Modelado de la resistencia a la insulina de adipocitos utilizando fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo subcutáneo de ratón

Resumen

Este estudio presenta un protocolo experimental que utiliza fracción vascular estromal derivada de tejido adiposo subcutáneo del ratón y tratada con dexametasona para simular la resistencia a la insulina. Al mantener la complejidad del tejido adiposo, ofrece una plataforma fisiológicamente auténtica para la investigación mecanicista.

Resumen

La resistencia a la insulina en el tejido adiposo es una característica central de trastornos metabólicos como la diabetes tipo 2, aunque muchos modelos in vitro dependen de líneas celulares inmortalizadas que reflejan incompletamente la complejidad celular del tejido adiposo nativo. El objetivo de este protocolo es establecer un método reproducible y experimentalmente accesible para modelar la resistencia a la insulina de adipocitos utilizando adipocitos primarios derivados de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo subcutáneo del ratón. El protocolo describe el aislamiento de células SVF mediante digestión enzimática, su diferenciación adipogénica en adipocitos maduros cargados de lípidos y la posterior inducción de la resistencia a la insulina mediante dexametasona. La resistencia a la insulina se define y valida operativamente mediante lecturas funcionales y moleculares, incluyendo la reducción de la captación y consumo de glucosa estimulada por la insulina, así como una disminución de la fosforilación de proteínas clave de señalización de insulina en la vía PI3K-AKT. Al mantener la heterogeneidad celular derivada de SVF, este enfoque proporciona un sistema basado en células primarias que apoya la investigación de la señalización de insulina en adipocitos bajo condiciones que se asemejan más a la fisiología del tejido adiposo que las líneas celulares convencionales. Este protocolo está dirigido a investigadores que buscan una plataforma estandarizada para estudiar los mecanismos de resistencia a la insulina en adipocitos o evaluar intervenciones metabólicas, reconociendo al tiempo que las lecturas reflejan respuestas de un cultivo mixto derivado de SVF en lugar de una población purificada de adipocitos.

Introducción

La diabetes mellitus tipo 2 (DT2) se ha convertido en una de las enfermedades metabólicas no transmisibles de más rápido crecimiento a nivel mundial, con un número total de pacientes que supera ahora los 537 millones y se proyecta que supere los 783 millones para 2045^. Sus características fisiopatológicas centrales se manifiestan como resistencia a la insulina (RI) en el tejido periférico, acompañada de una disfunción progresiva de las células^{β 2}. La esencia de la RI radica en los efectos biológicos significativamente disminuidos desencadenados por la insulina concentrada fisiológicamente en órganos objetivo, lo que conduce a una reducción de la absorción de glucosa, un aumento de la producción hepática de glucosa y una inhibición de la^{lipólisis 3}. El tejido adiposo es uno de los órganos objetivo más críticos de la insulina. La obesidad provoca que las células grasas se vuelvan insensibles a la insulina, reduciendo la captación de glucosa, inhibiendo la síntesis de triglicéridos, mientras que simultáneamente aumenta la lipólisis y libera más ácidos grasos libres, agravando así la resistencia sistémica a la insulina ^4,5.

En condiciones fisiológicas, la insulina activa la vía PI3K-AKT para translocar el transportador de glucosa 4 (GLUT4) a la membrana celular, promoviendo la captación de glucosa y la síntesis de triglicéridos en los adipocitos. Simultáneamente, la insulina inhibe la actividad de la lipasa triglicérida adiposa (ATGL) y la lipasa sensible a las hormonas (HSL) en la superficie de las gotas lipídicas, bloqueando así la^{lipólisis 6}. Cuando ocurre la IR, la señalización de insulina deteriorada debilita la inhibición de la lipólisis, lo que provoca una liberación masiva de ácidos grasos libres (FFA) en el torrente sanguíneo. Esto provoca una liberación masiva de FFAs en el torrente sanguíneo, causando depósito de triglicéridos ectópicos en órganos como el hígado, el músculo esquelético y el páncreas. Esto induce toxicidad en los labios e inflamación crónica, contribuyendo finalmente al inicio y progresión del^DM2 7. Por lo tanto, establecer un modelo maduro de adipocitos que reproduzca las características de la RI in vivo es crucial para esclarecer los mecanismos moleculares de la RI y desarrollar nuevas estrategias de intervención.

Actualmente, la línea celular de fibroblastos embrionarios 3T3-L1 del ratón se ha convertido en una herramienta clásica para estudios in vitro de la insulina de adipocitos debido a su corto ciclo de inducción y buena^{reproducibilidad 8,9}. Sin embargo, el origen embrionario de las células 3T3-L1, su base genética uniforme y la susceptibilidad a la deriva fenotípica tras un paso prolongado resultan en diferencias significativas en el comportamiento metabólico en comparación con los adipocitos adultos in situ, limitando su valor médico^{traslacional 10,11}. En cambio, la fracción vascular estromal (SVF) aislada del tejido adiposo subcutáneo de roedores es rica en células madre adiposas multipotentes (CEA). Los adipocitos maduros diferenciados de estos ASCs presentan características morfológicas, funcionales y transcripcionales que se asemejan más a las de los adipocitos blancos nativos que la línea celular ampliamente utilizada 3T3-L1. Esto convierte a los adipocitos derivados de SVF en un modelo complementario para estudiar la señalización y resistencia a la insulina en un contexto que se aproxima mejor a la complejidad tisular^{primaria 12}.

Este protocolo es más adecuado para investigadores que buscan estudiar la acción de la insulina en un modelo primario de adipocitos que conserva una mayor heterogeneidad tisular que las líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, los usuarios deben tener en cuenta que la SVF es una población mixta que contiene células endoteliales e inmunitarias; Por lo tanto, las lecturas reflejan el comportamiento de una cultura donde los adipocitos son un componente principal pero no exclusivo. Este modelo puede ser menos adecuado para estudios que requieran una población pura y sincronizada de adipocitos.

Este estudio propone un protocolo para construir un modelo celular resistente a la insulina utilizando adipocitos maduros derivados de SVF. El protocolo detalla todo el proceso de aislamiento, cultivo, diferenciación e inducción de la resistencia a la insulina con SVF, imitando con éxito el estado de resistencia a la insulina de los adipocitos in vivo. La evaluación del modelo se realizará en los niveles de consumo de glucosa, morfología celular y mecanismos moleculares. Esto proporciona una base técnica para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia a la insulina en adipocitos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental Animal de la Universidad Médica de Xinjiang (Aprobación Ética Nº: IAGUC-20240228-41).

1. Aislamiento SVF

1. Animales de experimento: Utiliza ratones de 4-6 semanas de edad C57BL/6J de grado SPF que pesen entre 9 y 11 g. Alojarlos a 22 ± 2 °C bajo un ciclo de 12 horas de luz a oscuridad con acceso libre a comida y agua.
2. Preparación estéril: Autoclave de todos los instrumentos y consumibles a 121 °C durante 30 minutos. Antes de experimentar, rocía la campana de flujo laminar con etanol al 75% e irradia luz ultravioleta durante ≥15 minutos. Realizar todos los procedimientos dentro de un gabinete de bioseguridad de Clase II. Lleva guantes y mascarillas estériles.
3. Extracción de tejido adiposo: Eutanasiar ratones mediante inhalación de dióxido de carbono seguida de luxación cervical. Sumergirlo inmediatamente en etanol al 75% durante 10 minutos para desinfección superficial. Con tijeras oftálmicas estériles, realiza una incisión circular a lo largo de la línea media del tórax y el abdomen. Realizar una disección roma para exponer el tejido adiposo blanco inguinal bilateral, situado en la parte interna del muslo y que se extiende hacia la región testicular en forma de V. Elimina cuidadosamente cualquier ganglio linfático visible. Recoge el tejido adiposo en PBS preenfriado y realiza tres enjuagues rápidos.
4. Digestión de colagenasa: Transfiere inmediatamente el tejido adiposo lavado a una placa de cultivo estéril y pica en fragmentos de 1-2 mm³. Añadir colágenosa tipo II al 0,2% (disuelta en PBS de Dulbecco, pH 7,4, precalentada a 37 °C) a un volumen 1,5-2 veces mayor que el del tejido. Incubar a 37 °C en un agitador de temperatura constante a 100 rpm durante 10 minutos. Invierte suavemente cada 3 minutos para evitar la sobredigestión.
5. Terminación y filtración: Al finalizar la digestión, se añade un volumen igual de medio completo precalentado (DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% penicilina-estreptomicina) a 37 °C para terminar la reacción. Pipetea suavemente 5 a 8 veces usando una punta de 1 mL. Filtrar a través de un colador celular de 70 μm para eliminar fragmentos de tejido no digerido y adipocitos maduros.
6. Centrifugación y lavado: Centrifugar el filtrado a 300 x g durante 5 minutos a 25 °C. Descarta cuidadosamente el sobrenadante que contiene adipocitos maduros. Resuspende el pellet en medio completo. Centrifugar de nuevo a 300 x g durante 5 minutos a 25 °C. Repite este paso de lavado dos veces para eliminar la colágenosa residual y los adipocitos maduros restantes.
7. Siembra y cultivo: Suspende el pellet final en 1 mL de medio completo. Semilla a una densidad de 4 muestras de grasa inguinal de ratón por cada plato de cultivo celular de 10 cm. Incubar a 37 °C con un 5% de CO₂. Realizar el primer cambio de medio tras 24 horas para eliminar las células no adherentes. Posteriormente, cambia el medio cada 48 horas. Evacua las células cuando alcancen una confluencia del 80%-90%.
   NOTA: No pasen células cuando la confluencia supera el 90%, ya que las células han alcanzado la inhibición de contacto y su capacidad proliferativa está disminuida.

2. Preparación de la solución de trabajo de colagenosa tipo II

1. Reactivos y consumibles: Obtener colagenasa tipo II (actividad ≥ 120 U/mg); BSA (≥ libre de ácidos grasos 98%); HEPES; PBS de Dulbecco (que contiene Ca²⁺ 1,8 mmol/L, Mg²⁺ 0,9 mmol/L), pH 7,2-7,4; Filtro estéril de baja unión a proteínas de 0,22 μm.
2. Preparación de solución de colagénasa tipo II al 0,2%: Peso 60 mg de polvo de colagenasa tipo II, 800 mg de BSA y 48 mg de HEPES en un tubo centrífugo de 50 mL. Diluye a 40 mL con el PBS de Dulbecco. Ajusta el pH a 7,4 ± 0,1 usando NaOH o HCl de 1 M. Esteriliza por filtración a través de un filtro de 0,22 μm. Añade 5 mL por tubo y guarda a -20 °C. Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación.
3. Induce diferenciación cuando las células alcanzan el 100% de confluencia tras el paso. El estado óptimo de diferenciación se indica por células que presentan una morfología similar a un vórtice. Utilizar la solución de inducción I durante las primeras 48 horas, luego cambiar a la solución de inducción II (Tabla 1).
4. Confirmar la diferenciación exitosa mediante los siguientes criterios: al día 4 de inducción, la tinción con rojo aceite en O muestra acumulación de gotas lipídicas en la mayoría de las células (aproximadamente el 50%), acompañada de un aumento estadísticamente significativo (p < 0,05) en la expresión de marcadores clave de adipogénesis.

3. Establecimiento del modelo de resistencia a la insulina

1. Selecciona el día 4 de diferenciación como punto de partida para inducir resistencia a la insulina. Confirma bajo el microscopio que todas las células presentan una transición morfológica de forma de huso a redonda, con el citoplasma de la mayoría de las células lleno de gotas lipídicas de alto índice de refracción.
2. Sustituye el medio por medio de inducción II que contenga 1 μmol/L de Dex y continúe el cultivo durante 48 horas (Tabla 1). Tras este procedimiento, consideremos el modelo de adipocitos resistentes a la insulina establecido. Cabe señalar que estas celdas no presentan más alteraciones morfológicas. Utiliza estas células directamente para ensayos de captación/consumo de glucosa y para la detección de proteínas de la vía de señalización de insulina.
3. Criterios para el establecimiento exitoso del modelo de resistencia a la insulina: Tras 48 horas de tratamiento con dexametasona, se confirma que la capacidad de captación de glucosa en la mayoría de las células estimuladas con insulina de 100 nM disminuye aproximadamente un 40%. Además, confirmar una reducción estadísticamente significativa (p < 0,05) en los niveles de fosforilación de proteínas clave de la vía de señalización de la insulina.
   NOTA: Este proceso requiere la adición continua de medio de mantenimiento por inducción II.

4. Detección de glucosa residual en sobrenadante de cultivo

1. Recoge los supernadantes de cultivo celular en el momento designado. Retira las pilas centrifugando a 4 °C y 300 x g durante 5 minutos.
2. Mide las concentraciones de glucosa en los sobrenacionantes utilizando el kit de ensayo de glucosa oxidasa-peroxidasa (GOD-POD). Calcula las concentraciones usando la fórmula:
   Concentración de glucosa (mmol/L) = (A_(muestra) - _{A(en blanco))} / (A_(estándar) - _{A(en blanco)}) * C_(estándar)
   Consumo de glucosa (mmol/L) = Concentración de glucosa en medio libre de células (mmol/L) - Concentración de glucosa en el sobrenadante celular (mmol/L)
   Consumo normalizado de glucosa (mmol/mg de proteína) = Consumo de glucosa cruda (mmol/L) / Concentración total de proteínas celulares (mg/L)

5. Western blot

1. Estimular las células en el momento designado con insulina de 100 nM en medio completo durante 10 minutos a 37 °C para activar la vía PI3K-AKT. Posteriormente, añade 200 μL de tampón de lisis celular a cada plato de cultivo celular de 3,5 cm. Incuba sobre hielo durante 30 minutos. Centrifugar a 13.040 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Cuantifica la concentración de proteínas utilizando la solución de trabajo BCA.
2. Carga muestras en un gel SDS-PAGE al 8%. Haz correr el gel a 80 V hasta que las muestras lleguen a la interfaz de gel de apilamiento/separación. Aumenta el voltaje a 120 V y mantenlo hasta que las bandas marcadoras estén completamente resueltas. Realizar transferencia a corriente constante de 200 mA durante 2 horas.
3. Incuba la membrana a temperatura ambiente con leche desnatada al 5% o BSA durante 2 horas para bloquear. Lava la membrana 3 veces con TBST. Posteriormente, incubar con anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Anticuerpos primarios (dilución): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-Actina: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, Phospho-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
4. Lava la membrana 3 veces con TBST. Posteriormente, incubar con anticuerpo secundario conjugado con HRP a temperatura ambiente durante 1 h. Anticuerpos secundarios (dilución): IgG-HRP anti-ratón de cabra: 1:5000, IgG-HRP anticonejo de cabra: 1:5000.
5. Detectar la señal usando quimioluminiscencia ECL. Visualiza y registra los resultados experimentales usando un sensor Western blot.
6. Analiza los valores en escala de grises de las bandas resultantes usando el software ImageJ.

6. Ensayo de tinción de captación de glucosa

1. Privar de hambre las células en los dos puntos temporales especificados por separado durante 12 horas usando RPMI 1640 que contenga un 1% de FBS para eliminar la interferencia de la glucosa basal.
2. Tras 10 minutos de estimulación con insulina de 100 nM, añade 1 mL de solución 1x 2-NBDG a cada pozo. Incubar la placa a 37 °C durante 1 hora, protegida de la luz.
3. Lava las celdas 2 o 3 veces. Añade 1 mL de solución teñidora Hoechst lista para usar a cada pozo. Incuba el plato a 37 °C en la oscuridad durante 10 minutos. Añade la solución de tinción lentamente a lo largo de la pared lateral del vaso de cultivo, evitando el contacto directo con la capa celular para evitar el desprendimiento de las células.
4. Lava las células 2-3 veces y luego añade PBS. Captura imágenes fluorescentes de las células usando un microscopio de fluorescencia invertida.
5. Realiza un análisis cuantitativo de las imágenes usando el software ImageJ. Utiliza ImageJ para separar cada canal, aislando la señal de captación de glucosa (canal verde) de la señal de fluorescencia nuclear (canal azul).
6. Convierte todas las imágenes en imágenes en escala de grises de 8 bits. Aplicar el algoritmo de umbral automático por defecto para definir regiones de señal positiva.
7. Mide la intensidad media de fluorescencia dentro de estas regiones designadas. Normaliza la señal de fluorescencia de captación de glucosa dividiendo la intensidad media de fluorescencia del canal verde por la intensidad media correspondiente del canal azul.

7. Mancha en O de rojo aceite

1. Diluye la solución de stock de aceite rojo O con agua libre de RNasa en una proporción 3:2. Filtra la solución secuencialmente a través de papel filtro y un filtro de 0,22 μm para preparar la solución de trabajo.
2. Aspira el medio de cultivo celular y lava suavemente las células dos veces con PBS. Añade un 4% de paraformaldehído a cada pozo y fija las celdas a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Añade el fijador y lava las células con agua doble destilada. Añade 1 mL de solución de trabajo de aceite rojo O a cada pozo. Incuba el plato a temperatura ambiente en la oscuridad durante 25 minutos.
4. Después de teñir, aspira la solución de tinción. Lava bien las células con agua destilada para eliminar los artefactos de fondo y manchas. Añade 1 mL de agua destilada para cubrir las celdas. Captura inmediatamente imágenes de campo claro usando un microscopio invertido.

8. NIÑO

1. Diluye la solución original de BODIPY con agua estéril a una proporción de volumen 1:200 para preparar la solución de trabajo.
2. Lava las cubiertas de la celda con PBS estéril. Añade 30 μL de solución de paraformaldehído al 4% a cada capa y fija a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Aspira el fijador y lava 3 veces con PBS. Añade 30 μL de solución de trabajo BODIPY a cada cubierta de celda. Incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos.
4. Lava las fundas 3 veces con PBS. Añade 30 μL de tinte DAPI a cada capa de cobertura. Incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos para marcar los núcleos celulares.
5. Lava las fundas tres veces más con PBS. Proceda con el montaje: Añadir 10 μL de medio de montaje anti-desvanecimiento sobre una lámina limpia de microscopio. Con pinzas, invierte suavemente el cubrimiento celular (lado celular hacia abajo) sobre el medio de montaje. Deja que el soporte se seque en la oscuridad.
6. Captura imágenes inmediatamente usando un microscopio confocal de escaneo láser.

9. Análisis estadístico

1. Cada experimento incluía tres réplicas biológicas. Analizar datos usando el software GraphPad Prism 10.0. Datos cuantitativos presentes, que cumplan los criterios de distribución normal como media ± desviación estándar (media ± SD). Para dos grupos que cumplen la normalidad y la homogeneidad de varianza, se aplica la prueba t de muestras independientes. Para varios grupos, realizar ANOVA unidireccional, p < 0,05 se considera estadísticamente significativo.

10. Seguridad y eliminación de residuos

1. Manejo de tejidos animales
   1. Realizar todos los procedimientos que involucren células primarias en un armario de bioseguridad de Clase II bajo condiciones estériles.
   2. Clasificar todos los desechos de tejido animal, órganos no utilizados y consumibles contaminados como residuos biopeligrosos. Colocar esos residuos en bolsas designadas para riesgos biológicos, procesar mediante autoclave y finalmente eliminarlos.
2. Manejo de la dexametasona
   1. Lleva guantes, mascarillas médicas y batas de laboratorio al pesar polvo de Dex. Realiza la preparación de la solución dentro de una campana extractora química.
   2. Recoge los residuos contaminados con Dex por separado y deséchalos como residuos químicos.
3. Manipulación de materiales biopeligrosos
   1. Desinfectar a fondo las superficies de trabajo y el interior de los armarios de bioseguridad con un 70% de etanol antes de que puedan comenzar los procedimientos experimentales.
   2. Asegúrate de que todos los residuos líquidos generados por el cultivo celular estén autoclavados para que no sean infecciosos antes de su eliminación.

Resultados

Las células SVF aisladas del iWAT de ratones C57BL/6J mostraron una suspensión puntuada al iniciar la siembra en placas de cultivo. Aproximadamente el 40% de las células completaron la unión primaria tras 18 horas de siembra; al quinto día tras la siembra, las células estaban completamente dispersas, con la confluencia alcanzando el 95% (Figura 1A,B). Cuando las células alcanzaban la confluencia y mostraban una disposición característica similar a un vórtice, el medio de dif...

Discusión

Investigaciones extensas indican que los modelos basados en células SVF ofrecen un valor único para simular características patológicas del tejido adiposo. Sin embargo, el largo ciclo de construcción de estos modelos, que normalmente requiere aproximadamente 14 días para el aislamiento de tejidos, el cultivo primario, la diferenciación inducida y el tratamiento con Dex, plantea desafíos para la continuidad experimental y la estabilidad del estado celular. Para abordar estos desafíos, est...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 & mu; Filtro m	Biosharp	BSF-XS-0232-01
2-NBDG	Beyotime	S0561M
3-Isobutil-1-metilxantina	Sigma	15879
4% de poliformaldehído	Biosharp	BL1278A
70 y mu; Colador de células M	Biosharp	BS-70-CS
Anti-AKT	Proteintech	10175
Anti-C/EBPα	Abclone	AB40764
Anti-FABP4	Tecnología de Señalización Celular	AÑOS 2120
Anti-pAKT (Ser473)	Proteintech	28731
Anti-PI3K	Bioss	10657R
Anti-pPI3K (p110)	Bioss	6417R
Anti-β-ACTIN	Proteintech	60008
Kit de ensayo de proteínas BCA	Thermo Fisher	23225
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
BSA	Sigma	A7030
Cortes ascendentes celulares Biosharp & nbsp;	Biosharp	BS-14-RC
Plato de cultivo celular, 100 mm x 20 mm	Corning	430167
Plato de cultivo celular, 35mm x 10mm	Corning	430165
Solución DAPI	Solarbio	28718-90-3
Dexametasona	Sigma	D2915
DMEM/F-12	Gibco	C11330500BT
Dulbecco' s PBS	Cytiva	SH30264.02
Tubo de Eppendorf	Corning	MCT-175-C
FBS	Life-iLab	AC03L0555
Microscopio de fluorescencia	Leica	DMi8
Glucosa oxidasa-peroxidasa	Nankín Jiancheng	F006-1-1
IgG-HRP anti-ratón de cabra	Beijing Zhongshan Jinqiao	ZB-2305
Cabra anti-conejo IgG-HRP	Beijing Zhongshan Jinqiao	ZB-2301
GraphPad Prism	Versión 10.0.0	/
Hepes	BioFroxx	1112GR025
Hochest	Biosharp	BL803A
ImageJ	Versión 1.54p	/
Insulina	Solarbio	18040
Microscopio confocal de barrido láser	Nikon	Ti-E
Antidesvanecimiento del medio de montaje	Solarbio	S2100
Solución de tinción de rojo óleo	Sigma	O0625-25G
Penicilina-estreptomicina	Hyclone	SV30010
Amortiguador RIPA	Thermo Fisher	89901
Rosiglitazona	Sigma	R2408
RPMI 1640	VivaCell	C3010-0500
Leche desnatada en polvo	BioFroxx	1132GR500
Búfer TBS	Solarbio	T1060
Colagenasa tipo II	Sigma	C6885