Artículo de método

Desarrollo de un novedoso modelo de fijación interna para fracturas radiales de rata: evaluación de la cicatrización de fracturas y aislamiento de ganglios de la raíz dorsal

724 vistas

DOI:

10.3791/69707

13 de marzo de 2026

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El estudio combina de forma innovadora suturas y agujas de titanio para una fijación interna estable en un modelo de fractura radial en rata. La cicatrización de fracturas se evaluó mediante tomografía microcomputarizada (micro-CT), y se aislaron y cultivaron neuronas ganglionares de la raíz dorsal primaria (DRG) para su investigación posterior.

Resumen

El modelo de fractura radial en ratas es de gran importancia en la investigación ortopédica, especialmente para el estudio de los mecanismos de curación de fracturas, el cribado de fármacos y la evaluación de materiales biológicos. A pesar de ciertas limitaciones, su papel en la investigación científica sigue siendo insustituible. Dado que el radio de las ratas es relativamente delgado, las placas y tornillos de acero que se utilizan actualmente en la práctica clínica no son adecuados para el tratamiento de fracturas radiales en ratas. Para abordar esta limitación, este estudio emplea de forma innovadora la sutura y la fijación con aguja de titanio, un modelo interno de fijación para fracturas radiales que proporciona una fijación relativamente estable y establece un modelo animal robusto para investigar la fijación interna de dichas fracturas. Se realizaron imágenes in vivo utilizando un sistema de micro-TC de animales vivos para detectar la cicatrización de fracturas radiales en ratas Sprague-Dawley (SD). La extracción y aplicación del DRG de la rata son pasos importantes en la investigación en neurociencia, ampliamente utilizados en campos como la neurociencia, la patología y la biología celular. Este protocolo es adecuado para el cultivo primario de neuronas ganglionares de la raíz dorsal de ratas con fracturas radiales y puede utilizarse para estudiar los mecanismos de lesión nerviosa y reparación tras fracturas, como la apoptosis neuronal y la liberación de neurotransmisores.

Introducción

Las fracturas radiales están entre las más comunes en las clínicas, con una incidencia global considerable, y se sitúan como una de las principales causas de fracturas de hueso largo en lasextremidades 1,2,3. Los estudios poblacionales revelan una distribución bimodal por edades para fracturas radiales, que suele alcanzar su pico tanto en poblaciones pediátricas como en personasmayores. El tratamiento retrasado suele provocar disfunción rotacional en el antebrazo, que afecta gravemente las actividades de la vida diaria (AVD). Persisten controversias en el manejo de fracturas radiales, centradas principalmente en los sistemas de clasificación de fracturas y la selección de modalidadesde tratamiento 7,8. La evidencia clínica sugiere que la fijación interna de reducción abierta (ORIF) mejora significativamente el rango de movimiento (ROM) de la articulación del codo o la muñeca y la recuperaciónde fuerza 9; sin embargo, este enfoque se asocia con tasas más altas de infecciones postoperatorias y complicaciones internas relacionadas conla fijación 10,11.

El DRG actúa como un puente anatómico y funcional crítico para la transmisión de información sensorial entre el sistema nervioso periférico y central (SNC). Más allá de su función principal en la recogida y transmisión de señales sensoriales periféricas (por ejemplo, tacto, temperatura), la DRG regula activamente sensaciones anormales como el dolor, convirtiéndose en una estructura clave subyacente tanto a la función sensorial normal como al manejo clínico deldolor 12,13,14. Cambios patológicos como lesiones, inflamaciones o neurodegeneración en la DRG pueden desencadenar anomalías sensoriales (por ejemplo, entumecimiento, hormigueo) o dolor crónico, situándolo como un punto focal de investigación en neurociencia y medicina del dolor.

En este caso, se seleccionaron los ratas SD machos de 8 semanas de edad y un peso aproximado de 200 g para construir (1) un modelo interno de fijación para fracturas transversas radiales en ratas y una evaluación posterior a la cicatrización, y (2) el aislamiento y cultivo in vitro de DRGs de ratas con un modelo de fijación interna para fracturas radiales. Este protocolo está diseñado para facilitar la experimentación reproducible en estudios que exploran mecanismos de curación de fracturas, cambios sensoriales mediados por DRG y posibles objetivos terapéuticos para el dolor o disfunción postfractura.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Nankín (Nº 202508A046). Todas las ratas utilizadas en los siguientes ensayos se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Un esquema que representa el protocolo se muestra en la Figura 1.

1. Establecimiento de un modelo interno de fijación para fracturas radiales en ratas

NOTA: Las ratas se aclimataron a un entorno tranquilo con iluminación suave y difusa antes de la cirugía, protegiéndolas del ruido y la luz intensa. Durante el manipulación, el abdomen y el pecho de las ratas se apoyaban con una sujeción manual suave, evitando agarrar la cola, una práctica conocida por inducir dolor y malestar y por reducir las molestias asociadas a la lucha.

  1. Prepare los instrumentos quirúrgicos como se muestra en la Figura 2. Los instrumentos quirúrgicos incluyen una hoja de bisturí, un mango de bisturí, tijeras quirúrgicas, un portaagujas, pinzas hemostáticas y pinzas de tejido dentalizado. El macho de rata Sprague-Dawley (SD) tenía aproximadamente 8 semanas y pesaba unos 200 g.
  2. Anestesiar a la rata usando una máquina de anestesia con gas isoflurano. Para la inducción, utilice isoflurano al 4% y mantenga la anestesia ventilatoria (2% isoflurano) utilizando un cono nasal durante todo el procedimiento quirúrgico. Mantén la temperatura del quirófano aproximadamente en 28 °C.
    NOTA: Determina el éxito de la anestesia comprobando signos vitales (como la respiración y la frecuencia cardíaca), el reflejo corneal (la ausencia de respuesta indica anestesia efectiva), el reflejo de parpadeo (ausencia) y la respuesta a la contracción de los dedos (sin retracción tras la estimulación).
  3. Coloca a la rata en posición lateral, expone la extremidad anterior derecha y afeita el pelo con una máquina de cortar. Coloca una sábana estéril y envuelve un torniquete alrededor de la extremidad anterior proximal derecha para reducir el sangrado quirúrgico.
  4. Prepara la piel alternando alcohol y exfoliantes de betadine tres veces.
  5. Realizar una incisión longitudinal de 1,5 cm en el lado radial dorsal del antebrazo derecho, como se muestra en la Figura 3. Separa los espacios musculares y expone completamente el radio derecho de la extremidad anterior.
    NOTA: El radio queda expuesto separando de forma directa los músculos a lo largo del interespacio muscular. Solo los músculos dorsales del radio quedan expuestos sin despojar completamente los músculos circundantes.
  6. Utiliza tijeras de operación para cortar el radio y crear una fractura transversal. Las tijeras están orientadas en un ángulo de 90 grados respecto al radio (Figura 4).
  7. Toma una aguja de titanio de 0,8 mm de diámetro y 10 mm de largo e insértala en la fractura del radio a lo largo de su eje longitudinal (Figura 5). Fija el radio y la aguja de titanio con sutura (4-0 [1,5 métrica] trenzada de seda no absorbible), como se muestra en la Figura 6.
  8. Ata la sutura con tres nudos consecutivos y asegura la aguja de titanio al radio mediante cuatro suturas interrumpidas.
    NOTA: Los extremos proximal y distal de la fractura están fijos dos veces, respectivamente.
  9. Sutura (4-0 [1,5 métrica] trenzado de seda no absorbible) la piel, corta el exceso de sutura y cierra la herida. Desinfecta la piel con exfoliantes Betadina.
  10. Cubre la herida con gasas estérils y sujeciónala con vendas. Coloca a la rata en una jaula para que recupere la conciencia hasta que se recupere.
  11. Manejo del dolor postoperatorio:
    1. Si el animal muestra signos de dolor, no come y/o duda en caminar sobre las extremidades traseras, consulte con el personal veterinario y administre analgésicos adicionales.
      NOTA: El cefuroxima sódico se utiliza en el tratamiento de infecciones bacterianas. El clorhidrato de tramadol se utiliza para administrar analgésicos.

2. Micro TC

  1. Anestesiar a la rata usando una máquina de anestesia con gas isoflurano (dosis de inducción del 4%).
  2. Colocar a la rata en posición prona dentro de la cámara de escaneo, ajustar la posición de las extremidades y la cabeza para centrar el área de escaneo objetivo en el campo visual, y mantener ventilación y anestesia continuas (2% isoflurano) durante todo el procedimiento.
  3. Empuja la cama fija para animales dentro de la cámara de escaneo y cierra la puerta de la cámara.
  4. Establece los parámetros de micro-CT de la siguiente manera. Modo de escaneo: estándar; Tiempo de exposición: 2 min; campo de visión: 72 mm; Tamaño del vóxel: 144 μm; voltaje: 90 kV; corriente: 88 μA; filtro: 3D-suave.
    NOTA: Los datos de escaneo se transmiten automáticamente al software y se genera una imagen TC tridimensional.
  5. Separa los tejidos objetivo.
    1. Analizar el área de tejido óseo seleccionada a partir de las imágenes originales de micro-TC. Desliza la línea de la función de transferencia para separar el hueso del músculo, evitando incluir demasiado tejido muscular. Realizar la reconstrucción de alta resolución en el área segmentada del tejido óseo para generar un modelo 3D.
  6. Exporta las imágenes procesadas.
    1. Después de procesar las imágenes, localice y haz clic en el botón de final para finalizar el flujo de trabajo actual.
    2. Aparecerá una ventana emergente, primero selecciona la imagen fija para confirmar que quieres exportar una imagen estática (no una secuencia dinámica).
    3. Elige jpeg como formato de archivo de salida entre las opciones disponibles.
    4. Selecciona un tamaño grande para asegurar que la imagen exportada mantenga una alta resolución adecuada para análisis o documentación.
    5. Haz clic en Aceptar para completar el proceso de exportación.

3. Aislamiento y cultivo de DRG en ratas con fracturas radiales

NOTA: La eutanasia se administra con anestesia inhalada de isoflurano al 4%, seguida de una rápida dislocación cervical para eutanasiar a los animales. Los DRG se extraen 20 días después del establecimiento del modelo de fractura radial.

  1. Seccionar la columna vertebral, extraer los cuerpos vertebrales C1-C7. Corta la columna cervical a lo largo de las líneas medias anterior y posterior, y divídela en mitades izquierda y derecha. Si es necesario, cortar los procesos espinosos para facilitar la operación.
  2. Limpia suavemente el tejido de la médula espinal y las fibras nerviosas dentro de los forámenes intervertebrales. Enjuaga los forámenes intervertebrales con una jeringuilla llena de PBS para eliminar la sangre y exponer los recovecos laterales.
    NOTA: La DRG se encuentra dentro de los recovecos laterales, presentándose como un nódulo amarillo claro, con fibras nerviosas conectadas en ambos extremos.
  3. Utiliza pinzas de tejido dentado para recoger la DRG, levántala suavemente y luego usa tijeras de operación para cortar las fibras nerviosas en ambos extremos.
  4. Transfiere los DRG extraídos a un tubo centrífugo de 1,5 mL con medio de extracción; Coloca sobre hielo.
    NOTA: Prepara el medio de extracción añadiendo suero bovino fetal al 2% (FBS) al medio esencial mínimo α (α-MEM). Los DRG se incuban en el medio de extracción durante unos 30 minutos antes de pasar al siguiente paso.
  5. Aspira lentamente y desecha el medio de extracción. Añade 1 mL de la solución enzimática digestiva mixta que funciona. Digiéramos en un baño maria a 37 °C durante 60-70 minutos.
    NOTA: Para preparar la solución de trabajo enzimática digestiva mixta, disuelva 100 mg de colagénasa tipo I y 100 mg de dispasa en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Al usarla, dilúyela hasta obtener una solución funcional de 5 mg/mL y guárdala en hielo.
  6. Recubre una placa de Petri pipeteando un volumen adecuado de la solución de trabajo con fibronectina, y luego incuba a 37 °C durante 1 hora.
    NOTA: La solución de trabajo de fibronectina plasmática humana (solución de trabajo con fibronectina) se prepara diluyendo la solución de 1 mg/mL de fibronectina con ddH₂O a una solución activa de fibronectina de 0,02 mg/mL.
  7. Después de la digestión, aspira y descarta la solución enzimática digestiva mixta que actúa. Añade 1 mL de medio completo y pipete suavemente el papel DRG varias veces.
    NOTA: Para preparar un medio completo, mezcle 45 mL de medio MEM-α, 4,5 mL de FBS y 0,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina (PS), y esterilice mediante filtración a través de una membrana microporosa de grado esterilizante de 0,22 μm.
  8. Recoge filtrado y centrifuga a 75 × g durante 8,5 minutos a 25 °C.
  9. Tras la centrifugación, aspira y descarta el sobrenadante en el tubo de la centrifugadora, y añade 1 mL de medio completo para resuspender el precipitado.
  10. Saca la placa de Petri. Descarta la solución activa de fibronectina y lávate con PBS dos veces.
  11. Inocular las células en la placa de Petri recubierta, añadir 1 mL de medio completo e incubar en una incubadora a temperatura constante a 37 °C con 5% de CO₂ durante 8-12 horas.
  12. Después de 8-12 horas, sustituye el medio completo por el medio de reemplazo. Luego, reemplaza la mitad del volumen con el medio de repuesto cada 2-3 días.
    NOTA: Para preparar el medio de reemplazo, mezcle 44,5 mL de medio MEM-α, 4,5 mL de FBS, 0,5 mL de solución de penicilina-estreptomicina (PS) y 0,5 mL de desoxiuridina. Esterilizar mediante filtración a través de una membrana microporosa de grado esterilizante de 0,22 μm.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Las imágenes micro-TC confirmaron el establecimiento exitoso de modelos de ratas de fractura radial en la Figura 7 y el modelo de fijación interna para fracturas radiales en ratas en la Figura 8. Las imágenes micro-TC se compararon entre la toma el día de la construcción del modelo de fijación interna de la fractura y veinte días después del establecimiento del modelo. Veinte días después de la modelización, el análisis micro-CT...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La fractura radial es una de las fracturas de hueso largo más comunes en la práctica clínica. Su proceso de curación implica complejas interacciones entre la reparación del tejido óseo y la regulación neural (como la regulación de osteoblastos/osteoclastos por neuropéptidos y factores neurotróficos liberados por el ganglio de la raíz dorsal)15,16,17,18. Las rat...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen posibles conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del proyecto de investigación científica de la sociedad de medicina tradicional china de Jiangsu (XYLD2024038) y del proyecto de investigación científica del Comité de Salud y Bienestar de Nantong (QNZ2023115).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5-Fluoro-2' desoxiuridinasigmaF0503
Cefuroxima sodio Shandong Runze Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaGuoyao Zhunzi H20205058
Solución de tinción DAPIBiyotimeC1005
DispersasaShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd.S25046
Suero fetal bovino (FBS)Termodinámica16000-044
fórceps hemostáticos Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J31070
Fibronectina plasmática humana (Fibronectina Humana) y nbsp;sigmaF0895
IsofluranoRWDR510-22-10 
Sistema de microimagen de micro-TC para animales vivosPerkinElmer en Estados UnidosQuantum GX 
Medio de la Cultura MEM-ALPHA  BIC3060
portaagujas y nbsp;Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;200622
tijeras operativas Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J21130
PENICILINASolarbio140051251
Solución de penicilina-estreptomicina NovaCellsN-PSS125
Povidona-yodoMeilunbioMB1313800g
Hoja de bisturíShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.RYY070
Empuñadura de bisturíShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J11010
sutura Johnson & Johnson MEDICAL (CHINA) Ltd. SA84G
Aguja de suturaEquipos médicos de Shanghai XIAOYU.& Delta; 3/8 y punto medio; 3 y veces; 6
Aguja de titanioTianjin Yutong Medical Device & nbsp;2-0X250 
pinzas de tejido dentado y nbsp;Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J41055
Cloruro de tramadolJiangsu Jiuxu Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaCYHB2201997
Tubulina beta-IIIsigmaCBL412X
Colagenasa tipo I y nbsp;Termodinámica17100-017
Microscopio de fluorescencia invertida Zeiss Axio Vert A1ZeissAxio Vert A1

Referencias

  1. GBD 2019 Fracture Collaborators. Global, regional, and national burden of bone fractures in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis from the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Healthy Longev. 2 (9), e580-e592 (2021).
  2. Zeng, Y., et al. The incidence, prevalence, and health burden of forearm fractures in China from 1992 to 2021 and forecasts for 2036. Front Public Health. 13, 1566421(2025).
  3. Miskiewicz, M., Hakimi, A., Ling, K., Tesoriero, J., Komatsu, D., Wang, E. Epidemiology, risk factor, and economic analysis of peripheral nerve injury following distal radius fractures. Eur J Orthop Surg Traumatol. 35 (1), 292(2025).
  4. Olech, J., Ciszewski, M., Morasiewicz, P. Epidemiology of distal radius fractures in children and adults during the COVID-19 pandemic - a two-center study. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 306(2021).
  5. Liu, K., Grigor, E. J. M., Antflek, D., Ho, G., Baltzer, H. L., Paul, R. Time to surgical management of distal radius fractures: effects on health care utilization and functional outcomes. Can J Surg. 67 (4), E286-E294 (2024).
  6. Khan, S., Persitz, J., Shrouder-Henry, J., Khan, M., Chan, A., Paul, R. Effect of time-to-surgery on distal radius fracture outcomes: A systematic review. J Hand Surg Am. 48 (5), 435-443 (2023).
  7. Hunt, J. J., Lumsdaine, W., Attia, J., Balogh, Z. J. AO type-C distal radius fractures: the influence of computed tomography on surgeon's decision-making. ANZ J Surg. 83 (9), 676-678 (2013).
  8. Gutiérrez-Espinoza, H., et al. Effectiveness and safety of different treatment modalities for patients older than 60 years with distal radius fracture: A network meta-analysis of clinical trials. Int J Environ Res Public Health. 20 (4), 3697(2023).
  9. Rozental, T. D., Blazar, P. E., Franko, O. I., Chacko, A. T., Earp, B. E., Day, C. S. Functional outcomes for unstable distal radial fractures treated with open reduction and internal fixation or closed reduction and percutaneous fixation: A prospective randomized trial. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1837-1846 (2009).
  10. Bentohami, A., De Burlet, K., De Korte, N., Selles, R. W., Goslings, J. C., Schep, N. W. Complications following volar locking plate fixation for distal radial fractures: a systematic review. J Hand Surg Eur. 39 (7), 745-754 (2014).
  11. Jiang, J. J., Phillips, C. S., Levitz, S. P., Benson, L. S. Risk factors for complications following open reduction internal fixation of distal radius fractures. J Hand Surg Am. 39 (12), 2365-2372 (2014).
  12. Qiu, X., et al. Satellite glial cells in sensory ganglia play a wider role in chronic pain via multiple mechanisms. Neural Regen Res. 19 (5), 1056-1063 (2024).
  13. Krames, E. S. The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain. Pain Med. 15 (10), 1669-1685 (2014).
  14. Sapunar, D., Kostic, S., Banozic, A., Puljak, L. Dorsal root ganglion-a potential new therapeutic target for neuropathic pain. J Pain Res. 5, 31-38 (2012).
  15. Liang, T. Z., et al. Targeting the central and peripheral nervous system to regulate bone homeostasis: mechanisms and potential therapies. Mil Med Res. 12 (1), 13(2025).
  16. Tuzmen, C., Campbell, P. G. Crosstalk between neuropeptides SP and CGRP in regulation of BMP2-induced bone differentiation. Connect Tissue Res. 59 (sup1), 81-90 (2018).
  17. He, H., et al. CGRP may regulate bone metabolism through stimulating osteoblast differentiation and inhibiting osteoclast formation. Mol Med Rep. 13 (5), 3977-3984 (2016).
  18. Wang, L., et al. Calcitonin-gene-related peptide stimulates stromal cell osteogenic differentiation and inhibits RANKL induced NF-kappaB activation, osteoclastogenesis and bone resorption. Bone. 46 (5), 1369-1379 (2010).
  19. Harris, I., Hatfield, A., Donald, G., Walton, J. Outcome after intramedullary nailing of femoral shaft fractures. ANZ J Surg. 73 (6), 387-389 (2003).
  20. Lin, C., Sun, J. S., Hou, S. M. External fixation with or without supplementary intramedullary Kirschner wires in the treatment of distal radial fractures. Can J Surg. 47 (6), 431-437 (2004).
  21. Board, T. N., Yang, L., Saleh, M. Why fine-wire fixators work: an analysis of pressure distribution at the wire-bone interface. J Biomech. 40 (1), 20-25 (2007).
  22. Bäcker, H. C., Heyland, M., Wu, C. H., Perka, C., Stöckle, U., Braun, K. F. Breakage of intramedullary femoral nailing or femoral plating: how to prevent implant failure. Eur J Med Res. 27 (1), 7(2022).
  23. Lethaby, A., Temple, J., Santy-Tomlinson, J. Pin site care for preventing infections associated with external bone fixators and pins. Cochrane Database Syst Rev. 2013 (12), CD004551(2013).
  24. Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. Implant infections: adhesion, biofilm formation and immune evasion. Nat Rev Microbiol. 16 (7), 397-409 (2018).
  25. Box, M. W., et al. Intramedullary nail fixation versus open reduction and internal fixation for treatment of adult diaphyseal forearm fractures: a systematic review and meta-analysis. J Orthop Surg Res. 19 (1), 719(2024).
  26. Burnikel, A., Faucher, G. Treatment of metacarpal and phalangeal fractures: Intramedullary screw technique. JBJS Essent Surg Tech. 15 (4), e23.00032(2025).
  27. Aktan, C., Ertan, M. B., Turan, A., Kose, O. Fixation of small osteochondral fragments in a comminuted distal humerus fracture with magnesium bioabsorbable screws: A case report. Cureus. 10 (12), e3752(2018).
  28. Shyamalan, G., Theokli, C., Pearse, Y., Tennent, D. Volar locking plates versus Kirschner wires for distal radial fractures-a cost analysis study. Injury. 40 (12), 1279-1281 (2009).
  29. Wang, D., Huang, X., Lv, W., Zhou, J. The toxicity and antibacterial effects of povidone-iodine irrigation in fracture surgery. Orthop Surg. 14 (9), 2286-2297 (2022).
  30. Shiels, S. M., Muire, P. J., Wenke, J. C. FK506 increases susceptibility to musculoskeletal infection in a rodent model. BMC Musculoskelet Disord. 23 (1), 716(2022).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Fractura radial en rataim genes de micro CTfijaci n con aguja de titaniofijaci n con suturaaislamiento de DRGcultivo de neuronas primariasevaluaci n de la cicatrizaci n sea

Artículos relacionados