura 3A).
  11. Inyectar más de 3.000 PGCs marcados viables, contados con azul de tripán, en embriones de la etapa 14-17 de la HH e incubar hasta el día 6 (Figura 3B).
  12. Confirmar la colonización de las gónadas receptoras para el día 6 (Figura 3C).

4. Trasplante de PGC de donante en el vaso sanguíneo embrionario receptor

  1. Incubar los huevos receptores en la etapa HH 14-17 (37 °C, 60-70% de humedad, balanceándose a 45° cada hora).
  2. Prepara una micropipeta capilar de vidrio utilizando tubos de vidrio borosilicatos (1,0 mm de diámetro exterior, 0,5-0,75 mm de diámetro interior). Extrae el capilar usando un extractor de micropipeta y pule la punta hasta un diámetro interior de aproximadamente 10-20 μm.
  3. Crea una pequeña ventana (aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm) en el extremo puntiagudo del huevo para permitir el acceso a la microinyección minimizando la perturbación en el embrión.
    NOTA: Esteriliza la superficie de la cáscara del huevo con etanol al 70% antes de abrir la ventana para evitar la contaminación.
  4. Inyectar 2 μL de una suspensión que contenga más de 3.000 PGCs en 1× PBS o HBSS en la aorta dorsal bajo un estereomicroscopio.
    NOTA: Realice la inyección bajo un estereomicroscopio para evitar dañar el embrión o los vasos sanguíneos, y manipule cuidadosamente la aguja de microinyección para evitar lesiones.
  5. Sellar la ventana del huevo con película de parafina; coloca el huevo apuntando hacia abajo e incuba hasta la eclosión a 37,5 °C, 60-70% de humedad, balanceándote a 45° cada hora.
    NOTA: Mantener la temperatura y humedad adecuadas para asegurar la viabilidad y el desarrollo exitoso del embrión.

5. Validación de quimeras germinales

  1. Recoge el testículo u ovario del polluelo G0 tras la eclosión.
  2. Extraer ADN genómico de los tejidos gonidales recogidos para confirmar la formación de quimeras germinales. Realizar la extracción genómica de ADN de los tejidos gonadales recogidos de la siguiente manera:
    1. Recoger testículo o tejido ovárico, homogeneizarlo en 300 μl de tampón de lisis (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS) que contenga 1,5 μL de proteinasa K, e incubar a 60 °C para la h, asegurando la lisis completa.
    2. Añade 100 μL de solución de precipitación proteica (acetato de amonio de 7 M), mezcla bien y centrifuga a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
    3. Transfiere el sobrenadante (fase acuosa) a un nuevo tubo, añade 500 μL de isopropanol para precipitar ADN y centrifuga a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
    4. Descarta el sobrenadante, añade 1 mL de etanol al 70% y centrifuga a 12.000 × g durante 10 minutos a 4 °C.
    5. Retira el etanol y seca al aire la pelota de ADN a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    6. Eluir el ADN con 50 μL de agua libre de RNasa y medir la concentración y pureza del ADN usando un espectrofotómetro (A260/A280 ≈ 1,8).
    7. Ajusta el ADN a 10-5 ng por reacción PCR.
  3. Realizar amplificación por PCR usando cebadores específicos de cada especie diseñados (Tabla 1) bajo las siguientes condiciones: 94 °C durante 3 minutos seguidos de 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 68 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, más una extensión final a 72 °C durante 5 minutos (Figura 4A).
  4. Recoger semen de machos G0 sexualmente maduros, extraer ADN espermatozoide usando el mismo protocolo y realizar PCR usando cebadores específicos de cada especie (Figura 4B).

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Resultados

Proliferación in vitro y caracterización de los PGC de pollo
Las células gonadales enteras que contienen PGC se aislaron de embriones en las etapas 26-28 de HH y se cultivaron bajo condiciones definidas de cultivo de PGC. Con el tiempo, las células estromales gonadales se adhirieron a la superficie del cultivo o sufrieron degradación, mientras que las PGC permanecieron en suspensión y comenzaron a proliferar activamente (Figura 2A). Tras aproxima...

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Discusión

El trasplante de células germinales primordiales (PGCs) cultivadas en embriones receptores proporciona un método fiable para producir quimeras germinales en pollos. Este protocolo aprovecha el potencial germinal intrínseco de los PGC y mejora la consistencia experimental en comparación con los sistemas tradicionales basados en blastodermos, que son propensos al mosaicismo y a la variabilidad del desarrollo. Una ventaja crítica de este método es la expansión selectiva in vitro de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) [RS-2024-00418297] y el Programa Cooperativo de Investigación para el Desarrollo Científico y Tecnológico Agrícola [RS-2025-02213489] de la Administración Coreana de Desarrollo Rural.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x PBS HycloneSH30256
2-MercaptoetanolGibco21985023
Solución antibiótica antimicotica (100X)Gibco15240062
Anticuerpo anti-DAZLAbcamab215718
Suero de pollo estérilRocklandD102-00-0500
Desoxirribonucleasa I del páncreas bovinoSigma aldrich9003-98-9
Micropipetas desechables Drummond Micropipets Drummond Scientific Company1-000-0500
Nucleósidos de EmbryoMax (100X)MerckES-008-D
FBS (Caracterización por Seurm Bovino Fetal, Origen en EE. UU., 500ml)HycloneSH30919
Suplemento GlutaMAXGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
Solución de aminoácidos no esenciales de MEMGibco11140050
Película de laboratorio Parafilm MAmcorPM996 
Kit de enlace de células fluorescentes rojas PKH26 para marcaje general de membranas celularesSigma aldrichPKH26GL-1KT
Anticuerpo purificado anti-ratón/humano CD15 (SSEA-1)Bioleyenda125602
Proteína recombinante humana FGF básica/FGF2/bFGF (146 aa) y nbsp;R& Sistemas D  233-FB
Sistemas Miniprep de ARN ReliaPrepPromegaZ6011
Piruvato de sodio (100 mM)Gibco11360070
Solución azul de tripánSigmaT8154-100ML
Tripsina-EDTA (0,5%), sin fenol rojoGibco y comercio;15400054

Referencias

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