Aislamiento de pericitos de tejido cortical de ratón usando FACS para secuenciación unicelular

Resumen

Para obtener pericitos corticales cerebrales de ratón que cumplan con las demandas del scRNA-seq, presentamos un protocolo FACS críticamente optimizado basado en la selección CD13⁺/CD31⁻. Nuestros refinamientos clave mejoran significativamente la viabilidad celular y la integridad del ARN, permitiendo un perfil transcriptómico fiable.

Resumen

Los pericitos, como componente central de la unidad neurovascular, desempeñan un papel vital en el mantenimiento de la integridad de la barrera hematoencefálica y en la regulación de la homeostasis hemodinámica cerebral mediante la modulación del tono microvascular. La disfunción de los pericitos ha estado implicada en una variedad de trastornos neurológicos. Para investigar la heterogeneidad de los pericitos y elucidar sus mecanismos en enfermedades neurovasculares con resolución unicelular, establecimos un protocolo optimizado y reproducible para aislar pericocitos cerebrales de ratón adecuados para la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq). Este método se basa en la estrategia establecida ^{de clasificación} CD13⁺/CD31, pero incorpora mejoras clave diseñadas específicamente para aplicaciones scRNA-seq. Brevemente, se extrajeron cerebros de tres ratones adultos C57BL/6. Los tejidos cerebrales se disociaron mecánicamente y se sometieron a digestión enzimática para obtener suspensiones unicelulares. Tras la centrifugación secuencial, el pellet celular final fue resuspendido en una solución de albúmina sérica bovina al 20% (BSA), un paso clave que introdujimos para minimizar el estrés y la agregación, maximizando así la viabilidad y la calidad del ARN para la secuenciación. Este enfoque optimizado basado en FACS permite así el aislamiento robusto de pericitos cerebrales viables de ratón que cumplen con los estrictos requisitos para el scRNA-seq, ofreciendo una herramienta poderosa para diseccionar la heterogeneidad de los pericitos y sus roles patológicos en enfermedades neurovasculares.

Introducción

Los pericitos son un tipo importante de célula situada a lo largo de microvases, típicamente incrustada en la membrana basal capilar y envolviendo células^{endoteliales.} En el cerebro, los pericitos, junto con las células endoteliales, astrocitos y otros tipos celulares, forman la unidad neurovascular y son parte integral de la estructura y función de la barrera hematoencefálica (BBB). Los pericitos desempeñan un papel esencial en la regulación del flujo sanguíneo cerebral, la remodelación vascular y el mantenimiento de la homeostasis vascular. Mantienen la integridad del BBB mediante interacciones físicas cercanas y señalización paracrina con células^{vecinas 2}; regulan dinámicamente el transporte transendotelial mediante endocitosis y la expresión de proteínas transportadoras específicas; y contribuir a la estabilidad hemodinámica cerebral mediante sus actividades contráctiles y^{relajantes 3}. La disfunción de los perícitos, así como alteraciones en su cobertura o densidad, pueden provocar desregulación vascular y déficits neurológicos, resultando finalmente en cambios patológicos asociados a diversos trastornos^{neurológicos 4}. Sin embargo, la heterogeneidad inherente de los pericitos plantea desafíos significativos para estudios mecanicistas posteriores.

Con el avance de la tecnología de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq), un número creciente de estudios ha utilizado el scRNA-seq para explorar la heterogeneidad celular e identificar objetivos clave en la patogénesis y progresión de enfermedades. Los marcadores pericitales comúnmente utilizados incluyen el receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-β)⁵, el antígeno glial neuronal 2 (NG2) y la actina del músculo alfa-liso (α-SMA). Sin embargo, estos marcadores tienen una especificidad⁶ relativamente baja, ya que pueden marcar simultáneamente otras células vasculares, como las del músculo liso, y células precursoras neurales como las células progenitoras de los oligodendrócitos, lo que dificulta distinguir pericitos de otras células cerebrales. En busca de una alternativa más robusta, recurrimos al CD13 (Aminopeptidasa N, APN), un marcador ampliamente reconocido por su fuerte y constante expresión en pericitos cerebrovasculares en estudios^previos 7,8,9,10. En nuestro estudio, realizamos tinción por inmunofluorescencia en secciones de tejido cerebral, y los resultados confirmaron la expresión de CD13 en pericitos, demostrando su eficacia para distinguir perecitos de células endoteliales, ya que la señal CD13 se asociaba exclusivamente a células perivasculares y estaba ausente en células endoteliales CD31⁺. (Figura 1A). Sin embargo, es importante señalar que la expresión de CD13 no es completamente exclusiva de los pericitos; También se observan niveles detectables en células musculares lisas de arteríolas y vénulas (Figuras 1B,C).

Figura 1: La tinción por inmunofluorescencia muestra la expresión de CD13 en pericitos vasculares cerebrales y células musculares lisas, sin señal detectable en células endoteliales. (A) Imagen representativa de inmunofluorescencia de la zona de transición arteriola-capilar en la microvasculatura cerebral. La imagen combinada muestra pericitos CD13⁺ (verde) que recubren células endoteliales CD31⁺ (rojo). Las células musculares lisas ^α-SMA+ (cian) están localizadas en la región arteriolar y están ausentes en los capilares. (B) Sección transversal de una arteríola. Las imágenes demuestran una clara colocalización de las células musculares lisas CD13⁺ (verde) y ^α-SMA+ (cian) en la capa muscular lisa circundante, confirmando la expresión de CD13 en las células del músculo liso arteriolar. (C) Sección transversal de una vénula. De manera similar, CD13 (verde) es detectable en las células musculares lisas de la α-SMA (puntas de flecha) de la pared venular. Barra de escala: 20 μm (A-C). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Para obtener pericitos vasculares corticales de ratón que cumplan los requisitos para el sequestro de SCRNA, realizamos un sistema de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando marcaje de anticuerpos CD13⁺/CD31⁻ para el aislamiento^{de pericitos 11}. Inicialmente, se utilizaron marcadores CD45 y CD41 para excluir células hematopoyéticas de las suspensiones de tejido^{cerebral 12}. Posteriormente, los pericitos se enriquecieron seleccionando células CD13⁺ , y las células endoteliales se excluyeron además mediante la gating ^{para poblaciones} CD31, aislando así la población objetivo de^{pericitos 13}.

Reconocemos que el paso de selección positivo para CD13 captura simultáneamente las células musculares lisas que expresan CD13 tanto de arteríolas como de vénulas. Para cumplir con los requisitos críticos de scRNA-seq y maximizar la retención de pericitos, seleccionamos estratégicamente esta combinación de marcadores para priorizar el rendimiento de pericitos en la fase de clasificación. Aunque este enfoque conduce al aislamiento de una población menor de células musculares lisas, maximiza eficazmente la recuperación de todos los perícitos potenciales durante la fase preliminar de enriquecimiento. Esta estrategia de gating por etapas minimiza significativamente la pérdida celular inicial. Además, para maximizar la viabilidad y el rendimiento de los pericitos, también empleamos una solución de BSA al 20% para la resuspensión y filtración celular post-disociación, eliminando eficazmente los residuos mientras se preserva la viabilidad y pureza celular^{ordenada 14}.

Utilizando este método, distinguimos con éxito los pericitos vasculares cerebrales de otros tipos celulares, logrando preparaciones de pericitos de alta pureza y alta viabilidad que cumplen los estrictos requisitos para el scRNA-seq. Esta técnica proporciona una base sólida para investigaciones posteriores y profundas sobre el papel de los pericitos en diversos contextos de enfermedades.

Protocolo

En este estudio, utilizamos tres ratones adultos C57BL/6J (3 meses, 20-25 g). Todos los ratones fueron alojados bajo un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad con temperatura y humedad estrictamente controladas, con acceso libre a comida y agua antes de los experimentos. Todos los procedimientos experimentales con animales de laboratorio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Ética de Animales de Laboratorio del Instituto de Microcirculación, la Academia China de Ciencias Médicas y la Facultad Médica de la Unión de Pekín, y se llevaron a cabo en estricta conformidad con las directrices pertinentes de bienestar animal.

1. Preparación de reactivos

1. Solución de glucosa al 30% (peso/vol): Disuelva 15 g de glucosa en 50 mL de_{dH 2}O libre de DNasa UltraPure/RNasa. Para asegurar la disolución completa, primero añade glucosa a 20 mL de_{dH 2}O libre de DNasa/RNasa UltraPure y mezcla bien. Luego añade_{dH 2}O libre de DNasa/RNasa UltraPure a un volumen final de 50 mL. Filtra la solución y guárdala a 4 °C durante hasta 6 meses.
2. DNasa I (10 mg/mL): Disolve 50 mg de DNasa I en 5 mL de ddH_2Oestéril. La solución de origen puede almacenarse a -20 °C durante hasta 2 meses.
   NOTA: Los ciclos repetidos de congelación-deshielo deben evitarse estrictamente para evitar la pérdida de actividad enzimática. Para minimizar los efectos de congelación-descongelación, se aplican 150 μL de la solución en tubos estériles de microcentrífuga antes de la congelación inicial, y se descongelan las alicuotas individuales según sea necesario para los experimentos.
3. Suero Fetal Bovino (FBS) al 2% (vol/vol) en solución salina tamponada con fosfato (PBS): Prepara 1× PBS mezclando 5 mL de 10× PBS con 45 mL de UltraPure DNasa / RNasa_{libre de dH 2}O. Añade 1 mL de FBS a 49 mL de 1× PBS y mezcla bien.
   NOTA: Prepara esta solución de forma fresca durante el paso 2.1.2. Asigna 15 mL por muestra de tejido.
4. Solución de colagenosa y enzima dispasa (CD): Disuelva 100 mg de dispasa y 100 mg de colagénasa por separado en 1 mL de_{dH 2}O libres de UltraPure DNasa/RNasa sin RNasa. Combinar soluciones para obtener un volumen final de 2 mL (concentración enzimática de 100 mg/mL).
   NOTA: Alicuota 500 μL en tubos estériles de microcentrífuga y se almacena a -20 °C. Haz vórtice antes de usarlo para evitar la pérdida de actividad por ciclos de congelación y deshielo. Es importante señalar que la forma en polvo puede causar irritación severa de la piel/ojos y dificultad respiratoria. Siempre manéchalo en una campana extractora química mientras llevas guantes de nitrilo y una mascarilla N95. En caso de exposición, riega inmediatamente la zona afectada con abundante agua y busca atención médica.
5. Solución de trabajo enzimática CD: Mezcla 1,5 mL de solución stock enzimática CD con 43,5 mL de FBS al 2% (vol/vol) en PBS (desde el Paso 1.3) mediante inversión suave.
   NOTA: Prepárense inmediatamente antes de la disociación tisular (Paso 2.3.4). Este volumen está optimizado para tres ratones; Ajusta proporcionalmente según sea necesario.
6. Solución de Percoll al 22% (vol/vol): Combinar 11 mL de Percoll, 5 mL de 10× PBS y 34 mL de UltraPure DNasa /_{dH 2}O libre de RNasa para preparar una solución de 50 mL.
   NOTA: Esterilizar con filtro a través de una membrana PES de 0,22 μm. Puede almacenarse a 4 °C durante un mes sin pérdida significativa de estabilidad.
7. Buffer de disociación mecánica: Añadir 1 mL de DNasa I (10 mg/mL) a 10 mL de FBS al 2% (vol/vol) en PBS (del Paso 1.3). Mezcla pipeteando.
8. Soluciones BSA: Preparar soluciones BSA del 1%, 20% y 35% (peso/volúmenes) por separado de la siguiente manera:
   1. 1% (peso/vol) BSA: Disolver 0,15 g de BSA en 15 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
   2. 20% (peso/vol) BSA: Disuelve 3 g de BSA en 15 mL de DPBS.
   3. 35% (peso/vol) BSA: Disolver 0,7 g de BSA en 2 mL de DPBS.
      NOTA: Filtra todas las soluciones a través de una membrana PES de 0,22 μm antes de su uso.
9. Solución Balanceada de Sal (HBSS)/BSA/Buffer de glucosa de Hanks: Añadir 167 μL de glucosa al 30% (peso/vol) (del Paso 1.1) y 1,4 mL de BSA al 35% (en peso/vol) (del Paso 1.8) a 50 mL de HBSS, mezclar suavemente.
   NOTA: Prepara esta solución fresca en condiciones estériles durante el Paso 2.1.2. Guárdalos a 4 °C hasta el uso.
10. Buffer de recogida de tejidos: Suplementar 12 mL de HBSS/BSA/Buffer de glucosa (del paso 1.9) con 800 μL de DNasa I (10 mg/mL). Úsalo para almacenamiento temporal de tejidos y enjuague de pipetas.
    NOTA: Prepara esta solución fresca en condiciones estériles durante el Paso 2.1.2.
11. 1,25% (p/v) Solución de tribromoetanol: Disuelva 1,25 g de 2,2,2-Tribromoetanol en 2,5 ml de 2-Metil-2-butanol y luego añade esta mezcla a 97,5 ml de ddH_2Oestéril o solución fisiológica para obtener una solución clara de tribromoetanol al 1,25%.
    NOTA: Prepara la solución fresca antes de cada uso. Guárdalo protegido de la luz a temperatura ambiente y úsalo con prontitud.

2. Procedimiento experimental (usando tres ratones como ejemplo)

1. Preparación previa al experimento (Tiempo: 30 min)
   1. Autoclave requería consumibles y desinfectar instrumentos quirúrgicos con etanol al 75% (vol/vol).
   2. Preparar soluciones operativas: 1× PBS (del Paso 1.3), FBS al 2% (vol/vol) en PBS (del Paso 1.3), HBSS/BSA/solución de glucosa (del Paso 1.9) y buffer de recogida de tejido (desde el Paso 1.10).
   3. Vierte 10 mL de PBS de 1× en una bandeja de 10 cm para celdas y déjala en hielo.
   4. Prepara tres ampollas, añade 3 mL de tampón para recoger tejido a cada una y guárdalas en hielo.
   5. Prepara tres tubos centrífugos de 15 mL, añade 10 mL de FBS al 2% (vol/vol) en PBS a cada uno y guárdalos en hielo.
2. Extracción de cerebro de ratón (Tiempo: 30 min)
   1. Los ratones fueron profundamente anestesiados mediante inyección intraperitoneal de tribromoetanol (del Paso 1.11) a una dosis de 0,2 mL por cada 10 g de peso corporal. Tras la pérdida de reflejos pedales, se realizó la eutanasia por luxación cervical.
      NOTA: Si el ratón no alcanzó un plano quirúrgico de anestesia (evaluada por la ausencia de reflejo de retirada pedal) dentro de los 5-10 minutos posteriores a la inyección, se administró una dosis intraperitoneal suplementaria de tribromoetanol, igual a un tercio de la dosis inicial.
   2. Rocía la zona de la cabeza/cuello con etanol al 75%. Haz una incisión en la línea media del cuero cabelludo desde la región occipital hasta la frontal para exponer el cráneo. Realizar una incisión transversal anterior a las órbitas bilaterales, seguida de incisiones laterales a lo largo de los márgenes inferiores del cerebelo para desprender la base del cráneo. Finalmente, incise el calvario longitudinalmente a lo largo de la sutura sagital de posterior a anterior. Levanta el colgajo craneal para exponer el cerebro encerrado en duramadre. Eleva suavemente el cerebro mientras se seccionan los nervios ópticos y la conexión de la médula oblonga-médula espinal con tijeras^{quirúrgicas 15}. Coloca el cerebro intacto en un recipiente de 10 cm que contenga 10 mL de PBS 1× helado.
      NOTA: Manipula el tejido con cuidado para evitar daños.
   3. Transfiere el cerebro a papel de aluminio. Con pinzas, levanta la duramadre de los márgenes y extiéndela a lo largo de los surcos medianos. Tras la extracción completa de la duramadre, expone el espacio subaracnoideo. Enjuaga el espacio subaracnoideo con solución HBSS, luego diseca los vasos con una aguja roma y retira cuidadosamente la pia mater¹⁶. Secciona el cerebro coronalmente en rodajas de 2-3 mm de grosor usando una cuchilla de afeitar. Descarta las secciones olfativas del bulbo y caudales. Aislar la corteza cerebral a lo largo del cuerpo calloso y transferir tejido cortical a ampollas que contienen 3 mL de tampón de recogida de tejido^{helado 11}.
   4. El aislamiento de pericitos en este protocolo se dirige específicamente a la corteza cerebral. Para otras regiones de interés: Coloca secciones coronales en una diapositiva de dos pozos con una gota de FBS del 2% (vol/vol) en PBS. Identificar regiones objetivo mediante microscopía de disección, aislar manualmente y proceder con los mismos pasos de procesamiento posteriores.
3. Disociación tisular (Tiempo: 3-3,5 h)
   1. Picar tejidos en ampollas usando bisturís quirúrgicos en fragmentos de aproximadamente 1 mm × 1 mm.
      NOTA: Completar el picado en 5 minutos para preservar la frescura del tejido.
   2. Preenjuaga las puntas de la pipeta con un amortiguador de recogida de tejido. Aspira lentamente los fragmentos picados hacia el ápice de la punta manteniendo la orientación vertical (punta hacia abajo). Expulsar suavemente los fragmentos en tubos centrifugadores de 15 mL preenfriados (preparados en el Paso 2.1.5).
      NOTA: Evita aspirar fragmentos en el barril superior para evitar que se adhieran a la pared de la pipeta.
   3. Lava las ampollas que contienen fragmentos (del paso 2.3.1) con un FBS al 2% (vol/vol) en PBS y transfiere el lavado a tubos de centrífuga. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos.
   4. Descarta los supernacionantes tras la centrifugación. Resuspende los pellets en 3 mL de solución de trabajo enzimática CD (del Paso 1.5) por tubo. Alicuelta cada suspensión por igual en tres tubos (un total de 9 tubos, 1 mL/tubo), y luego se complementa con 4 mL de solución de trabajo enzimática CD (volumen final: 5 mL/tubo).
   5. Incubar tubos en un horno de hibridación a 37 °C durante 100 minutos con agitación orbital a 100 x^{g 14}.
   6. Prepara la solución de disociación tisular durante la incubación añadiendo 1 mL de solución de DNasa I a 10 mL de FBS al 2% (vol/vol) en PBS (del Paso 1.10).
   7. Terminar la digestión por centrifugación a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos.
      NOTA: Evalúa la eficiencia digestiva microscópicamente usando una alicota de 10-20 μL. El extremo ideal se manifiesta como fragmentos vasculares en forma de perla; Los segmentos vasculares alargados indican una digestión insuficiente, mientras que las células individuales predominantes indican sobredigestión.
   8. Resuspender los comprimidos en 1 mL de solución de disociación tisular por tubo. Disocia mecánicamente pipeteando 100 veces¹¹.
      NOTA: Evitar la aspiración de volumen completo de la pipeta para minimizar la formación de burbujas y preservar la viabilidad celular.
   9. Agrupar todas las suspensiones (de un total de 9 tubos de digestión que representan los tejidos cerebrales de 3 ratones) en un tubo centrífugo de 50 mL. Enjuaga cada tubo de digestión con 2 mL de FBS al 2% (vol/vol) en PBS y mezcla lavados. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos.
   10. Tras la centrifugación, se pueden ver capas distintas. Descarta cuidadosamente la capa superior (que contiene impurezas y pequeños restos celulares), mientras se conserva la capa intermedia (compuesta por células o agrupaciones celulares de menor densidad) y la capa inferior (células intactas y fragmentos de tejido parcialmente no digeridos). Añade 12,5 mL de solución al 20% de BSA y invierte suavemente el tubo para volver a suspender los pellets. Centrifugar de nuevo a 1000 × g a 4 °C durante 20 minutos.
   11. Recoge el pellet inferior (enriquecido en células intactas de mayor pureza) y transfiere el sobrenadante (que contiene principalmente restos de mielina, lípidos y un pequeño número de células) a un nuevo tubo centrífuga de 50 mL. Resuspende por inversión suave y repite centrifugada a 1.000 x g a 4 °C durante 20 minutos.
   12. Resuspender cada pellet obtenido de los dos pasos de centrifugación (paso 2.3.10 y paso 2.3.11) en 2 mL de FBS al 2% (vol/vol) en PBS cada uno (volumen combinado final: 4 mL).
       NOTA: Evita tocar las paredes del tubo durante la resuspensión para minimizar la contaminación por residuos.
   13. Combina las dos suspensiones resuspendidas del paso anterior en un tubo centrífugo de 15 mL. Centrifugar a 300 × g, 4 °C durante 5 minutos. Descarta el sobrenadante (tampón de residuos que contiene BSA, restos celulares y potencialmente trazas de lípidos de mielina residuales). Resuspende el pellet (las celdas objetivo definitivas, purificadas y lavadas, de alta pureza intactas) en 2 mL de solución de PBS que contenga un 2% de FBS.
       NOTA: Este paso consiste en transferir las celdas a un buffer de suspensión limpio y adecuado para aplicaciones posteriores.
   14. Prepara cuatro tubos centrífugos de 15 mL, cada uno con 4 mL de solución Percoll al 22%. Aplicar suavemente 0,5 mL de alicotas de resuspensión sobre el gradiente de Percoll (cuatro alicuotas en total) para maximizar el rendimiento de la celda. Centrifugar a 560 x g a 4 °C durante 10 minutos.
       NOTA: Configura la centrífuga en "sin freno" para evitar la alteración del gradiente de densidad inducida por vórtice, asegurando que los restos de mielina permanezcan estabilizados en el sobrenadante.
   15. Aspira cuidadosamente los sobrenadantes. Resuspende los pellets en 1 mL de HBSS/BSA/buffer de glucosa por tubo. Suspensiones de piscina en un nuevo tubo de 15 mL. Enjuaga los tubos de Percoll con 2 mL de HBSS/BSA/buffer de glucosa y combina lavados. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos).
4. Preparación y adquisición de clasificación de citometría de flujo (Tiempo: 50 min)
   1. Aspira cuidadosamente el sobrenadante. Resuspende el pellet celular en 1 mL de HBSS/BSA/buffer de glucosa.
   2. Añade 5 μL de reactivo bloqueador del receptor Fc (FcR) a la suspensión celular e incuba a 4 °C durante 5 minutos.
   3. Añadir los siguientes anticuerpos conjugados fluorescentes a la suspensión celular en los volúmenes indicados (suficientes para tejido derivado de 3 ratones): 5 μL de CD45-PE; 5 μL de CD41-PE; 20 μL de CD31-APC; 15 μL de CD13-FITC.
   4. Incuba las células sobre hielo durante 20 minutos en la oscuridad.
      NOTA: Protege de la luz. Evita remover algo.
   5. Añade 6 mL de HBSS/BSA/tampón de glucosa para lavar las células. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 minutos.
   6. Aspira el sobrenadante. Resuspende el pellet celular en 1 mL de HBSS/BSA/buffer de glucosa. Añadir 200 μL de solución de 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (para excluir células muertas) e incubar sobre hielo durante 10 minutos. Después, ajusta el volumen a 2 mL con HBSS/BSA/buffer de glucosa.
      NOTA: Protege de la luz.
   7. Añade una solución de BSA al 1% para clasificar los tubos de recogida (tubos cónicos de 15 mL), y haz un giro suave para enjuagar las superficies internas. Aspira el exceso de solución, dejando exactamente 1 mL de solución de BSA al 1% en cada tubo para recibir las células clasificadas. Guárdalos temporalmente en hielo.
   8. Filtra la suspensión de celdas teñidas a través de un colador de 40 μm justo antes de clasificar.
   9. Establecer una compuerta inicial basada en los parámetros de dispersión directa (FSC-A) y dispersión lateral (SSC-A) para excluir los residuos celulares que exhiban señales FSC-A/SSC-A bajas.
   10. La depleción de las células hematopoyéticas del linaje se logró mediante la compuerta dual-negativa para CD45 y CD41, eliminando eficazmente la contaminación de leucocitos, células inmunitarias y plaquetas.
   11. Capturar pericitos presuntos mediante selección CD13-positiva de células de pared vascular.
   12. Evaluar la integridad de la membrana mediante sondeo fluorescente 7-AAD; excluye las células apoptóticas mediante la vía de uso de 7-AAD⁻.
       NOTA: Recoger pericitos de alta pureza CD31⁻/CD13⁺ mediante selección CD31-negativa. Recoge los pericitos clasificados directamente en tubos que contienen un 1% de BSA (del paso 2.4.7) y colócalos sobre hielo. Prepara inmediatamente las suspensiones de celda única para el conteo. Luego carga las muestras directamente para la secuenciación sin pasos intermedios de cultivo.
5. Seguimiento y análisis de scRNA (Tming: 3-4 días)
   1. Se prepararon suspensiones de células únicas de pericitos clasificados siguiendo el protocolo de la Guía del Usuario de 10x Genomics "GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reactive Kits (CG000731)^17,18. La suspensión de celdas preparada para la carga tenía una viabilidad de > 90% y se diluyó hasta una concentración dentro del rango recomendado de 300-2000 celdas/μL.
   2. Combinar la suspensión unicelular con perlas de gel con código de barras y enzimas, luego particionar en perlas de gel en emulsión (GEMs) mediante encapsulación microfluídica^{de gotas 19}. Realizar lisis celular in situ , transcripción inversa y enlace código de barras-cADN.
   3. Rompe GEMs para recuperar productos. Amplificar el ADNc mediante PCR usando el siguiente protocolo: desnaturalización inicial a 9 °C durante 4 segundos; seguido de ciclos (13 ciclos para <500 celdas objetivo, 12 ciclos para 501-6000 celdas objetivo) que consiste en desnaturalización a 9 °C durante 2 s, recocido a 9 °C durante 3 s y extensión a 7 °C durante 6 s por ciclo; y una extensión final a 72 °C durante 1 minuto, seguida de una retención a 4 °C. Validar los productos amplificados para el tamaño del fragmento (200-300 pb) y el rendimiento.
      NOTA: Los productos de amplificación pueden almacenarse a 4 °C durante hasta 72 horas o a -2 °C durante una semana, o pueden procesarse directamente en el siguiente paso.
   4. Para ADNc cualificado: fragmentar, realizar reparaciones en el extremo, ligar el adaptador P7 y amplificar con cebadores índice. Seleccionar fragmentos por tamaño para construir bibliotecas de secuenciación.
   5. Bibliotecas de secuencias en la plataforma NovaSeq de Illumina tras la validación de control de calidad.
   6. Datos de secuenciación desmultiplexada para extraer códigos de barras celulares, identificadores moleculares únicos (UMIs) y secuencias de ARN. Align se refiere al genoma de referencia.
   7. Cuantifica los recuentos de UMI, estima el número de células válidas y genera una matriz de expresión^{gen-código de barras 20}.
   8. Elimina dobletes usando el paquete DoubletFinder (v2.0.6) en R. Predecir basándose en la identificación artificial del vecino más cercano para garantizar la calidad de los datos.
   9. Realizar análisis de componentes principales (PCA) y reducción de dimensionalidad por Aproximación y Proyección de Variedades Uniformes (UMAP) usando Seurat (v5.0). Identificar los grupos celulares y visualizar los genes marcadores específicos de los pericitos para validar la identidad celular.

Resultados

Para lograr un aislamiento preciso de los pericitos cerebrales, las células disociadas del tejido cerebral fueron teñidas con PE Texas Red anti-ratón CD41/CD45, anti-ratón CD13 conjugado con FIC y CD31 anti-ratón conjugado con APC, estableciendo una estrategia de clasificación en varios pasos que integra marcadores superficiales y detección de viabilidad (Figura 2). El gating inicial basado en los parámetros de dispersión hacia adelante (FSC-A) y dispersión ...

Discusión

Este estudio describe una estrategia FACS sistemáticamente optimizada y validada basada en el marcaje multicolor CD13⁺/CD31⁻ para el aislamiento altamente eficiente de los pericitos vasculares cerebrales^{de ratón 24}. Los análisis citométricos de flujo y los posteriores análisis de scRNA-seq confirmaron que el método discrimina con precisión los pericitos de las células endoteliales y produce células que cumplen consistentemente con todas las métricas críticas de co...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	Alicuota y almacene a -20°C; se puede almacenar a 4°C durante hasta 1 semana después de descongelarlo
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)	Life Technologies	70011-044	Diluya antes de usar para lavar células
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	Para preparar el tampón energético celular
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	Protege las células y previene la adhesión
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	Para lavar y resuspender células
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Para preparar sistemas de reacción libres de nucleasas
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	Para la digestión de tejidos y disociación celular; alicue y almacene a -20°C
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	Previene la agregación de ADN; alicue y almacene a -20°C
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	Para la separación celular; almacene a 4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	Conjugado fluorescente; almacene protegido de la luz a 4°C durante hasta 1 mes
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	Almacene protegido de la luz a 4°C durante varios meses
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	Almacene protegido de la luz a 4°C durante varios meses
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	Almacene protegido de la luz a 4°C durante varios meses
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	Control de fluorescencia; almacene protegido de la luz a 4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	Almacene protegido de la luz a 4°C durante varios meses
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	Almacene protegido de la luz a 4°C durante varios meses
RNase AWAY Decontamination Reagent	Ambion	10328011	Para eliminar la contaminación por RNasa
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Previene la unión no específica de anticuerpos
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	Para la exclusión de células muertas.
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	Para la preparación de la solución de Tribromoetanol al 1.25% (p/v)
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	Para la preparación de la solución de Tribromoetanol al 1.25% (p/v)
C57BL/6 mouse	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
cell cluture dish 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Software de análisis de datos de secuenciación de células individuales
Loupe Cell Browser		4.1	Navegador de células
STAR		2.5.1b	Alineación de ARN
irlbpy		-	Análisis de componentes principales
tsne		0.15	Análisis Barnes-Hut t-SNE (t-Distribución Estocástica de Vecinos Embebidos)
k-means		0.17	Agrupamiento K-Means
graph-based clustering		0.17	Agrupamiento basado en grafos
FastQC		v0.11.2	Control de calidad de datos (QC)