El protocolo presentado tiene como objetivo desarrollar un modelo celular que imite la obesidad humana. Para lograrlo, las células madre humanas derivadas del adiposo se diferencian en adipocitos, que luego se engordan mediante una mezcla de ácidos grasos seleccionados.
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Artículo de método
Diferenciación e inducción de la acumulación de gotas lipídicas en adipocitos humanos como modelo para estudiar la obesidad in vitro
En este artículo
Resumen
Resumen
Los cambios relacionados con la obesidad en el tejido adiposo alteran los perfiles secretores locales e influyen en las interacciones con otras células circundantes, incluidas las células cancerosas. El suministro continuo de nutrientes altera el metabolismo de las células grasas, haciendo que actúen como un reservorio lipídico. Normalmente, la investigación sobre los mecanismos de la obesidad se basa en modelos animales, que, sin embargo, no permiten el análisis de los procesos metabólicos a nivel celular. Por tanto, es necesario desarrollar un modelo in vitro fiable de la obesidad humana que pueda ayudar a explorar los cambios en la función de los adipocitos obesos en comparación con sus homólogos delgados. Este trabajo presenta un protocolo para la diferenciación de adipocitos humanos a partir de sus precursores (células madre derivadas del adiposo) utilizando una mezcla de insulina, isobutil-1-metilxantina, dexametasona e indometacina. Posteriormente, los adipocitos diferenciados fueron incubados con un conjunto de ácidos grasos, incluyendo linoleato, palmitato y oleato, para promover la acumulación de lípidos. Como resultado, se logró un modelo valioso que imita las células hipertróficas en condiciones de obesidad, que puede utilizarse para estudios posteriores.
Introducción
Se considera que la obesidad es un factor de riesgo importante para una amplia variedad de enfermedades, como trastornos musculoesqueléticos, enfermedades cardiovasculares, resistencia a la insulina, síndrome metabólico, diabetes y ciertos tipos de cáncer. La obesidad es uno de los problemas de salud pública más perceptibles y subestimados, con causas multielementales. En resumen, la obesidad se desencadena por un desequilibrio entre las calorías consumidas y gastadas, lo que resulta en un mayor almacenamientode grasa 2. El exceso calórico conduce a la expansión y disfunción patológica del tejido adiposo (AT), el elemento clave en el control de la homeostasis energética por parte del cuerpo.
Los adipocitos son el componente celular principal de laAT 3. El principal factor que contribuye al crecimiento de la AT en condiciones de obesidad es la hipertrofia celular, es decir, el aumento del volumen de adipocitos mediante un incremento de la cantidad de grasa almacenada en el citoplasma en forma de gotas lipídicas (LDs)4. Incluso si la obesidad es un trastorno patológico complejo, los estudios sobre el funcionamiento biológico de los adipocitos pueden servir como modelo para analizar sus causas y explorar nuevas estrategias de tratamiento. Esto pone de manifiesto la necesidad de una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares que impulsan las alteraciones en la función de los adipocitos para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a enfermedades relacionadas con la obesidad.
Los modelos animales son los que más se acercan a reflejar condiciones fisiológicas, lo que los hace ampliamente utilizados en estudios in vivo sobre la obesidad5. Sin embargo, extraer conclusiones sobre procesos biológicos fundamentales a nivel celular sigue siendo un gran desafío en un sistema multicapa, que favorece el uso de modelos in vitro de adipocitos. La investigación in vitro se basa más a menudo en el modelo celular 3T3-L1 del ratón, que, bajo condiciones adecuadas, adquiere un fenotipo6 similar al de un adipocito. No obstante, debido a su origen, este modelo no puede utilizarse para análisis más complejos, como condiciones de cocultivo con células humanas, y los resultados no siempre pueden traducirse directamente en adipocitos humanos. Por todas estas razones, se está buscando un modelo que imite la obesidad en humanos, y el uso de células madre derivadas del adiposo humano (ADSCs) con su posterior diferenciación parece ser racional. Por tanto, este modelo es más adecuado para estudiar la hipertrofia de adipocitos humanos in vitro debido a su baja complejidad. Permite la comparación de parámetros de un solo tipo de cultivo celular bajo diferentes condiciones, lo cual es inalcanzable in vivo debido a la presencia de múltiples tipos celulares en el tejido adiposo.
Los preadipocitos humanos y las células madre derivadas del adiposo aislados de la AT son los ejemplos más comunes para estudiar la disfunción de estetejido 6. Estas células, tras la diferenciación, son un modelo atractivo para modular los niveles de LD en adipocitos mediante un engorse adicional. No obstante, existen relativamente pocos estudios que examinen la hipertrofia en célulashumanas 7,8,9, y la mayoría utiliza solo un tipo de ácido graso (FA) para inducir la acumulación de LD.
Este protocolo propone suplementar los adipocitos humanos con una mezcla de FAs (palmitato, oleato y linoleato) para imitar ambientes de obesidad. Esto permite la obtención de una herramienta basada en adipocitos humanos sobrecargados de lípidos, que puede compararse directamente con las células adiposas de control (ingenuas). Este modelo puede utilizarse posteriormente para estudiar los cambios fenotípicos y funcionales entre adipocitos normales e hipertróficos, o, si es necesario, experimentar con condiciones de cocultivo.
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Protocolo
Utiliza técnicas estériles para realizar todos los pasos del protocolo en una campana de cultivo celular de flujo laminar. Consulte la Tabla de Materiales para detalles sobre todos los reactivos y equipos. El protocolo de diferenciación descrito a continuación es adecuado para células madre humanas derivadas del adiposo y puede diferir entre otros tipos celulares y su origen. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de ADSC para la diferenciación
- Preparar el medio de crecimiento de ADSCs (ADSCs GM): Suplementar el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, que contiene 1 g/L de glucosa con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 2 mM de glutamina y antibióticos - solución antimicótica (100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B).
- Calienta los ADSC GM, solución salina con fosfato tamponado (PBS) y tripsina/EDTA a 37 °C.
NOTA: Los ADSC se obtienen de fuentes comerciales. Usa las células en los primeros pasadizos. Los múltiples pasajes conducen a una disminución del potencial de diferenciación de losADSC 10. - Retirar asépticamente el GM del ADSC de los ADSCs que crecen en un matraz T75 dedicado al cultivo celular.
- Lava el GM residual de los ADSC enjuagando el plato de cultivo celular con 5 mL de PBS.
- Quita todo el volumen de PBS del matraz.
- Añade 2 mL de tripsina/EDTA al plato de cultivo e incuba a 37 °C hasta que las células se desprendan. Monitoriza este proceso con un microscopio invertido.
NOTA: Golpear la placa de cultivo acelerará el desprendimiento celular. - Bloquea la actividad de tripsina añadiendo 6 mL de GM ADSC fresco.
- Reubica todo el volumen de la suspensión celular desde la placa de cultivo a un tubo adecuado para la centrifugación.
- Centrifuga las pilas a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Quita el sobrenadante.
- Suspende las células en 2 mL del GM de los ADSC recién añadidos.
- Calcula la densidad y viabilidad celular con un hemocitómetro o un contador automático de células.
NOTA: La viabilidad celular puede evaluarse mediante tinción con tinte azul tripán. - Siembra las células en el número deseado de pozos, 15.000 celdas/pozo, placa plástica de 96 pozos en 100 μL de medio de crecimiento de ADSC.
NOTA: Las células semilla siempre en duplicado para obtener adipocitos destinados al control e incubación con las condiciones de FAs. Dependiendo del tipo de experimento, los ADSC pueden sembrarse en diferentes tipos de platos o recipientes de plástico. La densidad recomendada de siembra es de 30.000 a 60.000 células porcm2. Dependiendo del número de células necesario para los análisis posteriores o experimentos posteriores, se ajusta el formato del plato de cultivo celular para placas de 6 o 12 pozos. - Cultiva las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO2.
- Cuando las células han alcanzado el 100% de confluencia (normalmente 24-48 horas después del blindaje), inducen su diferenciación en adipocitos siguiendo las instrucciones siguientes.
NOTA: Es importante alcanzar un alto nivel de confluencia celular antes de la inducción de la diferenciación. En otros casos, puede afectar la eficiencia de la diferenciación. Si para las células en placas tarda más de 48 horas en alcanzar una alta confluencia, cambia el medio cada 3-4 días para el medio de crecimiento del ADSC fresco.
2. Inducción de la diferenciación adipogénica
- Preparar medio de diferenciación (DM): Suplementar el medio DMEM/F12 con 10% FBS, 2 mM de glutamina, antibióticos - solución antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B), 5 μg/mL de insulina, 0,5 mM de 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), 5 μM de dexametasona y 200 μM de indometacina.
NOTA: Prepara DM solo en el volumen necesario para su uso directo. No lo guardes durante mucho tiempo y siempre usa DM recién preparado. Antes de su uso, calienta el DM en baño maria a 37 °C. IBMX e indometacina pueden precipitar si se añaden al medio a una temperatura inferior a 37 °C. Para solubilizarlo, calienta el líquido en un baño maria a 37 °C. - Retira y descarta asépticamente todo el volumen del medio de los ADSC confluentes.
NOTA: El medio de cultivo del ADSC debe eliminarse completamente antes de añadir DM. - Añade cuidadosamente 100 μL/pozo de DM a las células que crecen en una placa de 96 pozos.
NOTA: No dejes que las células se sequen al cambiar de medio. - Incubar las células en una incubadora a una temperatura de 37 °C, 5% de CO2 durante 7 días.
- Elimina y descarta todo el volumen de DM de los ADSC.
- Añade cuidadosamente 100 μL/pozo de DM fresco a las células que crecen en una placa de 96 pozos.
- Incubar las células en la incubadora a una temperatura de 37 °C, 5% de CO2, durante los siguientes 7 días.
NOTA: El progreso de la diferenciación adipogénica puede detectarse mediante la observación en campo claro de vacuolas lipídicas que aparecen en las células inducidas.
3. Engorse de los adipocitos
- Preparar un medio de cultivo de adipocitos suplementado con FAs: suplementar el medio DMEM/F12 con un 10% de FBS, 2 mM de glutamina, antibióticos - solución antimicótica (100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B), 0,33 mM de linoleato, 0,17 mM de palmato y 0,17 mM de oleato.
- Preparar medio de cultivo de adipocitos de control: Suplementar el medio DMEM/F12 con 10% FBS, 2 mM de glutamina, antibióticos - solución antimicótica (100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina B), albúmina sérica bovina al 0,44% y 0,26% etanol (estos dos últimos compuestos también se usaron como disolventes de FAs).
NOTA: Prepárese el control y suplemente con medios de cultivo de adipocitos FAs solo en el volumen necesario para su uso directo. No la guardes durante mucho tiempo y siempre utiliza medios recién preparados. Antes de usarlas, calienta el medio en baño maria a 37 °C. - Tras un total de 14 días de diferenciación, se elimina y descarta cuidadosamente todo el volumen del medio DM de los adipocitos diferenciados en una placa de 96 pozos.
- Añadir cuidadosamente 100 μL/pozo de medio de cultivo de adipocitos suplementado con FAs a la mitad de los pozos con células que crecen en una placa de 96 pozos.
- Añadir cuidadosamente 100 μL/pozo de medio de cultivo de adipocitos de control a la segunda mitad de los pozos, con las células creciendo en una placa de 96 pozos.
NOTA: No dejes que las células se sequen al cambiar de medio. - Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% deCO2 durante las siguientes 48 horas.
- Después de 48 horas, utiliza las células de control y las células incubadas con FAs para los experimentos posteriores.
NOTA: En esta etapa, los adipocitos engordados logrados pueden utilizarse para múltiples propósitos experimentales, como la tinción celular, el análisis del metabolismo celular o el cocultivo con otros tipos celulares.
4. Manchas de gotas lipídicas
- Preparar un medio de cultivo de adipocitos: Suplementar el medio DMEM/F12 con un 10% de FBS, 2 mM de glutamina y antibióticos - solución antimicótica (100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina B).
- Diluir el tinte fluorescente para teñir los LDs en un medio de cultivo de adipocitos en una dilución de 1:1000.
- Retirar y descartar todo el volumen del medio de cultivo de adipocitos de control y el medio de cultivo de adipocitos suplementados con FAs de células que crecen en una placa de 96 pozos.
- Añade cuidadosamente 50 μL/pozo de medio de cultivo de adipocitos con tinte fluorescente.
NOTA: No dejes que las células se sequen al cambiar de medio. - Incubar las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO2 durante 15 minutos.
- Lava el tinte de fluorescencia sustituyéndolo por el medio de cultivo de adipocitos de 100 μL/pozo.
- Adquisición de imagen en el canal de detección de fluorescencia verde (Ex 427 nm/Em 585 nm) con el microscopio fluorescente.
NOTA: Este es el protocolo para la tinción de células vivas. También se puede realizar tinción tras la fijación de formaldehído de las células.
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Resultados
El método descrito aquí permite diferenciar los ADSC humanos en adipocitos maduros, seguido de una mayor acumulación de lípidos, imitando las células hipertróficas observadas bajo condiciones de obesidad. El curso temporal de la diferenciación de los ADSC humanos se muestra en la Figura 1. En el día 0, cuando las células alcanzan una confluencia del 100% (Figura 1A), los ADSC presentan una morfología alargada y similar a un fuso...
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Discusión
El protocolo actual es un procedimiento replicable de dos pasos para la diferenciación de ADSCs, seguido de incubación con FAs para lograr un modelo celular que imita la obesidad. El paso crítico que determina su efectividad es el número de pasos de ADSC tras su aislamiento. La presencia de múltiples conductos conduce a una disminución del potencial de diferenciación de estascélulas 10.
Durante la diferenciación de adipocitos, los ADSC ...
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Divulgaciones
Los autores afirman que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Agradecimientos
El artículo fue financiado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia, con subvenciones recibidas por Dorota Nowak (OPUS 22, Nº 2021/43/B/NZ3/01458) y Aleksandra Simiczyjew (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Merck | I5879 | |
| 0,25% tripsina/0,05% EDTA pH 7,2 | IITD PAN, Wroc aw, Polonia | 20-500 | |
| Placa de 96 pozos | Termodinámica | 130188 | |
| Antibióticos-Solución antimicotica | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Contador de celdas | N/A | N/A | |
| Centrifugadora | N/A | N/A | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Eagle Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco | IITD PAN, Wrocaw, Polonia | 10-500 | que contiene 1 g/L de glucosa |
| Medio modificado Eagle de Dulbecco: Mezcla de nutrientes F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Etanol | Chempur | 113964200#1L | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | A5256701 | |
| hADSC Células Madre Humanas Derivadas del Adiposo | Lonza | PT-5006 | |
| Incubadora | N/A | N/A | |
| Indometacina | Sigma-Aldrich | I8280-5G | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Microscopio invertido | N/A | N/A | |
| L-glutamina | Sigma-Aldrich | 25030-024 | |
| Ácido linoleico sal sódica | Sigma-Aldrich | L8134 | |
| LipidSpot fluorescente | Biotium | 70065 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Termodinámica | 10010023 | |
| Soduim oleate | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| Soduim palmato | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Matraz de cultivo celular T75 | Termodinámica | 130190 | |
| Azul de tripán | Sigma-Aldrich | 95896HJ |
Referencias
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