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Artículo de método

Efectos terapéuticos del extracto de Acorus calamus L. en la lesión cutánea inducida por radiación en un modelo de rata

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DOI:

10.3791/69705

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9 de enero de 2026

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1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

En este artículo

Resumen

La lesión cutánea inducida por radiación es una complicación común y grave de la radioterapia en pacientes con cáncer. No existe un tratamiento clínico eficaz. Este protocolo evalúa el efecto terapéutico del extracto de Acorus calamus L. sobre la lesión cutánea inducida por radiación, con el objetivo de proporcionar nuevos candidatos a fármacos y estrategias terapéuticas para su prevención y tratamiento clínico.

Resumen

La lesión cutánea inducida por radiación es una complicación común y debilitante en la terapia contra el cáncer, que a menudo provoca retrasos en la cicatrización de la herida y un aumento del malestar en el paciente. Existen algunos medicamentos terapéuticos disponibles para la prevención o el tratamiento. La Medicina Tradicional China, específicamente Acorus calamus L., ha demostrado potencial para tratar diversos trastornos cutáneos, pero su eficacia en lesiones cutáneas inducidas por radiación sigue sin explorarse.

Este estudio utilizó un modelo de rata Sprague-Dawley expuesta a radiación de 45 Gy para inducir lesión cutánea. Las ratas fueron tratadas con extracto de Acorus calamus L. al 10%, 20% y 40% durante 45 días. Se evaluaron la cicatrización de heridas, inflamación, apoptosis y angiogénesis utilizando tasas de cicatrización, análisis histopatológico, mediciones de citocinas, tinción TUNEL e inmunohistoquímica. El tratamiento con Acorus calamus L. aceleró la cicatrización de la herida, siendo el grupo de dosis media el que mostró la tasa de cicatrización más alta (88,97% a los 45 días). El análisis histopatológico reveló reducción de inflamación, mejora de la organización del colágeno y formación de nuevos vasos sanguíneos. Los niveles séricos de citocinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) se redujeron significativamente y la apoptosis disminuyó, con modulación de proteínas apoptóticas clave (P53, Bax, Bcl-2). La expresión de VEGF y bFGF se reguló al alza, promoviendo la angiogénesis y la reparación tisular. Acorus calamus L. mejora la curación de lesiones cutáneas inducidas por radiación al reducir la inflamación, inhibir la apoptosis y promover la angiogénesis. Estos hallazgos sugieren su potencial como agente terapéutico para el manejo del daño cutáneo inducido por radiación, proporcionando una alternativa prometedora para el manejo de lesiones cutáneas inducidas por radiación en oncología clínica. Se necesitan más estudios para aclarar sus mecanismos moleculares.

Introducción

La lesión cutánea inducida por radiación es una complicación frecuente y difícil tanto de accidentes nucleares como de radioterapiatumoral 1. En radioterapia, alrededor del 95 % de los pacientes desarrollan algún grado de daño cutáneo, incluyendo eritema, descamación, úlceras necróticas recurrentes, dolor persistente y un mayor riesgo de progresiónmaligna 2. Estas lesiones suelen ser refractarias al tratamiento, reduciendo sustancialmente la calidad de vida de los pacientes y a veces requiriendo la interrupción de la radioterapia, lo que supone un gran desafío clínico en la oncologíaradioterápica 3. Los mecanismos subyacentes del daño cutáneo inducido por radiación son complejos, implicando principalmente la producción de radicales libres en los tejidos cutáneos, lo que interrumpe los procesos celulares y agrava el proceso decuración 4,5. Esto resulta en la prolongada expresión de genes relacionados con la apoptosis, respuestas inflamatorias desreguladas y vías de señalización alteradas, todo lo cual contribuye a la naturaleza persistente de las heridas inducidas porradiación 6.

Actualmente no existe una terapia universalmente aceptada como estándar de oro para las lesiones cutáneas inducidas por radiación. El manejo clínico enfatiza enfoques antiinflamatorioso antioxidantes 7, especialmente corticosteroides tópicos, que reducen las reacciones cutáneas mediante efectos antiinflamatorios, inmunosupresores y vasoconstrictores, pero pueden causar adelgazamiento cutáneo con un usoprolongado 8. La amifostina, un agente radioprotector aprobado por la FDA, tiene un uso clínico limitado debido a efectos adversossignificativos 9. Los factores de crecimiento aceleran la cicatrización de la herida promoviendo la proliferación celular, la angiogénesis y la formación de tejido de granulación, pero sus acciones son muy específicas, ofrecen un control limitado sobre la lesión y la inflamación del tejido profundo, y conllevan un riesgo de hiperplasiaexcesiva 7. En consecuencia, la Medicina Tradicional China (MTC) ha llamado la atención por su filosofía holística, múltiples componentes activos con diversos efectos terapéuticos y un perfil de seguridad favorable. Estudios previos han demostrado que productos naturales, como el extracto de regaliz, los polisacáridos de aloe y la curcumina, alivian la inflamación inducida por radiación y el daño tisular al eliminar radicales libres, inhibir mediadores proinflamatorios (TNF-α, IL-6) y promover la proliferación defibroblastos 10,11,12. Sin embargo, la mayoría de estas investigaciones examinan compuestos activos individuales o objetivos individuales, proporcionando una visión insuficiente sobre los mecanismos de acción sinérgica multicomponente. Acorus calamus L., una planta conocida por sus propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, antibacterianas y cicatrizadoras de heridas, ha demostrado potencial en diversos trastornos cutáneos.

Acorus calamus L., una hierba perenne de la familia Araneae, contiene varios compuestos bioactivos, incluyendo terpenos, fenilpropanoides, flavonoides, esteroides y alcaloides. Su composición multicomponente permite la acción simultánea sobre múltiples objetivos, produciendo efectos farmacológicossinérgicos 13. Los estudios muestran que inhibe las vías de señalización inflamatoria como NF-κB y MAPK y que reduce la expresión de ARNm de factores proinflamatorios, como TNF-α e IL-6, mientras incrementa las actividades de enzimas antioxidantes como SOD y GSH-Px, ejerciendo así efectos antiinflamatorios, antioxidantes yantibacterianos 14,15. A pesar de sus beneficios documentados en el tratamiento de afecciones cutáneas causadas por infecciones y alergias, el papel de Acorus calamus L. en las lesiones cutáneas inducidas por radiación sigue sin explorarse. Estudios recientes han demostrado sus efectos protectores frente al daño inducido por radiación, promoviendo la cicatrización de heridas y reduciendo lainflamación 13. Sin embargo, los mecanismos terapéuticos específicos de Acorus calamus L. en lesiones cutáneas inducidas por radiación no se han esclarecido completamente.

El objetivo general de este estudio es evaluar los efectos terapéuticos del extracto de Acorus calamus L. en modelos animales de lesión cutánea inducida por radiación. Evaluamos la cicatrización de heridas, las respuestas inflamatorias y el comportamiento celular para dilucidar los mecanismos de acción del extracto desde múltiples perspectivas. Los hallazgos pretenden establecer una base teórica para el uso de Acorus calamus L. en el manejo clínico de lesiones cutáneas derivadas de la radioterapia contra el cáncer. Además, el estudio presentará las características funcionales del extracto, los escenarios de intervención adecuados y los datos básicos de eficacia para ayudar a los lectores a juzgar si este enfoque basado en productos naturales complementa sus necesidades de investigación o clínicas. En última instancia, este trabajo busca opciones terapéuticas eficaces para mejorar la calidad de vida de los pacientes que reciben radioterapia tumoral.

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Protocolo

Los experimentos con animales descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación Médica Animal del Hospital General del Comando del Teatro Norte (Número de Aprobación Ética: 2018-03). Se utilizaron ratas macho SD de grado SPF (6-8 semanas, peso 190-220 g) para el estudio. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Alojar a los animales experimentales

  1. Selecciona 108 ratas SD macho con SPF, de edad entre 6 y 8 semanas y peso entre 190 y 220 g.
  2. Mantener la temperatura ambiente del animal en 22 ± 2 °C, humedad relativa en 50 ± 5 % y un ciclo de luz a oscuridad de 12 horas. Permite que las ratas tengan acceso sin restricciones a comida y agua. Tras un periodo de aclimatación de una semana, procede a los experimentos de seguimiento.

2. Agrupación de animales

  1. Asignar aleatoriamente a las ratas en cinco grupos distintos: grupo normal (Normal, n = 18), grupo modelo (Modelo, n = 18), grupos positivos de fármacos (positivo, n = 18, crema de betametasona)16, grupo experimental de dosis bajas (Experimental-L, n = 18), grupo experimental de dosis medias (Experimental-M, n = 18) y grupo experimental de dosis altas (Experimental-H, n = 18). Excepto el grupo normal, todos los grupos estuvieron expuestos a la radiación.

3. Establecer un modelo animal de lesión cutánea radiactiva

  1. Administrar anestesia con precisión y con molestias mínimas mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución pentobarbital sódica al 1% (40 mg/kg). Confirma la profundidad de la anestesia observando la ausencia del reflejo corneal y la ausencia de respuesta al pellizco en los dedos del pie. Aplica pomada en los ojos de las ratas para evitar la sequedad.
  2. Quita el pelo trasero de las ratas con una máquina de afeitar eléctrica. Luego desinfecta la zona trasera con yodo y alcohol al 75%.
  3. Pon a cada rata en posición prona. Fije el irradiador de 32P-β (tasa de dosis superficial: 0,9 Gy/min) sobre la región espinal bilateral (2 cm × 2 cm de área) centrado 1 cm lateralmente a la línea media, asegurando que la fuente toque la epidermis sin espacio. Asegura el aplicador con cinta médica estéril para evitar desplazamientos durante la irradiación. Irradia la zona cutánea objetivo durante 50 minutos para lograr una dosis total absorbida de 45 Gy17.
  4. Una vez que la rata recupera la conciencia tras la irradiación, devólvela a su jaula individual, asegurando el acceso a agua y comida de forma espontánea, manteniendo la temperatura en 22 ± 2 °C, la humedad relativa en 50 ± 5 °C y un ciclo de 12 horas de luz a oscuridad.
    NOTA: El proceso experimental debe adherirse estrictamente a los principios establecidos de protección biológica y radiactiva ocupacional. Además, todos los procedimientos operativos deben seguir directrices para la eliminación adecuada y conforme de los residuos médicos y radiactivos para garantizar la seguridad y salud de todo el personal implicado.

4. Preparación del extracto de Acorus calamus L. y administración de medicamentos

  1. Pesa los rizomas de Acorus calamus L., asegura una limpieza a fondo, deja que se seque al aire y muele hasta obtener un polvo grueso (malla 40). Incorpora entre 10 y 20 volúmenes de etanol al 50% y homogeneiza a temperatura ambiente durante 24 horas
  2. Tras dejar que el extracto se asiente durante 30 minutos, decantar el sobrenadante y realizar una filtración preliminar a través de 4-8 capas de gasa para eliminar impurezas gruesas. Posteriormente, filtra con papel de filtro y evapora el filtrado a presión reducida en un evaporador rotatorio a 50-60 °C para recuperar el disolvente, resultando en un residuo sólido libre de disolvente (AE, con contenido de humedad < 5%).
  3. Preparación de pomada antiefusiva18
    NOTA: Formular pomadas de extracto de Acorus calamus L. del 10% (Experimental-L, c/p), 20% (Experimental-M, c/p) y 40% (Experimental-H, c/p) de acuerdo con la Edición 2020 de la Farmacopea China (Capítulo General 0109)19.
    1. Pesa con precisión el AE (por ejemplo, 20 g para ungüento al 20%) y el correspondiente petrolato de grado farmacéutico (por ejemplo, 80 g para ungüento al 20%).
    2. Añade el 10% del petrolato total al AE, tritura vigorosamente durante 5 minutos para formar una pasta homogénea (método de dilución geométrica, asegurando que el AE se disperse uniformemente en la base lipofílica).
    3. Funde el petrolato restante a 60 °C, enfría hasta 55 °C y añade lentamente a la pasta de AE-petrolato.
    4. Remueve magnéticamente a 250 rpm durante 30 minutos a 55 °C, luego remueve continuamente mientras se enfría hasta temperatura ambiente para obtener un ungüento suave y sin partículas.
    5. Preparación de control en blanco: fundir petrolato a 60 °C, remover a 250 rpm durante 30 minutos y enfriar a temperatura ambiente (idéntica a la base de la pomada AE).
    6. Guarda todas las pomadas y el petrolato en blanco a 4 °C en recipientes estériles sellados.
  4. A todos los grupos se les administraron tópicamente dos veces al día, a las 09:00 y 17:00, durante 45 días consecutivos tras la irradiación (el grupo normal, no irradiado, recibió el mismo horario de administración de forma sincrónica). La dosis aplicada fue de 0,2 g/cm², distribuida uniformemente en un área de piel dorsal de 2 cm × 2 cm. El grupo normal recibió vehículo (petrolato), y el grupo de modelos recibió vehículo (petrolato). El grupo control positivo recibió crema de betametasona. Los grupos experimentales L, M y H recibieron cremas con AE al 10%, 20% y 40% (peso y año), respectivamente. Tras cada aplicación, la zona tratada se masajeaba suavemente durante 10 segundos para mejorar la absorción, y las ratas eran sujetadas durante 5 minutos para evitar que las lameran.

5. Recogida de tejido y sangre de piel de rata

  1. Anestesiar a las ratas con una solución de pentobarbital sódico al 1% (40 mg/kg, i.p.). Desinfecta los instrumentos quirúrgicos y elimina la piel a lo largo de la zona de la herida.
  2. Fijar una porción del tejido en un 4% de paraformaldehído (10 mL), otra porción en glutaraldehído/tetróxido de osmio (5 mL, 2,5%) y conservar el resto en nitrógeno líquido para su análisis posterior (véase la Tabla de Materiales).
  3. Recoge muestras de sangre de la aorta abdominal de la rata. Centrifugar a 3.000 × g a 4 °C durante 15 minutos; aspirar el sobrenadante en tubos EP; alicuota y guarda a -80 °C.

6. Evaluación de la curación

  1. Observa la herida en los días 7, 15, 30 y 45 después de la irradiación y toma imágenes de la superficie de la herida con una cámara de alta definición. Importa las imágenes en ImageJ y dibuja el área de la herida a lo largo del borde de la herida. Calcula el área en la imagen. Asegúrate de que cada operación sea consistente para evitar errores de medición. Calcula el tiempo y la velocidad de cicatrización de la herida.
    NOTA: Tasa de cicatrización de heridas (%) = (Área irradiada inicial - Área de herida no cicatrizada) / Área irradiada inicial. Criterios para la cicatrización de heridas: La cicatrización completa se define como zona con costra < el 5% del área de la herida o zona cicatrizada > 95% del área de la herida. Área irradiada inicial: el área de la herida medida en el momento en que los animales irradiados presentaban una herida estable (una línea base).

7. Examen de microscopía electrónica

  1. Muestreo rápido y fijación de tejidos
    1. Emplea una hoja afilada para extirpar un bloque de tejido cutáneo de 1 mm³, que abarca la capa epidermis-dermis.
    2. Sumergir inmediatamente la muestra en un tampón de fosfato de glutaraldehído al 2,5% preenfriado (0,1 M, pH 7,4) a 4 °C durante 24 horas para fijación.
  2. Lavado de tampones
    1. Realizar tres lavados con 0,1 M de tampón fosfato (pH 7,4), dejando 15 minutos por cada lavado.
  3. Post-fijación
    1. Transicione la muestra a una solución de tetróxido de osmio al 1% a 4 °C para una fijación que dure 1,5 horas.
  4. Deshidratación por gradiente
    1. Avanzar progresivamente por concentraciones de acetona del 50%, 70%, 80%, 90% y 100%, asignando 15 minutos a cada paso.
    2. Repite el tratamiento con acetona al 100% tres veces, con una duración de 10 minutos en cada inmersión.
  5. Incrustación de resina epoxi
    1. Remojar la muestra en una mezcla 2:1 de acetona y resina epoxi durante 2 horas, seguida de una inmersión nocturna en resina epoxi pura.
    2. Polimerizar la muestra a 60 °C durante 48 horas para formar un bloque sólido.
  6. Seccionado y teñido
    1. Produce secciones ultrafinas de 70 nm usando un ultramicrotomo.
    2. Tiñe con acetato de uranio durante 15 minutos, luego con citrato de plomo durante 5 minutos a 60 °C.

8. Tinción de hematoxilina-eosina (HE)

  1. Realizar incrustación de parafina
    1. Extirpa muestras de piel, deshidrata usando un gradiente de alcohol (por ejemplo, 70%, 80% y 95% etanol, cada una durante 15 minutos, seguida de dos cambios de etanol al 100%, cada una durante 15 minutos), y posteriormente transfiere al xileno hasta que el tejido alcanza un estado translúcido.
    2. Sumergirse en parafina para asegurar la incrustación y luego permitir la solidificación.
  2. Realiza el decerado y la rehidratación
    1. Sumerge secciones de parafina en xileno I/II durante 10 minutos cada una.
    2. Enjuaga xileno con etanol al 100%, luego sumerge en etanol al 95% durante 3 minutos, etanol al 80% durante 3 minutos, 70% etanol durante 3 minutos y finalmente enjuaga con agua destilada.
  3. Realizar la tinción nuclear de hematoxilina
    1. Remojas en la solución de hematoxilina de Harris durante 7 minutos a temperatura ambiente.
    2. Enjuaga bajo agua corriente durante 10 minutos hasta que aparezca la coloración azul.
  4. Diferenciación de implementos y contratinción
    1. Diferenciar usando ácido clorhídrico al 1% en etanol durante 3 segundos (observa la claridad nuclear bajo el microscopio).
    2. Contra-tinte con una solución de amoníaco al 0,5% durante 30 segundos.
  5. Realizar contratinción de eosina
    1. Tinte con una solución de eosina al 0,5% (que contiene 1% de ácido acético glacial) durante 90 s.
    2. Enjuaga rápidamente con agua destilada durante 5 segundos para eliminar el exceso de mancha.
  6. Ejecutar deshidratación y limpieza
    1. Pasan secuencialmente por 70%, 80%, 95%, 100% etanol I/II (1 min cada uno).
    2. Limpia con xileno I/II durante 2 minutos cada uno.
  7. Aplicar sellado y observación
    1. Aplica resina neutra en caída y luego cubre con una capa de cobertura.
    2. Seca en un horno a 60 °C durante 30 minutos antes del examen microscópico.

9. Tinción tricroma de Masson

  1. Realiza un descerado rutinario similar a la tinción previa a la hecología.
  2. Tinción nuclear
    1. Deja en remojo en solución de hematoxilina durante 10 minutos.
    2. Enjuaga bajo agua corriente durante 5 minutos hasta que recupere el tono azulado.
  3. Tinción de fibras de colágeno
    1. Sumerge en una mezcla de Alizarina Roja y Fucisina Ácida durante 5 minutos.
  4. Diferenciación de ácidos fosfomilíbdicos
    1. Transfiere a una solución acuosa de ácido fosfomolilíbdico al 1% durante 1 minuto.
  5. Contratinción de miofibras
    1. Transfiere directamente a una solución azul anilina al 2,5% durante 5 minutos.
    2. Enjuaga rápidamente con una solución acuosa de ácido acético glacial al 0,5% durante 5 segundos.
  6. Deshidratación y montaje
    1. Ejecutar deshidratación por gradiente de etanol: 95% etanol I, 100% etanol II (30 s cada uno).
    2. Limpia con xileno.
    3. Montar con resina neutra, secar a 60 °C y examinar posteriormente al microscopio.

10. Detección ELISA de los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α

NOTA: IL-1β, IL-6 y TNF-α son citocinas proinflamatorias importantes que se utilizan comúnmente para evaluar tanto la presencia como la intensidad de la inflamación. Monitorizar sus niveles es fundamental para obtener información sobre los procesos inflamatorios y determinar la eficacia de los tratamientos antiinflamatorios.

  1. Prepara muestras de suero
    1. Sigue el protocolo detallado en el Paso 5.3 para recoger muestras de suero.
  2. Estándares y muestras diluidas
    1. Crear una dilución de gradiente de estándares utilizando el diluyente de la muestra; Diluir muestras de suero en una proporción de 1:4.
  3. Añadir muestras e incubar
    1. Introducir 100 μL del estándar/muestra en cada pozo; cubrir los pozos con una membrana; incubar a 37 °C durante 90 minutos; Luego desecha el líquido y seca los pozos.
  4. Detectar reacción anticuerpo-enzima
    1. Dispensar 100 μL de reactivo marcado con enzimas específico para IL-1β, IL-6 y TNF-α en cada pozo; incubar a 37 °C durante 60 minutos; Retira el líquido y seca con secador; lava la placa cuatro veces con 200 μL de tampón de lavado.
    2. Añadir 100 μL de solución de trabajo estreptavidina-HRP (dilución 1:100) a cada pozo; incubar a 37 °C en la oscuridad durante 30 minutos; lava la placa cuatro veces con 200 μL de tampón de lavado.
  5. Desarrollar color y terminar
    1. Introducir 100 μL de solución de sustrato TMB en cada pozo; incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos; posteriormente se añaden 50 μL de solución de parada a cada pozo.
  6. Datos de lectura
    1. Mide la absorbancia a 450 nm (con una longitud de onda de calibración de 630 nm) usando un lector de inmunoenzimas en un plazo de 30 minutos; calcular la concentración (pg/mL) utilizando la curva estándar.

11. Ensayo TUNEL

  1. Pretratamiento de secciones
    1. El dewax y las secciones de parafina deshidratan hasta que llegan al agua destilada.
    2. Introduce una solución de trabajo de proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL e incuba a 37 °C durante 20 minutos.
    3. Lava las secciones tres veces con PBS, cada lavado durando 2 minutos.
  2. Reacción de etiquetado
    1. Aplica la mezcla de reacción TUNEL que contiene la enzima TdT y dUTP marcada con fluoresceína.
    2. Incuba en una cámara humidificada a 37 °C en la oscuridad durante 60 minutos.
  3. Conversión de señales
    1. Lava tres veces con PBS, dejando 5 minutos para cada lavado.
    2. Introduce un anticuerpo antifluoresceína marcado con HRP en una dilución de 1:500.
    3. Incuba a 37 °C durante 30 minutos.
  4. Desarrollo cromogénico DAB
    1. Después del lavado con PBS, aplica solución cromogénica DAB y monitoriza el desarrollo bajo un microscopio durante 1 a 3 minutos.
    2. Detén la reacción usando agua destilada.
  5. Contratinción y montaje
    1. Contratinción de los núcleos con hematoxilina durante 1 minuto.
    2. Deshidrata usando etanol graduado, transparente con xileno y monta con resina neutra.
  6. Interpretación del resultado
    1. Identifica los núcleos apoptóticos como marrón-amarillentos, mientras que los núcleos normales aparecen azules.
    2. Selecciona aleatoriamente cinco campos de alta potencia (400×) por diapositiva para calcular la tasa de apoptosis.

12. Tinción inmunohistoquímica

  1. Descerado y extracción de antígenos
    1. Deja en remojo las secciones de parafina en Xylene I durante 10 minutos, luego transfiere a Xylene II durante otros 10 minutos. Posteriormente, deshidrata usando una serie de etanol gradiente, comenzando con 5 minutos en etanol I 100%, seguido de 5 minutos en etanol II 100%, 3 minutos en etanol 95%, 80% y 70% cada uno, y finalmente enjuaga con agua destilada durante 2 minutos.
    2. Realizar reparaciones térmicas a alta presión con 0,01 M de tampón de citrato de sodio a pH 6,0, manteniendo una temperatura de 121 °C durante 3 minutos.
  2. Bloquear interferencia endógena
    1. Introduceuna solución al 3% deH2O2 a temperatura ambiente durante 10 minutos para inactivar enzimas endógenas.
    2. Aplicar una solución bloqueadora de BSA al 5% sobre el tejido e incubar en una cámara humidificada a 37 °C durante 45 minutos; aspira cualquier exceso de solución bloqueante sin enjuagar.
  3. Incubación de anticuerpos
    1. Dispensa una solución bloqueadora de BSA al 5% e incuba a 37 °C durante 30 minutos.
    2. Añadir la solución principal de acción de anticuerpos a la concentración optimizada (por ejemplo, P53, Bax, Bcl-2, VEGF y bFGF) e incubar durante la noche en una cámara humidificada a 4 °C; lavar tres veces con tampón PBS-T que contenga 0,1% Tween-20 durante 5 minutos cada uno.
    3. Introducir un anticuerpo secundario marcado con HRP diluido 1:200; incubar en una cámara humidificada a 37 °C durante 60 minutos; Lava tres veces con PBS-T buffer durante 5 minutos cada una. Luego, añade la solución conjugada ABC e incuba a 37 °C durante 30 minutos, seguido de tres lavados con tampón PBS durante 5 minutos cada uno.
  4. Revelado de color DAB
    1. Añade una solución reveladora DAB que contenga 0,02% de H₂O₂ y monitoriza el desarrollo bajo un microscopio a temperatura ambiente durante 1-4 minutos.
    2. Termina inmediatamente la reacción con agua destilada.
  5. Contratinción y montaje
    1. Sumerge la muestra en la solución de hematoxilina de Harris durante 1 minuto y enjuágala bajo agua corriente durante 10 minutos para conseguir la recuperación del azul.
    2. Sumerge secuencialmente en las siguientes soluciones: 70% etanol durante 30 segundos, 80% etanol durante 30 segundos, 95% etanol durante 30 segundos, 100% etanol I durante 1 minuto y 100% etanol II durante 1 minuto.
    3. Para una limpieza y fijación completas, sumerge en xileno I durante 2 minutos y luego transfiere al xileno II durante 2 minutos. Añade resina neutra para montar en modo medio en caída, cubre con un cubrecubo y seca en un horno a 60 °C durante 30 minutos.
  6. Cuantificación de resultados
    1. Un color marrón indica una reacción positiva; las señales positivas (marrón-amarillas) deben contrastarse con el fondo negativo.
    2. Utiliza el software Image-Pro Plus para calcular el porcentaje de celdas positivas en al menos 5 campos de visión.

13. Detección de manchas occidentales

  1. Preparación para la lisis tisular
    1. Introduce tejido cutáneo líquido congelado con nitrógeno en un mortero de acero inoxidable preenfriado a -80 °C; añadir nitrógeno líquido gradualmente en tres incrementos para mitigar la vaporización; moler de forma vertical hasta que ya no se vean todas las partículas; transfiere el polvo resultante a un tubo EP que contiene un tampón de lisis.
    2. Incorporar inhibidor de proteasas (1:100) e inhibidor de fosfatasas (1:50); vórtice sobre hielo durante 30 s; realizar la interrupción ultrasónica; incubar a 4 °C en una incubadora agitada durante 2 horas; centrifugar a 4 °C, 14.000 × g durante 20 minutos; Aspira cuidadosamente el sobrenadante.
  2. Cuantificación y procesamiento de proteínas
    1. Dispensar 5 μL del sobrenadante en una placa de 96 pozos; añadir 200 μL de solución de trabajo BCA; incubar a 37 °C en la oscuridad durante 30 minutos; medir la absorbancia a 562 nm usando un lector de microplacas; determinar la concentración según la curva estándar.
    2. Combinar el tampón de carga proteica reducida de 5× con la solución proteica en una proporción de 4:1; desnaturalizar colocando en un baño de maria hirviendo durante 15 minutos; Guárdalos a -20 °C para uso futuro.
  3. Electroforesis SDS-PAGE
    1. Prepara un gel resolvedor de acrilamida al 12%; Vierte el gel hasta que alcance 1 cm por debajo de los dientes del peine; cubre con isopropanol para evitar la exposición al aire; tras la solidificación, se retira el isopropanol; Vierte un gel concentrador al 4%; insertar un peine de 15 pozos; permitir la solidificación a temperatura ambiente durante 30 minutos; añadir 5 μL de marcador proteico pre-teñido al pozo de carga 1; añadir 20 μL de lisato en blanco al pozo 2; añadir 10 μL de muestra que contenga 40 μg de proteína a cada pozo de 3 a 14.
    2. Iniciar la electroforesis a 80 V; cambiar a 120 V cuando el azul de bromofenol migra al gel separador; mantener una temperatura de 10-15 °C con circulación de agua helada; Corre hasta que el azul de bromofenol alcance 0,5 cm desde el fondo del gel.
  4. Procedimiento de absorbente húmedo
    1. Preparar un tampón de transferencia que contenga un 20% de metanol; pre-enfriado a 4 °C. Activa la membrana PVDF sumergiéndola en metanol durante 1 minuto; equilibrar la membrana NC en el tampón. Montar la abrazadera de transferencia en este orden: "Placa de cátodo - Almohadilla esponja - Papel filtro - Gel - Membrana - Papel filtro - Almohadilla esponja - Placa de ánodo"; eliminar completamente cualquier burbuja con un rodillo; establecer parámetros según el peso molecular de la proteína objetivo: para proteínas < 50 kDa, usar una transferencia de voltaje constante a 100 V durante 60 minutos; para proteínas de 50-100 kDa, aplicar una transferencia de corriente constante a 250 mA durante 90 minutos; para proteínas > 100 kDa, se implementa una transferencia de corriente constante a 300 mA durante 120 minutos; se conecta a un baño maría circulante de 4 °C.
  5. Procedimiento de inmunodetección
    1. Tras la transferencia, sumergir la membrana PVDF en metanol durante 1 minuto; lavar tres veces con TBST durante 5 minutos cada una; cubrir la superficie de la membrana con un 3% de H₂O₂/TBST; incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 minutos; aspirar el líquido; añadir una solución bloqueadora de BSA/TBST al 5%; bloquear durante 1 hora en una incubadora agitadora a 37 °C; Lava la membrana tres veces con TBST durante 5 minutos cada una.
    2. Añadir la solución principal de acción de anticuerpos (como P53, Bax, Bcl-2, VEGF y bFGF); incubar durante la noche a 4 °C en una incubadora agitada; lava la membrana cuatro veces con TBST durante 10 minutos cada una; añadir anticuerpos secundarios marcados con HRP; incubar en una incubadora agitada a temperatura ambiente durante 90 minutos; lava la membrana seis veces con TBST + SDS 0,5% durante 8 minutos cada una.
  6. Imagen quimioluminiscencia
    1. Mezclar volúmenes iguales de soluciones ECL A y B; recubre uniformemente la superficie de la membrana; permitir que la reacción ocurra en la oscuridad durante 60 segundos; aspirar cualquier exceso de líquido; establecer un tiempo de exposición individual entre 1 y 5 s para proteínas señales fuertes; realizar exposición acumulada en cinco segmentos (10/30/60/120/300 s) para proteínas señal débiles; Captura imágenes usando un generador de quimiluminiscencia.
  7. Flujo de trabajo de análisis de datos
    1. Cuantificar proteínas utilizando el software ImageJ; establecer un umbral uniforme de resta de fondo; calcular la proporción en escala de grises de la proteína objetivo respecto a la proteína de referencia (β-actina o GAPDH)
    2. Importa los datos en GraphPad Prism para su análisis.

14. Análisis estadístico

  1. Presentar los datos mediante la media ± error estándar de la media. Emplear muestras independientes de pruebas t para comparaciones entre dos grupos y utilizar ANOVA unidireccional para comparaciones entre varios grupos.
  2. Analizar datos usando SPSS 26.0 y GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Consideremos P < 0,05 como indicativo de diferencias estadísticamente significativas.

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Resultados

Efecto terapéutico de Acorus calamus L. en la lesión cutánea inducida por radiación
15 días después de la irradiación, todos los grupos de ratas presentaron pelación seca, enrojecimiento localizado, hinchazón, ulceración y costras. A los 30 días tras la irradiación, el grupo modelo mostró el daño cutáneo más grave, con costras y úlceras en el lugar irradiado que alcanzaron su punto máximo. A los 45 días, el grupo modelo mostró una mínima caída de costras, y la herida mostró cierta contracción. En cont...

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Discusión

La lesión cutánea inducida por radiación sigue siendo una de las complicaciones más comunes y desafiantes en la radioterapia clínica contra el cáncer. Como órgano más grande y primer objetivo de radiación, la piel es susceptible a daños causados por radicales libres y especies reactivas de oxígeno producidas por la radiación, lo que puede afectar las funciones celulares, incluyendo la división celular, migración y diferenciación, lo que finalmente conduce a un retraso en la cicatrización...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Plan Conjunto del Plan de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Liaoning (Proyecto de Abordaje Técnico) (2024JH2/102600273) y el Proyecto de Investigación Independiente del Hospital General del Teatro Norte (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de fijación con paraformaldehído al 4%Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaP0099
Extracto de Acorus calamus L.Preparado internamenteN/A   El protocolo detallado de preparación se describe en la Sección 4 del Protocolo.
Anticuerpo antibax y nbsp;  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB11690
Anticuerpo anti-Bcl-2Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB113375
Anticuerpo anti-bFGFProteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, China)11234-1-AP
Anticuerpo anti-P53 y nbsp;Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111740
Anticuerpos anti-VEGF  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB111971
Kit de ensayos de proteínas BCA  Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)G2026-200T
Crema de betametasona  United Pharmaceutical Co., Ltd. (China)N/A Concentración: 0,1% c/w
Aprobación Nacional de Medicamentos Nº: H19994057
EtanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.E111991Se utiliza como disolvente de extracción para el extracto de Acorus calamus L.
Sistema de imagen en gel y blotBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EE. UU.)ChemiDoc MP
Kit de tinción de hematoxilina-eosinaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pekín, China) y nbsp;  G1120
HRP conjugado Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China)GB23303
Microscopio de fluorescencia invertidaOlympus Corporation (Tokio, Japón)IX83   
Masson' s Kit de tinte tricromoBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., (Pekín, China) y nbsp;  G1340
Lector de microplacas (para la absorción, fluorescencia y detección de luminiscencia)Dispositivos moleculares (San José, CA, EE. UU.)SpectraMax iD3
petrolatoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghái, China)N/A   Petrolato blanco de grado farmacéutico; Punto de fusión: 45-60 ºC; C;  Aprobación Nacional de Medicamentos Nº: H31022350
Rat IL-1 y beta; Kit ELISA    Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI303
Rat IL-6 ELISA Kit    Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPI328
Rat TNF-& alpha; Kit ELISA    Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaPT516
Kit de detección de apoptosis (DAB) de celda TUNELBeyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinaC1091

Referencias

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